Analisi dell'espressione e dell'assemblaggio dei complessi delle proteine della catena respiratoria mitocondriale nel lievito a fissione Schizosaccharomyces pombe

Lo scopo della nostra ricerca è la traduzione delle proteine mitocondriali e cerchiamo di chiarire i meccanismi che influenzano la traduzione e l'assemblaggio del complesso della catena respiratoria mitocondriale. La nostra ricerca ha scoperto che shy1 svolge un ruolo nella sostenibilità della funzione regolare dei mitocondri partecipando all'assemblaggio di quattro infusioni complesse. Il nostro laboratorio studierà il meccanismo dell'infusione di M=metotrexato.

[Narratore] Per iniziare, misurare il peso umido di un pellet cellulare di Schizosaccharomyces pombe. Risospendere le cellule in otto millilitri di tampone S. Aggiungere il ditiotreitolo a una concentrazione finale di 10 millimolari e il fluoruro di fenilmetilsulfonile a un millimolare, assicurandosi che entrambi i reagenti siano preparati al momento. Aggiungere enzimi litici alla sospensione cellulare per digerire la parete cellulare di Schizosaccharomyces pombe. Ruotare il tubo su uno shaker a 30 gradi Celsius per la durata consigliata per l'enzima litico specifico. Utilizzare un microscopio per osservare la formazione degli sferoplasti. Quindi centrifugare il campione per 10 minuti a 1.000 G, a 4 gradi Celsius per pellettare gli sferoplasti. Risospendere il pellet in otto millilitri di tampone S ghiacciato. Dopo due lavaggi, risospendere gli sferoplasti in otto millilitri di tampone di omogeneizzazione ghiacciato contenente inibitori della proteasi. Trasferire il composto in un omogeneizzatore di vetro pre-raffreddato contenente un pestello e una provetta. Omogeneizzare meccanicamente le cellule eseguendo circa 15 colpi su e giù con il pestello ben aderente. Quindi esaminare gli sferoplasti al microscopio per verificare la rottura della membrana. Trasferire ora la sospensione omogeneizzata nelle provette da centrifuga. Centrifugare per cinque minuti a 1.000 G a 4 gradi Celsius per pellettare celle e detriti integri. Centrifugare il surnatante risultante per cinque minuti a 3.000 G a 4 gradi Celsius per pellettare i nuclei. Quindi trasferire il surnatante in provette da centrifuga fresche. Centrifugare a 12.000 g per 15 minuti a 4 gradi Celsius per pellettare i mitocondri e altri organelli, risospendere il pellet in un millilitro di tampone per mop EDTA al sorbitolo ghiacciato dopo aver travasato il surnatante. Quindi centrifugare nuovamente per 15 minuti a 12.000 G a 4 gradi Celsius per lavare i mitocondri. Risospendere il pellet finale in un millilitro di tampone per mop EDTA al sorbitolo ghiacciato. Quindi aliquotare i mitocondri purificati in tubi di conservazione per esperimenti futuri. Alla pagina SDS tampone di caricamento in 40 microlitri di proteina totale mitocondriale. Denaturare le proteine incubando la miscela per il tempo indicato alla temperatura appropriata. Caricare circa 20 microgrammi o quattro microlitri di proteine mitocondriali in un gel SDS al 12% prima dell'immunoblotting. Per preparare il campione per la pagina BN, prima mitocondri in pellet da aliquote precedenti mediante centrifugazione. Risospendere i mitocondri in 200 microlitri di tampone gel da tre pagine XBN. Quindi, pipettare due microlitri di fluoruro di fenilmetilsulfonile 100 X e un microlitro di cloruro di magnesio molare. Centrifugare nuovamente per 15 minuti a 12.000 g a 4 gradi Celsius. Risospendere il pellet di mitocondri in 160 microlitri di 5% peso in volume digitorum. Incubare su ghiaccio per 30 minuti, mescolando delicatamente ogni 10 minuti. Centrifugare la sospensione per cinque minuti a 20.000 g a 4 gradi Celsius. Quindi trasferire il surnatante in un tubo nuovo. Aggiungere 80 microlitri di tampone campione per tre pagine XBN al campione trattato con digitorum. O 32 microlitri al campione trattato DDM. Assemblare ora i gel Bis-Tris nativi prefabbricati con una pendenza dal 3 al 12%. Caricare i campioni proteici trattati insieme ai marcatori proteici ad alto peso molecolare per l'elettroforesi nativa su gel di poliacrilammide. Far funzionare il gel a una tensione costante di 80 volt e una corrente di sei milliampere per 30 minuti utilizzando un tampone catodico contenente lo 0,02% di Kumasi G250. Sostituire il tampone con un tampone catodico senza Kumasi e continuare a funzionare a 10 milliampere per tre ore fino a quando il fronte del colorante raggiunge il fondo del gel. Taglia la corsia del gel contenente il marcatore proteico. Colorare il pennarello con il tampone Kumasi R250 per 15 minuti. Quindi decolorare fino a quando le bande diventano visibili. Immergere la parte rimanente del gel nel tampone di trasferimento pagina BN per 30 minuti per equilibrare. Sciacquare la membrana in PVDF da 0,45 micrometri con metanolo ed equilibrare nel tampone di trasferimento per 10 minuti. Trasferire le proteine dal gel sulla membrana in PVDF utilizzando una corrente costante di 300 milliampere per due ore. Sciacquare la membrana PVDF con metanolo per rimuovere il colorante Kumasi. Quindi incubare la membrana in un tampone bloccante TBS contenente il 5% di latte scremato per un'ora a 25 gradi Celsius. Incubare la membrana in PVDF con gli anticorpi primari specificati contro i complessi della catena respiratoria mitocondriale di Schizosaccharomyces pombe. Dopo un'incubazione notturna a quattro gradi Celsius, lavare la membrana utilizzando il tampone TBST. Quindi incubare la membrana nell'anticorpo secondario a una diluizione da uno a 10.000 per un'ora a 25 gradi Celsius. Dopo aver lavato la membrana con il tampone TBST, esporre e scansionare la membrana in PVDF per visualizzare i risultati dell'immuno blot. La delezione del gene shy1 ha portato ad una marcata riduzione dei livelli allo stato stazionario delle proteine della catena respiratoria codificate dal DNA mitocondriale, Cob1, Cox1, Cox2, Cox3 e Atp6. L'analisi della pagina nativa blu ha mostrato che l'abbondanza dei super complessi 3242 e 324 della catena respiratoria solubilizzata DG era ridotta nelle cellule Delta shy1. Mentre i livelli dei super complessi 32.= e 55N sono rimasti inalterati. Il livello del complesso diametrale 3 solubilizzato DDM è rimasto invariato nel ceppo Delta shy1.