Analisi dei complessi della catena respiratoria mitocondriale in cellule umane coltivate mediante elettroforesi in Gel di poliacrilammide nativo blu e Immunoblotting
12 febbraio 2019
Questo protocollo dimostra l'analisi dei complessi della catena respiratoria mitocondriale mediante elettroforesi in gel di poliacrilammide nativo blu. Qui è descritto il metodo applicato alle cellule umane coltivate.
L'elettroforesi del gel di poliacrilammide nativa blu consente l'analisi dei complessi in tatto del sistema di fosforilazione ossidativa mitocondriale. È una tecnica comoda ed economica che può essere utilizzata per sovrapporre l'assemblaggio di interi complessi del sistema di fosforilazione ossidativa mitocondriale. Per preparare i lisati mitocondriali, utilizzare prima la soluzione PBS ghiacciata per lavare delicatamente le cellule una volta.
Raschiare le cellule e pelletarle a quattro gradi Celsius a 800 G per 10 minuti. Quindi, lavare il pellet cellulare due volte con il PBS ghiacciato e la centrifuga a quattro gradi Celsius a 800 G per 10 minuti. Successivamente, aggiungere 200 microlitri di inibitore della proteasi 100x a 20 millilitri di PBS.
Sospendere di nuovo le cellule nella miscela di inibitore della proteasi PBS a una concentrazione finale di proteine di cinque milligrammi per millilitro. Per preparare 3,3 millimolare digitonina in PBS con inibitore della proteasi, sciogliere quattro milligrammi di digitonina in un millilitro di PBS a 100 gradi Celsius fino a quando non è visibile alcun precipitato. Raffreddare immediatamente sul ghiaccio e aggiungere 10 microlitri di inibitore della proteasi 100x a un millilitro della soluzione di digitonina.
Quindi, aggiungere la miscela inibitore della proteasi digitonina alle cellule alla concentrazione finale di 1,65 millimolare. Mescolare bene e incubare sul ghiaccio per cinque minuti. Quindi, aggiungere la miscela di inibitore della proteasi PBS alle cellule al volume finale di 1,5 millilitri.
Centrifuga a quattro gradi Celsius a 10.000 G per 10 minuti. Rimuovere il supernatante e sospendere di nuovo il pellet mitocondriale nel tampone mitocondriale. Preparare un millilitro di fresco 10% loreale mountased in soluzione inibitore PBS.
Aggiungere il 10% di mountased loreal ai mitocondri alla concentrazione finale dell'1%Incubare sul ghiaccio per almeno 15 minuti. Centrifuga a quattro gradi Celsius a 20.000 G per 20 minuti. Raccogliere il supernatante in un nuovo tubo e aggiungere il tampone campione.
Per preparare il gel sfumato per la pagina nativa blu, posizionare prima il produttore di sfumature su una piastra di agitazione e collegarlo con un tubo flessibile alla pompa peristaltica. Attaccare un set di infusione con un ago al tubo. Posizionare un agitatore magnetico nella camera prossimale del produttore di gradienti e lavare i tubi con acqua distillata alla velocità massima della pompa per 10 minuti.
Quindi, svuotare il tubo e il creatore di sfumature. Utilizzare una pipetta per rimuovere l'acqua distillata rimasta nel canale tra le camere del produttore del gradiente. Chiudere il canale e il tubo con la valvola.
Assemblare due lastre di vetro nel supporto e posizionarla sul supporto. Utilizzando il foro sul fondo del supporto del gel, posizionare l'ago collegato al tubo tra le piastre di vetro. Per realizzare un gel da 8,3 per 7,3 centimetri, preparare prima soluzioni di gel al 6% e al 15% e mantenerle sul ghiaccio.
Mescolarli delicatamente per evitare di fare bolle d'aria. Quindi, caricare l'estremità prossimale della camera di tubazione del miscelatore di gel gradiente con 2,6 millilitri del gel al 6% e l'estremità distale con 2,1 millilitri del gel al 15%. Quindi, accendere l'agitatore magnetico e aprire il tubo e il canale tra le camere del produttore del gradiente.
Accendere immediatamente la pompa peristaltica a cinque millilitri al minuto. Riempire le lastre di vetro e rimuovere l'ago quando non c'è gel nel tubo. Sovrapporre delicatamente il gel con acqua distillata e mantenere il gel a temperatura ambiente per almeno un'ora.
Lavare immediatamente i tubi riempiendo le camere di gradiente con acqua distillata e utilizzando la pompa peristaltica alla massima velocità. Aggiungere sei millilitri dell'acqua distillata a tre millilitri del tampone di gel 3x per creare un buffer di gel 1x. Con una carta da filtro, rimuovere delicatamente l'acqua distillata dalla superficie del gel.
Lavare la superficie del gel con il tampone di gel 1x e rimuovere delicatamente il tampone con la carta da filtro. Preparare il gel impilabile al 4% in base al manoscritto. Mescolare delicatamente per evitare di fare bolle d'aria.
Quindi, posizionare il pettine tra le lastre di vetro e versare il gel impilamento sotto il pettine. Immergere completamente il pettine. Lasciare polimerizzare il gel impilamento per almeno 30 minuti.
Quindi, rimuovere il pettine e utilizzare una pipetta per lavare i pozzi con 1x gel buffer. Per eseguire l'elettroforesi del gel nativo blu, in primo luogo, aggiungere il buffer del catodo blu alla cassetta di gel. Utilizzare una pipetta per lavare e riempire i pozzi con il tampone catodo blu.
Quindi, caricare da cinque a 30 microgrammi di campioni proteici nei pozzi. Riempire delicatamente la cassetta in gel verso l'alto con il tampone catodico blu e il serbatoio con il tampone anodo. In primo luogo, eseguire il gel a una tensione costante di 40 volt per 15 minuti.
Quindi, aumentare la tensione a 80 volt. Eseguire il gel fino a quando il colorante raggiunge 2/3 della lunghezza del gel. Sostituire il tampone del catodo blu con il tampone catodo e continuare l'elettroforesi fino a quando la parte anteriore del colorante non è scappata dal gel.
Recuperare le lastre di vetro e trasferire le proteine sulla membrana PVDF mediante gonfiore semi-secco. Utilizzare una tensione costante di 25 volt e una corrente limitata a un ampere per 30 minuti. L'assemblaggio dei complessi della catena respiratoria nelle cellule del neuroblastoma umano è stato inibito durante il trattamento con cloramfenicolo rispetto alle cellule di controllo senza trattamento.
Al contrario, i complessi codificati dai geni nucleari erano up-regulated. La degradazione dei complessi ossidativi di fosforilazione è stata osservata su più cicli di congelamento-disgelo. La qualità del gel potrebbe influire sul rilevamento dei complessi di fosforilazione ossidativa.
Inoltre, lo stripping della membrana ha abbassato il rapporto segnale-rumore. Quando si esegue la procedura, è importante ricordare di eseguire una semplice preparazione ed elettroforesi gel in condizioni di freddo per preservare i complessi OXPHOS in tatto. Seguendo la pagina nativa blu, è possibile applicare una seconda pagina SDS di dimensione per studiare le sotto-unità proteiche dei complessi di catene respiratorie.
La pagina nativa blu consente ai ricercatori di studiare l'assemblaggio di complessi e persino super-complessi del sistema di fosforilazione ossidativa.
Panoramica
Questo protocollo presenta un metodo per analizzare i complessi della catena respiratoria mitocondriale utilizzando l'elettroforesi su gel di poliacrilamide in condizioni native con colorante blu (BN-PAGE). La tecnica viene applicata a cellule umane in coltura per valutare l'assemblaggio dei complessi della fosforilazione ossidativa mitocondriale.
Componenti Chiave dello Studio
Area di Ricerca
- Biologia mitocondriale
- Fosforilazione ossidativa
- Tecniche di elettroforesi
Sfondo
- I complessi della catena respiratoria mitocondriale sono cruciali per la produzione di ATP.
- Comprendere il loro assemblaggio e funzione è fondamentale negli studi sul metabolismo cellulare.
- La PAGE in condizioni native blu è una tecnica utile per analizzare complessi proteici integri.
Metodi Utilizzati
- Elettroforesi su gel di poliacrilamide nativa blu
- Cellule di neuroblastoma umano
- Tecniche di precipitazione proteica e trasferimento su membrana
Risultati principali
- Il trattamento con cloramfenicolo ha inibito l'assemblaggio dei complessi della catena respiratoria.
- Nelle cellule trattate è stata osservata una regolazione positiva dei complessi codificati dal nucleo.
- Molti cicli di congelamento-scongelamento hanno influenzato la degradazione dei complessi della fosforilazione ossidativa.
Conclusioni
- Questo studio dimostra la fattibilità dell'elettroforesi su gel in condizioni native con colorante blu non denaturante (BN-PAGE) per l'analisi dei complessi mitocondriali.
- Evidenzia l'importanza delle condizioni sperimentali nel preservare l'integrità dei complessi OXPHOS.
Domande Frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La valutazione dell'assemblaggio e della stabilità dei complessi mitocondriali della fosforilazione ossidativa (OXPHOS) è fondamentale per la validazione degli obiettivi nella ricerca sulle malattie metaboliche e in neurofarmacologia. L'elettroforesi nativa in gel con colorante blu (BN-PAGE) consente una valutazione diretta dei complessi proteici integri, fornendo informazioni meccanicistiche sulle disfunzioni mitocondriali indotte da composti chimici o sulle risposte adattative. Questo approccio supporta la riduzione precoce dei rischi, collegando l'interazione con il bersaglio all'output funzionale dell'OXPHOS in modelli cellulari umani pertinenti alla malattia.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Verifica ipotesi terapeutiche risolvendo gli stati di assemblaggio dei complessi OXPHOS per chiarire il meccanismo d'azione.
- Valore operativo: Consente la validazione funzionale del bersaglio mediante la visualizzazione diretta dell'integrità dei complessi in condizioni di perturbazione indotta da composti o modifiche genetiche.
- Valore predittivo: Supporta la selezione del portafoglio distinguendo gli effetti sui complessi codificati dal DNA mitocondriale rispetto a quelli codificati dal genoma nucleare, fornendo indicazioni sulla fiducia nel bersaglio.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Prontezza del saggio: Prepara lisati mitocondriali standardizzati per una separazione elettroforetica riproducibile dei complessi OXPHOS.
- Output quantitativo: Genera bande dei complessi risolvibili, consentendo confronti semi-quantitativi tra diverse condizioni sperimentali.
- Utilità della piattaforma: Stabilisce un metodo scalabile e a basso costo per la valutazione routinaria dell'assemblaggio dei complessi mitocondriali all'interno di cascami di screening.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per le malattie: Si applica a cellule umane coltivate, consentendo modelli traslazionali di disturbi mitocondriali e neurotossicità.
- Continuità meccanicistica: Collega le scoperte alla validazione preclinica confermando gli effetti mediati dal bersaglio sull'assemblaggio della catena respiratoria.
- Decisioni basate sul rischio: Rileva degradazioni complesse causate da artefatti nella manipolazione dei campioni (ad esempio, cicli di congelamento-scongelamento), migliorando l'affidabilità dei dati per criteri decisionali di prosecuzione o interruzione.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
BN-PAGE si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla validazione iniziale della proteina bersaglio fino all'ottimizzazione del composto leader, in cui la valutazione del potenziale tossico mitocondriale orienta la progressione del composto.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi risolvendo l'assemblaggio dei complessi OXPHOS per chiarire gli effetti a livello di percorso dei modulatori.
- Screening: Permette preparazioni mitocondriali pronte all'uso con integrità dei complessi preservata per lo screening di composti.
- Analisi: Fornisce la separazione elettroforetica e la rivelazione mediante immunoblot dei complessi OXPHOS come lettura funzionale per l'analisi comparativa tra condizioni diverse.
- Ricerca traslazionale: Si collega a studi preclinici attraverso l'uso di cellule di origine umana, supportando un follow-up meccanicistico allineato ai biomarcatori.
- Riutilizzo aziendale: Funziona come piattaforma modulare e riutilizzabile per l'analisi dei complessi mitocondriali in diversi progetti e aree terapeutiche.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Fornisce una previsione affidabile nella validazione degli obiettivi riducendo l'ambiguità riguardo al meccanismo d'azione mitocondriale.
- Valore operativo: Offre un metodo standardizzato, economico e riproducibile per l'analisi dei complessi OXPHOS.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza del capitale consentendo un rilevamento precoce di potenziali criticità mitocondriali, riducendo il rischio di fallimento in fasi avanzate.
- Impatto sul portafoglio: Guida la priorizzazione corretta per rischio distinguendo gli effetti mitocondriali specifici dall'obiettivo da quelli fuori bersaglio o dovuti ad artefatti nella disfunzione dei complessi.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'isolamento mitocondriale e nelle tecniche elettroforetiche native.
- È subordinato all'accesso a strumentazione per gel gradienti, centrifughi a bassa temperatura e infrastrutture per immunoblotting.
- Necessita di protocolli standardizzati tra i diversi gruppi di lavoro per garantire la conservazione e la rilevazione coerente dei complessi.
- Deve tenere conto delle limitazioni nella manipolazione dei campioni, inclusa l'evitazione di cicli ripetuti di congelamento-scongelamento che degradano i complessi OXPHOS.
- Si basa sul mantenimento di condizioni fredde durante tutta la preparazione e l'elettroforesi per preservare l'integrità degli assemblaggi complessi.
