Analisi dei complessi della catena respiratoria mitocondriale in cellule umane coltivate mediante elettroforesi in Gel di poliacrilammide nativo blu e Immunoblotting

L'elettroforesi del gel di poliacrilammide nativa blu consente l'analisi dei complessi in tatto del sistema di fosforilazione ossidativa mitocondriale. È una tecnica comoda ed economica che può essere utilizzata per sovrapporre l'assemblaggio di interi complessi del sistema di fosforilazione ossidativa mitocondriale. Per preparare i lisati mitocondriali, utilizzare prima la soluzione PBS ghiacciata per lavare delicatamente le cellule una volta.

Raschiare le cellule e pelletarle a quattro gradi Celsius a 800 G per 10 minuti. Quindi, lavare il pellet cellulare due volte con il PBS ghiacciato e la centrifuga a quattro gradi Celsius a 800 G per 10 minuti. Successivamente, aggiungere 200 microlitri di inibitore della proteasi 100x a 20 millilitri di PBS.

Sospendere di nuovo le cellule nella miscela di inibitore della proteasi PBS a una concentrazione finale di proteine di cinque milligrammi per millilitro. Per preparare 3,3 millimolare digitonina in PBS con inibitore della proteasi, sciogliere quattro milligrammi di digitonina in un millilitro di PBS a 100 gradi Celsius fino a quando non è visibile alcun precipitato. Raffreddare immediatamente sul ghiaccio e aggiungere 10 microlitri di inibitore della proteasi 100x a un millilitro della soluzione di digitonina.

Quindi, aggiungere la miscela inibitore della proteasi digitonina alle cellule alla concentrazione finale di 1,65 millimolare. Mescolare bene e incubare sul ghiaccio per cinque minuti. Quindi, aggiungere la miscela di inibitore della proteasi PBS alle cellule al volume finale di 1,5 millilitri.

Centrifuga a quattro gradi Celsius a 10.000 G per 10 minuti. Rimuovere il supernatante e sospendere di nuovo il pellet mitocondriale nel tampone mitocondriale. Preparare un millilitro di fresco 10% loreale mountased in soluzione inibitore PBS.

Aggiungere il 10% di mountased loreal ai mitocondri alla concentrazione finale dell'1%Incubare sul ghiaccio per almeno 15 minuti. Centrifuga a quattro gradi Celsius a 20.000 G per 20 minuti. Raccogliere il supernatante in un nuovo tubo e aggiungere il tampone campione.

Per preparare il gel sfumato per la pagina nativa blu, posizionare prima il produttore di sfumature su una piastra di agitazione e collegarlo con un tubo flessibile alla pompa peristaltica. Attaccare un set di infusione con un ago al tubo. Posizionare un agitatore magnetico nella camera prossimale del produttore di gradienti e lavare i tubi con acqua distillata alla velocità massima della pompa per 10 minuti.

Quindi, svuotare il tubo e il creatore di sfumature. Utilizzare una pipetta per rimuovere l'acqua distillata rimasta nel canale tra le camere del produttore del gradiente. Chiudere il canale e il tubo con la valvola.

Assemblare due lastre di vetro nel supporto e posizionarla sul supporto. Utilizzando il foro sul fondo del supporto del gel, posizionare l'ago collegato al tubo tra le piastre di vetro. Per realizzare un gel da 8,3 per 7,3 centimetri, preparare prima soluzioni di gel al 6% e al 15% e mantenerle sul ghiaccio.

Mescolarli delicatamente per evitare di fare bolle d'aria. Quindi, caricare l'estremità prossimale della camera di tubazione del miscelatore di gel gradiente con 2,6 millilitri del gel al 6% e l'estremità distale con 2,1 millilitri del gel al 15%. Quindi, accendere l'agitatore magnetico e aprire il tubo e il canale tra le camere del produttore del gradiente.

Accendere immediatamente la pompa peristaltica a cinque millilitri al minuto. Riempire le lastre di vetro e rimuovere l'ago quando non c'è gel nel tubo. Sovrapporre delicatamente il gel con acqua distillata e mantenere il gel a temperatura ambiente per almeno un'ora.

Lavare immediatamente i tubi riempiendo le camere di gradiente con acqua distillata e utilizzando la pompa peristaltica alla massima velocità. Aggiungere sei millilitri dell'acqua distillata a tre millilitri del tampone di gel 3x per creare un buffer di gel 1x. Con una carta da filtro, rimuovere delicatamente l'acqua distillata dalla superficie del gel.

Lavare la superficie del gel con il tampone di gel 1x e rimuovere delicatamente il tampone con la carta da filtro. Preparare il gel impilabile al 4% in base al manoscritto. Mescolare delicatamente per evitare di fare bolle d'aria.

Quindi, posizionare il pettine tra le lastre di vetro e versare il gel impilamento sotto il pettine. Immergere completamente il pettine. Lasciare polimerizzare il gel impilamento per almeno 30 minuti.

Quindi, rimuovere il pettine e utilizzare una pipetta per lavare i pozzi con 1x gel buffer. Per eseguire l'elettroforesi del gel nativo blu, in primo luogo, aggiungere il buffer del catodo blu alla cassetta di gel. Utilizzare una pipetta per lavare e riempire i pozzi con il tampone catodo blu.

Quindi, caricare da cinque a 30 microgrammi di campioni proteici nei pozzi. Riempire delicatamente la cassetta in gel verso l'alto con il tampone catodico blu e il serbatoio con il tampone anodo. In primo luogo, eseguire il gel a una tensione costante di 40 volt per 15 minuti.

Quindi, aumentare la tensione a 80 volt. Eseguire il gel fino a quando il colorante raggiunge 2/3 della lunghezza del gel. Sostituire il tampone del catodo blu con il tampone catodo e continuare l'elettroforesi fino a quando la parte anteriore del colorante non è scappata dal gel.

Recuperare le lastre di vetro e trasferire le proteine sulla membrana PVDF mediante gonfiore semi-secco. Utilizzare una tensione costante di 25 volt e una corrente limitata a un ampere per 30 minuti. L'assemblaggio dei complessi della catena respiratoria nelle cellule del neuroblastoma umano è stato inibito durante il trattamento con cloramfenicolo rispetto alle cellule di controllo senza trattamento.

Al contrario, i complessi codificati dai geni nucleari erano up-regulated. La degradazione dei complessi ossidativi di fosforilazione è stata osservata su più cicli di congelamento-disgelo. La qualità del gel potrebbe influire sul rilevamento dei complessi di fosforilazione ossidativa.

Inoltre, lo stripping della membrana ha abbassato il rapporto segnale-rumore. Quando si esegue la procedura, è importante ricordare di eseguire una semplice preparazione ed elettroforesi gel in condizioni di freddo per preservare i complessi OXPHOS in tatto. Seguendo la pagina nativa blu, è possibile applicare una seconda pagina SDS di dimensione per studiare le sotto-unità proteiche dei complessi di catene respiratorie.

La pagina nativa blu consente ai ricercatori di studiare l'assemblaggio di complessi e persino super-complessi del sistema di fosforilazione ossidativa.