Studi strutturali di macromolecole in soluzione con piccolo angolo x-ray Scattering

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biochimica come dimensioni, forma e cambiamenti conformazionali delle biomolecole e dei loro complessi. Il vantaggio principale di questa tecnica è che gli esperimenti possono essere eseguiti in condizioni tampone fisiologicamente rilevanti in un ambiente in cui le biomolecole sono stabili. SAXS è una tecnica gratuita per molti altri metodi di biologia biofisica e strutturale.

Combinare SAXS con questi metodi può aiutarci nello sviluppo di terapie basate sulla struttura. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sui complessi biomolecolari, può anche essere applicato ad altri sistemi come lo studio dei nanopartici e la somministrazione di farmaci versicoli. In generale, gli individui nuovi a questo metodo avranno difficoltà perché appare come un processo travolgente e complicato, per passare dai dati di scattering grezzi alle strutture a bassa risoluzione.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto la pipeline di analisi dei dati per ottenere modelli strutturali da dati grezzi è difficile da apprendere perché comporta l’uso di molti pacchetti diversi di software. Ci sono alcuni pacchetti software utili per l’analisi dei dati SAXS. Questi includono SCATTER, BioXTAS RAW e la suite ATSAS.

In questo video, forniremo una panoramica dei passaggi generali da adottare quando si analizzano i dati SAXS grezzi, utilizzando la suite di programmi ATSAS. Per iniziare, installare e caricare la suite di programmi ATSAS. Aprire il programma PRIMUS/Qt e passare all’opzione Apri menu.

Qui, seleziona fino a 13 file di dati di interesse. I file di dati devono essere nel formato ASCII, in cui la prima colonna è l’asse del vettore s e la seconda colonna è l’intensità. Ripetere questo passaggio solo per i dati del buffer, inserendo questi dati in un secondo menu Strumenti.

Passare quindi alla finestra Elaborazione dati e selezionare Sottrai. Ciò genererà una curva di scattering sottratta, che rappresenta solo la dispersione dalla macromolecola di interesse. Per eseguire l’analisi di Guinier, iniziare con una curva di dispersione sottratta buffer caricata in PRIMUS/Qt.

Quindi fai clic su Raggio di Gyration, che aprirà il Mago Primus Guinier. A questo punto, verrà visualizzato un grafico che mostra il registro naturale dell’intensità rispetto agli angoli di dispersione al quadrato. Per ottenere un raggio preliminare di rotazione, individuare la finestra del prompt dei comandi e utilizzare la funzione Autorg.

Dopo aver spinto Autorg, fare clic sul limite superiore verso l’alto di uno, quindi verso il basso uno per forzare il programma ad aggiornare le misurazioni statistiche. In alternativa, immettere più file contemporaneamente facendo clic sullo stesso prompt aperto e selezionando più nomi di file di dati evidenziandoli nello stesso modo descritto in precedenza. Per iniziare l’analisi di Kratky, fare clic per selezionare il nome del file di dati.

In questo modo verranno tracciati i dati nella finestra. Quindi, selezionate Plottaggio( Plot). Quindi, sotto il pulsante Trama, fai clic su Kratky Plot.

Di conseguenza, le proteine globulari mostrano un picco GALC-ean mentre le proteine dispiegate mostrerà un plateau invece di un picco e assomiglieranno a un grafico iperbolico come quello mostrato qui. Il buffer di carico ha sottratto ancora una volta i dati per ogni concentrazione in PRIMUS/Qt. E nella scheda Elaborazione fare clic su Scala e ispezionare ogni curva e il numero di scala i, che è correlato alle diluizioni effettuate dal campione originale.

Dopo l’ispezione, unire i dati facendo clic sul pulsante Unisci nella finestra Elaborazione. Per generare il plottaggio di distribuzione della distanza, caricare le curve di dati unite in PRIMUS/Qt, quindi fare clic su Distribuzione distanza nella scheda Analisi. Regolare l’intervallo di dati dei dati uniti per evitare rumori significativi all’estremità posteriore dei dati non elaborati.

Inoltre, omettete i punti dati vicino al beamstop nella regione low-q selezionando il valore dell’intervallo inferiore e aumentando il numero. Per determinare il Dmax, iniziare con un intervallo di cinque volte il raggio di rotazione ottenuto dall’analisi di Guinier. Quindi, diminuire gradualmente questo valore fino a quando il grafico di distribuzione della distanza non scende bruscamente a zero sull’asse y e non ha una lunga coda prima di avvicinarsi allo zero.

Controllare che il raggio sperimentale di rotazione rispetto al grafico di intensità, che è derivato dall’approssimazione di Guinier e dal raggio di distribuzione della distanza tra rotazione e numeri di intensità, sia simile. Qui, l’intensità della luce diffusa è mostrata tracciata contro l’angolo di dispersione, suggerendo sia la qualità delle biomolecole nidogen-1, la laminina gamma-1 e il loro complesso, sia la loro forma. La distribuzione della distanza della coppia di elettroni determinata dai dati di scattering suggerisce che le biomolecole hanno una forma allungata e il grafico di Kratky suggerisce che le proteine sono in uno stato piegato, poiché i dati tendono ad stabilizzarsi, o addirittura ad aumentare nell’intervallo q più grande e mancano di una forma curva a campana.

Inoltre i grafici di Guinier, che usano dati a basso angolo di dispersione, indicano la regione lineare per la determinazione del raggio di rotazione, che è mostrato qui per nidogen-1, gamma-1 laminina e il loro complesso. Per studiare i complessi proteina-proteina, la MONSA è stata utilizzata per ottenere la struttura a bassa risoluzione dell’intero complesso gamma-1 di laminina nidogeno-1, suggerendo che solo la regione C-terminale di entrambe le proteine partecipa alle interazioni di mediazione mentre il resto dei domini è lontano l’uno dall’altro. Non dimenticare che lavorare con la radiazione di Sincrotrone può essere estremamente pericoloso e le precauzioni e la sicurezza delineate da ogni diversa linea di fascio devono sempre essere prese durante l’esecuzione della raccolta iniziale dei dati.