Combinando la macchiatura istochimica e l'analisi di immagine per quantificare amido nei primordi dell'ovaia del ciliegio dolce durante la dormienza invernale

Vi presentiamo una metodologia per quantificare il contenuto di amido nei primordi dell'ovaia in ciliegio dolce (Prunus avium L.) durante la dormienza invernale utilizzando un sistema di analisi di immagine combinato con tecniche istochimiche.

Questo metodo può aiutare a rispondere alle domande chiave sulla dormienza nella pianta legnosa, ad esempio perché i boccioli di fiori devono accumulare freddo durante l'inverno per fiorire correttamente. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente la quantificazione dell'amido in piccoli campioni di primordio di fiori. Questo approccio è molto utile per rilevare l'attività fisiologica del primordium del fiore durante la dormienza e può essere applicato anche ad altre specie arboree come albicocca o prugna.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sul bocciolo di fiori dormiente, può anche essere applicato ad altri processi come la fase riproduttiva dall'impollinazione all'inizio della fruttificazione. Per iniziare, raccogli cinque tiri dal campo. Quindi pesare e fissare 10 boccioli di fiori in un tubo di vetro da 10 millilitri con soluzione fissante per almeno 24 ore a quattro gradi Celsius.

Successivamente, scartare il fissatore e aggiungere abbastanza 75% di etanolo per coprire i campioni. Ottieni tre germogli di lunghezza da 15 a 30 centimetri e cinque millimetri di diametro con 10 boccioli di fiori ciascuno. Quindi posizionare i germogli sulla schiuma del fioraio imbevuta d'acqua in una camera di crescita.

Dopo 10 giorni nella camera di crescita, rimuovere i boccioli di fiori dai germogli e pesarli. Ogni settimana dall'inizio dell'autunno fino al budburst in primavera, valuta la crescita dei boccioli di fiori. Rimuovere le bilance di gemme esterne da ogni campione, quindi posizionare ogni bocciolo nel bicchiere di un orologiaio contenente il 75% di etanolo.

Utilizzare forcelle di precisione e un bisturi oftalmologico per sezionare le gemme e ottenere almeno un primordio di fiori da ogni bocciolo. Incorporare i campioni singolarmente in cera di paraffina per formare un blocco e sessmetterli su un microtomo rotante. Dopo aver sessato i campioni, applicare una goccia di iodio fresco di Lugol su una sezione.

Dopo cinque minuti, rimuovere la macchia in eccesso con carta assorbente. Quindi applicare una piccola goccia di supporti di montaggio sintetici, posizionare un piccolo vetro di copertura sul campione e premere forte. Una volta che il supporto di montaggio è asciutto, osservare la sezione macchiata al microscopio a campo luminoso.

Regolare innanzitutto il diaframma di apertura e il controllo della luminosità in base al protocollo di testo. Assicurarsi quindi che non vi siano filtri nel supporto del filtro e selezionare una condizione di campo luminoso al microscopio. Successivamente, regolare le impostazioni della fotocamera per la preparazione macchiata senza tessuto.

Fissare la luminosità al 50%Avanti attivare la funzione di sovraesposizione/sottoesposizione e regolare il tempo di esposizione al limite della sovraesposizione. Applicare la funzione di bilanciamento del bianco e la correzione dell'ombreggiatura. Misurare il livello grigio dell'immagine in bianco e nero risultante della preparazione macchiata senza tessuto.

Quindi applicare un filtro 4N, acquisire un'altra immagine in bianco e nero della preparazione e misurare il livello di grigio. Successivamente acquisire un'immagine della stessa preparazione senza luce e misurare il livello di grigio dell'immagine risultante e calibrare. Successivamente, acquisire un'immagine a colori di una sezione di esempio in formato TIFF con una risoluzione di almeno 300 dpi.

Create un'immagine binaria corrispondente all'area macchiata, quindi impostate le tre soglie di colore fino a quando l'immagine binaria non riflette esattamente i granuli di amido macchiati. Ripetere questo processo con altri preparati e tessuti per ottimizzare i livelli di rilevamento finale. Utilizzando il sistema di analisi delle immagini, misurare la somma della densità ottica di ogni pixel sotto la maschera per quantificare il contenuto di amido nel campo.

In questo protocollo, la crescita dei boccioli di fiori e lo stato di dormienza sono stati valutati misurando l'aumento del peso del germoglio dopo 10 giorni in condizioni adeguate. Durante la dormienza, non sono stati osservati cambiamenti dopo 10 giorni in condizioni adeguate. Una volta superata la dormienza, le gemme si gonfiò e scoppiò nella camera di crescita.

Il contenuto di amido nel primordio dell'ovaio è stato quantificato mediante analisi delle immagini in ogni sezione microtomata. Coerentemente, la quantità di amido all'inizio dell'inverno presentava un valore di densità ottica inferiore a 40.000 e la quantità massima raggiungeva un valore compreso tra 120.000 e 140.000 durante entrambi gli anni dello studio. Tenendo conto della dormienza, la quantità massima di amido si è verificata in concomitanza con l'adempimento agghiacciante durante entrambi gli anni.

È importante ricordare che i livelli di rilevamento utilizzati dall'analizzatore di immagini dipendono direttamente dalla calibrazione del sistema. Ciò include le condizioni di luce, l'intensità della macchia e l'ingrandimento del microscopio. Questa condizione deve essere fissata per tutti i preparati.

La combinazione di tecniche istochimiche con l'analisi dell'immagine è risultata molto utile per esaminare la riserva di carboidrati del primordium del fiore durante le diverse fasi della dormienza. Può essere applicato anche ad altre specie e tessuti. La relazione tra rilascio di dormienza e accumulo di amido nella primordia dell'ovaio svelata dall'uso di questo metodo fornisce una solida base per comprendere le basi biologiche dei requisiti di dormienza e agghiacciante.

Gli sforzi futuri devono essere focalizzati sullo studio di indicatori biologici affidabili che potrebbero facilmente indicare lo stato di dormienza dell'albero. Nel frattempo, il modello delle variazioni dell'amido lungo la dormienza può essere utilizzato per inquadrare ulteriori studi fisiologici e genetici.