Name: Visualizzazione delle dinamiche del recettore a cellule T di superficie in modo quad-dimensionale utilizzando la microscopia A fogli di luce a reticolo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-30T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Impara a visualizzare le dinamiche del recettore a cellule T in quattro dimensioni utilizzando la microscopia a fogli di luce a reticolo su cellule CD4+ vive. Questo metodo consente il tracciamento in tempo reale con alta risoluzione spaziotemporale.

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Vorremmo riconoscere i consigli e la guida del Dr. Vytas Bindokas presso l'Università di Chicago. Ringraziamo l'Integrated Light Microscopy Core Facility dell'Università di Chicago per aver sostenuto e mantenuto il microscopio a fogli luminosi a reticolo. Questo lavoro è stato sostenuto dal NIH New Innovator Award 1DP2AI144245 e dal NSF Career Award 1653782 (A J.H.). J.R. è supportato dal NSF Graduate Research Fellowships Program.

5C. C7-transgenico TOpo rag2 knockout in B10. Uno sfondo è stato utilizzato in questo studio secondo un protocollo approvato dal Institutional Animal Care and Use Committee dell'Università di Chicago.
1. Raccogliere e attivare le cellule T
NOTA: questa parte del protocollo si basa su protocolli precedenti. Vedere citazioni per ulteriori dettagli20,21.
<ol><li>Eutanasia un 5C di 10-12 settimane. C7 topo transgenico di entrambi i sessi (20-25 g) secondo il protocollo Approvato IACUC (cioè la camera CO2 seguita dalla lussazione cervicale).</li>
	<li>Spruzzare accuratamente la carcassa per mouse con 70% di etanolo per immergere la pelliccia e portare in un armadietto di sicurezza BSL-2.</li>
	<li>Girare il mouse sul suo lato destro e fare una piccola incisione nella cavità del corpo con forbici chirurgiche. Rimuovere la milza con le pinze chirurgiche. Tagliare il tessuto connettivo in base alle esigenze con le forbici chirurgiche.</li>
	<li>Mettere la milza in un colino a rete di 70 m e schiacciare con la parte posteriore di uno stantuffo di siringa da 1 mL. Lavare accuratamente attraverso il colino con RPMI completo (RPMI con 10% siero bovino fetale [FBS], 2 mM L-glutamina, 1% penicillina/streptomicina, 50M 2-mercaptoetanolo).</li>
	<li>Centrifugare la sospensione a singola cellula di splenociti a 300 x g per 5 min. NOTA: il pellet a questo punto sarà rosso.</li>
	<li>Risospendere la splenocites nel buffer di lisi RBC da 5 mL. Incubare per 5 min, quindi quench con 5 mL di RPMI completo.</li>
	<li>Centrifugare la sospensione a singola cellula di splenociti a 300 x g per 5 min. NOTA: Il pellet a questo punto deve essere bianco, non rosso.</li>
	<li>Risospendere il pellet in 5 mL di RPMI completo.</li>
	<li>Trasferire su un pallone T-25 e aggiungere 10 m di falena citocromatica-C (MCC, sequenza ANERADLIAYLKQATK). Mettere le cellule in un'incubatrice a coltura cellulare a 37 gradi centigradi, 5% CO2 durante la notte.</li>
	<li>Il giorno successivo, aggiungere il mouse ricombinante IL-2 ad una concentrazione finale di 100 U/mL.</li>
	<li>Osservare per i giorni successivi, aggiungendo supporti freschi come il supporto corrente diventa giallo. Le cellule T moriranno se lasciate in modalità mediagista incustodita per oltre 48 h. Le cellule sono pronte per essere utilizzate 6-10 giorni dopo il raccolto.</li>
</ol>2. Preparare le cellule
<ol><li>Incubare cerchi rotondi rotondi da 5 mm con 0,1% poli-L-lisina per 10 min. Aspirate off e lasciare asciugare naturalmente.</li>
	<li>Utilizzare un reagente a gradiente di densità (vedere la tabella dei materiali) per separare le cellule morte e ottenere 1 x 106 cellule T e 1 x 106 APC (cellule CH2721,22 trasdotte con citosolico mCherry) separatamente. NOTA: le celle vengono conteggiate utilizzando un emocitometro.<ol>
<li>Aggiungere 3 mL di reagente a gradiente di densità a un tubo conico da 15 mL e aggiungere le celle dropwise al bordo del tubo con attenzione. Non mescolare. Centrifuga a 930 x g per 10 min a 4 gradi centigradi; utilizzare l'accelerazione/decelerazione: SLOW/SLOW. Rimuovere attentamente il sottile strato intermedio di celle tra il supporto completo e il gradiente di densità, mettendo ogni tipo di cellula in tubi conici separati. NOTA: È necessario preparare più cellule del necessario per l'imaging, poiché troviamo che il 50% è perso in media durante il processo. Più cellule vengono utilizzate per il processo, più facile è raccoglierle dal gradiente di densità. Usiamo 4-8 mL di entrambi i tipi di cellule per garantire cellule in eccesso. Se lo si desidera, le celle possono essere conteggiate prima di questo passaggio per garantire il volume necessario. Eventuali cellule aggiuntive vengono reinserite nei rispettivi flaconi.</li>
		<li>Lavare entrambi i tubi di cellule T e ch27 cellule tre volte con 5 mL completa RPMI (300 x g per 5 min). Scartare il supernatante ogni volta durante il lavaggio. Risospendere ogni tubo in RPMI completo di 1 mL e contare le cellule di un emocitometro.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Risospendere 1 x 106 APC in 500 - L completa RPMI e aggiungere 10 M MCC. Incubare per 3 h a 37 , 5% CO2. Lavare le cellule tre volte con 500 RPMI completi (300 x g per 5 min). Scartate i superalatari.</li>
	<li>Risospendere 1 x 106 cellule T in 500 RPMI completi. Aggiungere 2 g di Fab (clone H57) con etichetta anti-TCR- Alexa488 a 500 -L di cellule. Incubare per 30 min a 37 , 5% CO2. Lavare le cellule tre volte con 500 - L di RPMI completo (300 x g per 5 min). Scartare supernatante dopo ogni lavaggio. NOTA: L'anticorpo anti-TCR divalente è stato tagliato in Fab monovalente utilizzando un kit di preparazione Fab (vedi la tabella dei materiali) per evitare di collegare i recettori delle cellule T dall'anticorpo divalente (questo passaggio è facoltativo).</li>
	<li>Risogli entrambi i tipi di cellule in 500 litri di mezzi di imaging (mezzo L-15 di Leibovitz privo di rosso fenolo con 10% FBS, 1% penicillina/streptomicina, 2 mM L-glutamine).</li>
</ol>3. Condurre l'allineamento giornaliero DI LLSM
NOTA: (Importante) Questo protocollo di allineamento si basa sullo strumento LLSM utilizzato (vedere la Tabella dei materiali). Ogni LLSM può essere diverso e richiedono diverse strategie di allineamento, in particolare quelle che sono costruite in casa. Eseguire l'allineamento di routine appropriato e continuare fino alla sezione 4.
<ol><li>Aggiungere 10 mL di acqua più 30 fluoresceina (1 stock di mg/mL) al bagno LLSM (volume di 10 mL), premere Immagine (Home) per spostare l'obiettivo nella posizione dell'immagine e osservare un singolo modello di fascio laser di Bessel. Allineare il raggio laser utilizzando le guide e la regione di interesse (ROI) preimpostata per rendere il fascio un modello sottile bilanciato in tutte le direzioni.<ol>
<li>Il fascio dovrebbe anche apparire focalizzato nella fotocamera finder. Utilizzare due regolatori di inclinazione dello specchio, micrometro superiore, messa a fuoco e collare obiettivo di emissione per regolare. Vedere la figura 2A,B per la trave correttamente allineata.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lavare il bagno e gli obiettivi con almeno 200 mL di acqua per rimuovere completamente la fluoresceina.</li>
	<li>Immagine standard perline fluorescenti nel supporto di imaging (preparate aderenti a un coperchio di 5 mm con poli-L-lysina, vedi la Tabella dei Materiali; questo può essere pre-preparato e riutilizzato) per la funzione di diffusione del punto fisico (PSF) nei supporti di imaging. NOTA: Ci può essere solo un tallone in vista per l'elaborazione successiva, in modo da cercare di trovare un tallone che è da solo nel visore o può essere facilmente ritagliato per ottenere un singolo tallone.<ol>
<li>Attivare il dither impostando su 3 nella casella 'Gamma X Galvo'. Premere Live per visualizzare il campo corrente. Spostarsi lungo la direzione di z per trovare la ricevuta di copertura e perline. Trovare il centro di un tallone muovendosi lungo il tasto , premere Stop per mettere in pausa il laser. Controllare 3D, premere Centro e quindi Premere Esegui. In questo modo i dati verranno raccolti.</li>
		<li>Regolare manualmente lo specchio di inclinazione, il collare obiettivo e il micrometro di messa a fuoco per ottenere i valori di grigio più elevati, quindi regolare in base alle esigenze per ottenere modelli appropriati per la scansione oggettiva, z galvo, z-obiettivo (totPSF) e le modalità di scansione campione (samplePSF). Vedere la figura 2C-F per le proiezioni di intensità massima (MIP) regolate correttamente. NOTA: le varie modalità di acquisizione (scansione obiettiva, z galvo, z-obiettivo e scansione campione) modificano il modo in cui il foglio luminoso si sposta attraverso il campione. Tutte le modalità di scansione devono essere utilizzate per l'allineamento.</li>
		<li>L'analisi di esempio mostra come verranno raccolti i dati durante l'esperimento. Raccogliere il PSF di esempio premendo Esegui in modalità di scansione di esempio per la messa in scrivania e la deconvoluzione (vedere la sezione 5). Cambia laser in modalità a tre colori (488, 560, 647) e premi di nuovo Esegui. NOTA: Dal momento che le immagini LLSM ad angolo (57,2 gradi), le immagini catturate in modalità "scansione del campione" vengono raccolte a questo angolo e sono quindi "inclinate". L'inclinazione è il processo di correzione di questo angolo e "riallineamento" dell'immagine in un vero e proprio z-stack. Questi dati devono essere raccolti nei supporti di imaging e in tutti i canali che verranno immagini durante l'esperimento. Se questo non viene raccolto correttamente, i dati non saranno correttamente disfaldati. Allo stesso modo, assicurarsi che i supporti siano stati riscaldati a 37 gradi centigradi (o temperatura sperimentale desiderata).</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Impostazione delle celle con LLSM
<ol><li>Aggiungere 100.000 APC (50 gradi centigradi) dal passo 2.5 a una vetritta circolare di 5 mm di diametro dal punto 2.1 e lasciare che si accontentino di 10 min.</li>
	<li>Ungere il supporto del campione, quindi aggiungervi il lato cella del coperchio. Aggiungere una goccia di supporto di imaging sul retro del coperchio per evitare bolle prima di essere inserita nella vasca da bagno. Avvitare il supporto del campione sul piezo e premere Immagine (Home).</li>
	<li>Trovare un APC per l'immagine per assicurarsi che il LLSM e il software di imaging (vedere Tabella dei materiali) funzionino correttamente. NOTA: L'immagine è pari a 0,4 m con una dimensione di 60 z e 10 ms per due colori con dither impostato su 3, che genera 1,54 s per fotogramma di immagine 3D con una risoluzione di 200 nm XY e 400 nm. Queste impostazioni potrebbero dover essere regolate in base alle dimensioni della cella, alla risoluzione z desiderata e alla potenza del segnale dalla tecnica di etichettatura fluorescente utilizzata. L'utilizzo della potenza laser varia anche in base alla tecnica di etichettatura fluorescente utilizzata.<ol>
<li>Premere Live per visualizzare l'immagine corrente. Spostarsi lungo il coperchio per trovare lo slittamento di copertura e le celle.</li>
		<li>Trova il centro di un APC muovendoti nella direzione z, quindi premi Stop per mettere in pausa il laser. Controllare il 3D e immettere le impostazioni desiderate (vedere il passaggio 4.3.1), premere Center e quindi premere Esegui. In questo modo i dati verranno raccolti.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Abbassare lo stage per caricare la posizione e aggiungere 50 celle T in supporti di imaging (100.000 celle, dal punto 2.5) gocciolante direttamente sopra il coperchio. E 'meglio lasciare una forma di goccia all'estremità della punta pipetta e poi toccare la punta al liquido bagno. Alzare il livello facendo clic su "Immagine (ritorno)".</li>
	<li>Iniziare l'imaging. Assicurarsi di impostare la dimensione dello stack e la lunghezza della scadenza del tempo desiderata. Ad esempio, l'immagine 60 z-stacks a una dimensione di passo 0,4 m e l'input di 500 intervalli di tempo. (in genere) interrompere la registrazione prima che vengano raggiunti 500 fotogrammi per evitare il fotosbiancamento. Utilizzare la modalità Live per cercare le coppie di celle e, una volta immesse le impostazioni pronte e desiderate, premere Esegui per raccogliere i dati. Vedere il film a clamore 1 e la figura 1 per un esempio.</li>
</ol>5. Tracciare le dinamiche di superficie
<ol><li>Esportare i dati dal software di imaging (vedere la Tabella dei materiali). Questo creerà file TIF z-stack per ogni punto temporale in ogni colore.</li>
	<li>Prima deskew e deconvolve i dati. NOTA: utilizziamo la pipeline LLSpy su licenza del Janelia Research Campus18 diHHMI, ma la messa a punto e la deconvoluzione sono disponibili anche all'interno di più software di imaging (vedere Tabella dei materiali).</li>
	<li>Debleach i dati. NOTA: Usiamo la funzione debleach delle Fiji con la corrispondenza dell'istogramma (Percorso fiji: Immagine Proprietà Adjust (Regolare) Correzione della Candeggina Istogrammi corrispondenti OK).</li>
	<li>Importare nel software di tracciamento (vedere la Tabella dei materiali). Tenere traccia dei cluster in base alle specifiche del software. Vedere Filmato 2 per un esempio. NOTA: i risultati del monitoraggio dipendono dal software di tracciamento utilizzato, dall'algoritmo scelto, dai parametri di output desiderati selezionati, ecc. Ad esempio, nel software di tracciamento che abbiamo utilizzato (vedi la Tabella dei Materiali),abbiamo scelto di consentire al software di tracciare forme irregolari, piuttosto che assegnare a ogni funzione un unico punto, poiché i cluster TCR non sono organizzati in sfere perfette. Inoltre, abbiamo scelto di raccogliere 35 parametri, tra cui velocità, direzione, volume, intensità, area, posizione e informazioni sulla durata della traccia. Tuttavia, diversi metodi o parametri saranno utili per rispondere a diverse domande.<ol>
<li>Se il monitoraggio non è desiderato, utilizzare il plug-in ClearVolume per Fiji per visualizzare e creare filmati da dati hyperstack.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Poulter, N. S., Pitkeathly, W. T. E., Smith, P. J., Rappoport, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Physical+Basis+of+Total+Internal+Reflection+Fluorescence+%28TIRF%29+Microscopy+and+Its+Cellular+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The Physical Basis of Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy and Its Cellular Applications.</a> Methods in Molecular Biology. 1251, Clifton, N.J. 1-23 (2015).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il protocollo presentato è stato ottimizzato per l'utilizzo di cellule CD4- T isolate da 5C. I topi transgenici C7 sullo strumento LLSM utilizzati, e quindi altri sistemi cellulari e LLSM potrebbero dover essere ottimizzati in modo diverso. Tuttavia, questo protocollo mostra la potenza dell'imaging 4D, in quanto può essere utilizzato per quantificare la dinamica di un recettore superficiale su un'intera cellula con la minima distorsione in condizioni fisiologiche. Pertanto, ci sono molte possibili applicazioni...

La dinamica precisa del traffico e della diffazione delle molecole sulla superficie cellulare tridimensionale in tempo reale è stata un enigma da risolvere. La microscopia è sempre stata un equilibrio di velocità, sensibilità e risoluzione; se uno o due sono ingranditi, il terzo viene ridotto a icona. Pertanto, a causa delle piccole dimensioni e dell'immensa velocità con cui i recettori di superficie si muovono, il monitoraggio delle loro dinamiche è rimasto una grande sfida tecnologica per il campo della biologia cellulare. Ad esempio, molti studi sono stati condotti utilizzando la microscopia a fluorescenza interna totale (TIRF)1,2,3, che ha un'alta risoluzione temporale, ma può solo immaginare una fetta molto sottile della membrana a T-cell (100 nm), e quindi manca eventi che accadono più lontano nella cella. Queste immagini TIRF mostrano anche solo una sezione bidimensionale della cella. Al contrario, le tecniche di super-risoluzione, come la microscopia stocastica della ricostruzione ottica (STORM)4, la microscopia di localizzazione fotoattivata (PALM)5e la microscopia stimolata all'esaurimento delle emissioni (STED)6,possono superare il limite di diffrazione di Abbe della luce. Queste tecniche hanno un'elevata risoluzione spaziale (risoluzione di 20 nm)4,5,6,7, ma spesso richiedono molti minuti per acquisire un'immagine bidimensionale (2D) o tridimensionale (3D) completa e pertanto la risoluzione temporale viene persa. Inoltre, tecniche come STORM e PALM che si basano su segnali lampeggianti possono avere imprecisioni nel conteggio8,9. La microscopia elettronica ha di gran lunga la risoluzione più alta (fino a risoluzione fino alle 17)10; può anche essere condotta tridimensionalmente con la microscopia elettronica a scansione del fascio ionico focalizzato (FIB-SEM), con conseguente fino a 3 nm XY e 500 nm - risoluzione11. Tuttavia, qualsiasi forma di microscopia elettronica richiede una dura preparazione dei campioni e può essere condotta solo con cellule o tessuti fissi, eliminando la possibilità di imaging di campioni vivi nel tempo.
Le tecniche per ottenere l'alta risoluzione spatiotemporale necessaria per identificare la dinamica delle molecole superficiali e intracellulari nelle cellule vive nella loro vera natura 3D fisiologica sono state sviluppate solo di recente. Una di queste tecniche è Lattice Light-Sheet Microscopy (LLSM)12, che utilizza un foglio luminoso strutturato per ridurre drasticamente il fotobleaching. Sviluppato nel 2014 dal premio Nobel Eric Betzig, l'alta risoluzione assiale, il basso fotosbiancamento e il rumore di fondo, e la capacità di visualizzare contemporaneamente centinaia di piani per campo visivo rendono i microscopi LLS superiori ai microscopi widefield, TIRF e confocal e confocal e confocal12,13,14,15,16,17,18. Questa tecnica di imaging quadridimensionale (x, y, z e time), mentre ancora la diffrazione limitata (risoluzione XYz da 200 nm) ha un'incredibile risoluzione temporale (abbiamo raggiunto una frequenza fotogrammi di circa 100 fps, con un'immagine cellulare ricostruita 3D con 0,85 secondi per fotogramma) per l'acquisizione spaziale 3D.
Il LLSM può essere generalmente utilizzato per monitorare la dinamica in tempo reale di qualsiasi molecola all'interno di qualsiasi cellula a livello di singola molecola e singola cellula, in particolare quelle nelle cellule altamente motili come le cellule immunitarie. Ad esempio, qui mostriamo come utilizzare LLSM per visualizzare le dinamiche del recettore delle cellule T (TCR). Le cellule T sono le cellule efsiate del sistema immunitario adattivo. I TCR sono responsabili del riconoscimento dei ligandi peptide-MHC (pMHC) visualizzati sulla superficie delle cellule che presentano l'antigene (APC), che determina la selezione, lo sviluppo, la differenziazione, il destino e la funzione di una cellula T. Questo riconoscimento si verifica nell'interfaccia tra le cellule T e gli APC, con conseguente clustering del recettore localizzato per formare quella che viene chiamata sinapsi immunologica. Mentre è noto che i TCR nella sinapsi immunologica sono imperativi per la funzione dell'effettore delle cellule T, ancora sconosciuti sono i meccanismi sottostanti del traffico di TCR in tempo reale verso la sinapsi. LLSM ci ha permesso di visualizzare in tempo reale le dinamiche dei TCR prima e dopo il traffico verso la sinapsi con la conseguente interazione pMHC-TCR (Figura 1). Il LLSM può quindi essere utilizzato per risolvere le attuali questioni delle dinamiche formative delle TCR e fornire informazioni per capire come una cellula distingue tra antigeni auto ed estranei.

<table><tbody><tr><td>Siringa da 1 mL</td><td>BD</td><td>309659</td><td>Per la raccolta di cellule T</td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148-25ML</td><td>Per la coltura di cellule T</td></tr><tr><td>Vetrini coprioggetto rotondi da 5 mm World</td><td>Precision Instruments</td><td>502040</td><td>Per l'imaging</td></tr><tr><td>Filtro cellulare sterile da 70 um</td><td>Corning</td><td>7201431</td><td>Per la raccolta di cellule T</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anti-topo TCR e beta; anticorpo a catena</td><td>BioLegend</td><td>109215 per l'imaging</td><td></td></tr><tr><td>del siero fetale bovino (FBS)</td><td>X& Coltura cellulare Y</td><td>FBS-500</td><td>Per la coltura di cellule T</td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td>Reagente a gradiente Denisty per la raccolta di cellule T</td></tr><tr><td>Sale sodico di fluoresceina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6377</td><td>Per l'allineamento al microscopio</td></tr><tr><td>FluoSpheres Microsfere modificate con carbossilato</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F8810</td><td>Per l'allineamento al microscopio</td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td> N<td>/A</td><td>Software di tracciamento; Altre opzioni per il software di tracciamento includono Amira o Trackmate (Fiji).</td></tr><tr><td>Microscopio a foglio luminoso a reticolo</td><td>3i</td><td>N/A</td><td>Microscopio utilizzato</td></tr><tr><td>Leibovitz's L-15 Medium, senza rosso fenolo</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21083027</td><td>per l'imaging</td></tr><tr><td>L-glutammina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030-081</td><td>per coltura di cellule T</td></tr><tr><td>LLSpy</td><td>Janelia Research Campus</td><td>N/A</td><td>LLSpy è stato utilizzato su licenza dell'Howard Hughes Medical Institute, Janelia Research Campus. Contatta innovation@janelia.hhmi.org per l'accesso. Altri metodi di deconvoluzione e deksewing sono disponibili in software di elaborazione delle immagini come Fiji, Slidebook, Amira e altri. <a href="https://llspy.readthedocs.io/en/latest/" target="_blank">https://llspy.readthedocs.io/en/latest/</a></td></tr><tr><td>Moth Cytochrome C (MCC), sequenza ANERADLIAYLKQATK</td><td>Elimbio</td><td>Sintesi personalizzata</td><td>per la raccolta di cellule T</td></tr><tr><td>Penacillina/Streptamicina</td><td>Life Technologies</td><td>15140122_3683884612</td><td>Per la coltura di cellule T</td></tr><tr><td>Poli-L-lisina</td><td>Phenix Research Products</td><td>P8920-100ML</td><td>Per l'imaging</td></tr><tr><td>Tampone di lisi dei globuli rossi</td><td>eBioscience</td><td>00-4300-54</td><td>Per la raccolta di cellule T</td></tr><tr><td>Topo ricombinante IL-2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0523</td><td>Per la coltura di cellule T</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium</td><td>Corning</td><td>MT10040CV</td><td>Per la coltura di cellule T</td></tr><tr><td>Slidebook</td><td>3i</td><td>N/A</td><td>LLSM software di imaging</td></tr><tr><td>Strumenti</td> <td>di dissezione chirurgicaNova-Tech International</td><td>DSET10</td><td>Per la raccolta di cellule T</td></tr><tr><td>Fiasche T-25</td><td>Eppendorf</td><td>2231710126</td><td>Per la coltura di cellule T</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Pierce Fab Micro Kit di preparazione</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>44685</td><td>Per la preparazione di Fab</td></tr></tbody></table>

visualizzazione delle dinamiche del recettore a cellule t di superficie in modo quad-dimensionale utilizzando la microscopia a fogli di luce a reticolo

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

La segnalazione e la funzione di una cellula sono dettate dalle strutture dinamiche e dalle interazioni dei suoi recettori superficiali. Per comprendere veramente la relazione struttura-funzione di questi recettori in situ, dobbiamo visualizzarli e tracciarli sulla superficie della cellula viva con una risoluzione spatiotemporale sufficiente. Qui mostriamo come utilizzare la microscopia Lattice Light-Sheet (LLSM) recentemente sviluppata per immagini di recettori delle cellule T (TCR) in quarta dimensione (4D, spazio e tempo) alla membrana cellulare attiva. Le cellule T sono una delle principali cellule efcomeotrici del sistema immunitario adattivo, e qui abbiamo usato le cellule T come esempio per dimostrare che la segnalazione e la funzione di queste cellule sono guidate dalle dinamiche e dalle interazioni dei TCR. LLSM consente l'imaging 4D con una risoluzione spatiotemporale senza precedenti. Questa tecnica di microscopia può quindi essere generalmente applicata a una vasta gamma di molecole superficiali o intracellulari di cellule diverse in biologia.

Qui, descriviamo l'isolamento, la preparazione e l'imaging del mouse primario 5C. C7 cellule T utilizzando un microscopio a fogli di luce reticolo. Durante la sezione 3, è imperativo allineare correttamente il microscopio e raccogliere PSF ogni giorno con cui deconvolve i dati dopo la raccolta. Nella Figura 2, vengono mostrate le immagini di allineamento corrette che verranno visualizzate durante l'allineamento del microscopio. Figura 2A e <stro...

L'obiettivo di questo protocollo è quello di mostrare come utilizzare la microscopia Lattice Light-Sheet per visualizzare in modo quadridimensionale le dinamiche del recettore superficiale nelle cellule vive. Qui vengono mostrati i recettori delle cellule T su CD4- cellule T primarie.

Visualizzazione delle dinamiche del recettore a cellule T di superficie in modo quad-dimensionale utilizzando la microscopia A fogli di luce a reticolo

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

La microscopia a fogli di luce reticolare è una potente tecnologia di imaging, ma pochi laboratori al mondo sono in grado di usarla. Questo protocollo fornisce una panoramica dettagliata di come utilizzare il microscopio a fogli di luce reticolare disponibile in commercio. È un sistema estremamente potente in grado di imaging quadridimensionale di singole cellule o embrioni che consente il tracciamento in tempo reale delle molecole.Il vantaggio principale di questa tecnica è che può immagini tridimensionale singole cellule o organi vivi con alta risoluzione spaziotemporale e sbiancamento fotografico minimo. Il modello reticolare della lastra luminosa ci consente di campioni di immagini ad alta velocità e ottenere video in tempo reale di cellule e organi viventi tridimensionali con dettagli molecolari che altre tecniche non possono ottenere. Questo primo protocollo video che mostra come per noi microscopia a foglio luminoso reticolare per l'immagine di una singola cella quadridimensionale.Questa è una tecnica molto complicata a causa dell'allineamento e della preparazione del campione. E crediamo che la dimostrazione visiva migliorerà l'accessibilità permettendo a più scienziati di immaginiamo molte molecole, cellule e organi diversi in biologia. Per iniziare questa procedura, incubare cinque coverlips rotonde millimetri con 0,1% poli-L-lisina a temperatura ambiente per 10 minuti.Aspirare il liquido e lasciare asciugare naturalmente l'aria dei copripavimenti. Aggiungere quindi tre millilitri di gradiente di densità a un tubo conico da 15 millilitri. Aggiungere con cura le cellule per quanto riguarda la caduta sul bordo del tubo.Centrifuga a 930 volte g e a quattro gradi Celsius per 10 minuti. Successivamente, rimuovere con cura il sottile strato intermedio di celle tra il supporto completo e il reagente gradiente di densità assicurandosi di mettere ogni tipo di cella in un tubo conico separato. Centrifugare a 300 volte g per cinque minuti per lavare le cellule.Scartare il supernatante e aggiungere cinque millilitri di RPMI ai tubi delle cellule T e CH27. Ripetere il lavaggio con RPMI fresco fino a quando non sono stati eseguiti tre lavaggi totali. Quindi, rimescolare le cellule in ogni tubo con un millilitro di RPMI completo e contare le cellule con un emocitometro.Resuspend un milione di cellule che presentano antigeni in 500 microlitri di RPMI completo e aggiungere 10 MCC micromolare. Incubare a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5% per tre ore. Successivamente, rimospendì un milione di cellule T in 500 microlitri di RPMI completo.Aggiungere due microgrammi di anti-TCR beta Alexa 488 etichettato FAB e incubare a 37 gradi Celsius con 5% di anidride carbonica per 30 minuti. Quindi, centrifuga entrambe le cellule a 300 volte g per cinque minuti e scarta il supernatante. Aggiungere 500 microlitri di RPMI completo e ripetere la centrifuga per lavare le cellule.Ripetere il lavaggio con RPMI fresco fino a quando non sono stati eseguiti tre lavaggi totali scartando il supernatante dopo ogni lavaggio. Successivamente, resuspend entrambi i tipi di cellule in 500 microlitri di supporti di imaging. In primo luogo, aggiungere 10 millilitri di acqua e 30 microlitri di fluoresceina al bagno LLSM.Premete Home immagine per spostare l'oggetto nella posizione dell'immagine e guardate un singolo motivo a fascio laser di Bessel. Allineare il raggio laser utilizzando la guida e la regione di interesse preimpostata per rendere il fascio un modello sottile bilanciato in tutte le direzioni. Il fascio dovrebbe anche apparire focalizzato nella fotocamera del finder.Utilizzare i due regolatori di inclinazione dello specchio, il micrometro di messa a fuoco superiore e il colore obiettivo per regolare il fascio. Successivamente, lavare il bagno e gli obiettivi con almeno 200 millilitri di acqua per rimuovere completamente qualsiasi fluoresceina. Per visualizzare le perline fluorescenti standard, attivare il dithering impostando su tre nella casella intervallo Xgalvo e premere Live per visualizzare il campo corrente.Regola manualmente lo specchio di inclinazione, il colore obiettivo e il micrometro di messa a fuoco per i valori grigi più alti. Quindi, regola se necessario per ottenere modelli adeguati per le modalità di acquisizione della scansione obiettiva, Z galvo, Z plus e sample scan. Successivamente, premere Esegui in modalità di scansione di esempio per raccogliere la funzione di diffusione del punto di esempio per la de-skewing e la de-convoluzione.Modificare i laser in tre modalità colore e premere di nuovo Esegui. Per iniziare, aggiungere 100.000 cellule anti-presentazione al coverslip circolare preparato di cinque millimetri di diametro e consentire loro di depositarsi per 10 minuti. Ungere il portacampioni e aggiungere il coverslip al lato della cella verso l'alto.Aggiungere quindi una goccia di supporti di imaging sul retro del coverslip. Avvitare il portacampioni sul Piezo e premere Image Home. Trova una cella di presentazione dell'antigene su immagine e assicurati che l'LLSM e il software di imaging funzionino correttamente.Premere Live per visualizzare l'immagine corrente. Spostarsi lungo Z per trovare il coverslip e le celle. Trovare il centro di una cella che presenta l'antigene muovendosi nella direzione Z, quindi premere Interrompi per mettere in pausa il laser.Controllare il 3D e inserire le impostazioni desiderate. Premere Centro e quindi Esegui per raccogliere i dati. Abbassare lo stadio alla posizione di carico e aggiungere 50 microlitri di celle A e mezzi di imaging per quanto riguarda la goccia direttamente sopra il coverslip.È meglio lasciare una forma di goccia all'estremità della punta della pipetta e quindi toccare la punta al liquido del bagno. Sollevare nuovamente il palco facendo clic su Ritorno immagine. Inizia l'imaging.Assicurarsi di impostare la pila Z desiderata e la lunghezza timelapse. Ad esempio, l'immagine 60 Z si impila con una dimensione del passo di 0,4 micrometri e immette 500 tempi. Interrompere la registrazione prima di raggiungere 500 fotogrammi per evitare lo sbiancamento delle foto.Utilizzare la modalità live per cercare coppie di celle e quando sono state immesse le impostazioni pronte e desiderate, premere Esegui per raccogliere dati. In questo studio, le cellule T 5CC7 del topo primario vengono isolate e preparate e vengono quindi immagini utilizzando un microscopio a foglio luminoso reticolare. Qui sono mostrati il corretto percorso del fascio e l'allineamento del fascio quando viene immaginato con fluoresceina.La scansione oggettiva dovrebbe mostrare una grande forma a X nelle proiezioni XZ e YZ che sia il più simmetrica possibile. Dovrebbero anche essere regolati per essere il più piccoli possibile di una X. La scansione galvo Z dovrebbe mostrare un ovale in XZ e XY con un singolo punto su entrambi i lati.Infine, sia la scansione obiettivo Z plus che la scansione del campione dovrebbero mostrare punti che sembrano il più rotondi possibile. Usando questo protocollo, si potevano vedere le dinamiche quadridimensionali dei recettori delle cellule T su una superficie di cellule T. Il vantaggio principale di questo microscopio risiede nella capacità di tracciare le unità superficiali visualizzazionete dei recettori delle cellule T e di ottenere dati quantificati dalle loro dimensioni, movimento, intensità del segnale ed escrementi.La cosa più importante da ricordare è la qualità del tuo allineamento. La scheda luminosa del reticolo deve essere allineata quotidianamente e non farlo correttamente si tradurrà in un'immagine distorta. Allo stesso modo, la qualità delle FPF raccolte influisce direttamente sulla qualità della devoluzione che alla fine si traduce nella qualità dell'immagine finale.Uno dei motivi per cui questo metodo è così potente è perché ogni cellula ed etichetta può essere sostituita per visualizzare molti tipi di cellule e molecole. Pertanto, questo metodo può essere utilizzato per rispondere a qualsiasi domanda relativa al tracciamento quadridimensionale delle molecole. Pensiamo che questa tecnica spianerà la strada ai ricercatori per esplorare nuove questioni nel campo del traffico molecolare.Non è ancora ampiamente utilizzato a causa del complicato sistema, quindi speriamo che questo video jove migliori l'accessibilità alla tecnica. I laser utilizzati sul sistema sono di classe quattro, quindi è necessario prestare assoluta cautela per garantire la sicurezza laser. Si prega di eseguire l'allenamento di sicurezza laser necessario prima di utilizzare questo metodo.

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Questo protocollo descrive un metodo per le cellule T immagine fluorescente introdotto a fette linfonodo. La tecnica permette in tempo reale analisi della migrazione delle cellule T con widefield tradizionali microscopi a fluorescenza o confocale.

Imaging ex vivo di cellule T nel Fette murini Linfonodo con grandangolari e microscopi confocale

La compartimentazione delle proteine ​​sia all'interno della membrana plasmatica o in sedi intracellulari è un meccanismo di regolazione che possono influenzare notevolmente i risultati di segnalazione, di conseguenza, per comprendere la segnalazione è importante studiare il comportamento spaziale e temporale delle proteine ​​coinvolte. Descriviamo qui un sistema basato TIRF microscopia a studiare trasduzione del segnale in cellule T, ma è ampiamente applicabile.

Una tecnica di microscopia TIRF per Real-time, Imaging simultanea del TCR e delle sue proteine ​​associate segnalazione

In questo video, descriviamo la tecnica di microscopia a foglio di luce reticolare per visualizzare le interazioni tra cellule T vive e cellule presentanti l'antigene. Il metodo prevede la focalizzazione di un foglio di luce reticolare ultrasottile su una coppia di celle interagenti per ottenere una serie di immagini bidimensionali, che vengono combinate per ottenere immagini quadridimensionali ad alta risoluzione che rivelano le dinamiche spaziotemporali dell'interazione cellula-cellula.

Microscopia a foglio di luce reticolare per visualizzare le interazioni recettore-ligando nelle cellule vive

Si descrive un metodo live-cell imaging che permette di comprendere dinamica della proteina durante il processo di attivazione delle cellule T. Dimostriamo l'utilizzo combinato della cellula T diffusione saggio, microscopia confocale e analisi di imaging per produrre risultati quantitativi di seguire segnalamento formazione di complessi durante l'attivazione delle cellule T.

Tempo reale Imaging in diretta di cellule T Signaling formazione del complesso

Ad alta risoluzione intravital immagini con maggiore contrasto fino a 120 micron di profondità in linfonodi di topi adulti si ottiene spazialmente modulando il pattern di eccitazione di un microscopio a due fotoni multifocale. In 100 micron di profondità abbiamo misurato risoluzioni di 487 nm (laterali) e 551 nm (assiale), eludendo così dispersione e diffrazione limiti.

Altamente Risolto intravitale Striped-illuminazione Microscopia dei Centri Germinal

Questo protocollo descrive come utilizzare la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale per visualizzare e tracciare singoli recettori sulla superficie delle cellule viventi e quindi analizzare la mobilità laterale del recettore, le dimensioni dei complessi recettoriali e per visualizzare le interazioni transitorie recettore-recettore. Questo protocollo può essere esteso ad altre proteine di membrana.

Ad alta risoluzione Spatiotemporal Analisi del recettore Dynamics per singola molecola di microscopia a fluorescenza

Comunicazione intercellulare è fondamentale per controllare varie attività fisiologiche all'interno e all'esterno della cellula. Questo documento descrive un protocollo per misurare la natura spazio-temporale delle secrezioni unicellulari. Per raggiungere questo obiettivo, è usato un approccio multidisciplinare che integra nanoplasmonic label-free sensing con imaging cellulare dal vivo.

Una tecnica senza etichetta per l&#39;Imaging spazio-temporale delle secrezioni monocellulari

L'immunità adattativa è controllata da 'sinapsi immunologiche' dinamiche formate tra le cellule T e le cellule presentanti l'antigene. Questo protocollo descrive i metodi per studiare le cellule endoteliali sia come APC fisiologiche poco studiate sia come un nuovo tipo di "modello di APC cellulare planare".

Un modello cellule endoteliali Planar for Imaging immunologiche Synapse Dynamics

Per studiare le velocità di flusso e la direzionalità dell'actina filamentosa nella sinapsi immunologica delle cellule T, l'imaging a super-risoluzione su cellule vive è combinato con la fluorescenza a riflessione interna totale e quantificato con la spettroscopia di correlazione delle immagini spazio-temporali.

Corticale actina di flusso in cellule T quantificati da spazio-temporale Correlazione Immagine Spettroscopia di Structured Illuminazione Microscopia dati

Questo protocollo descrive un metodo basato su formazione immagine per attivare i linfociti T usando fuse peptide-MHC, consentendo un controllo preciso spazio-temporale dell'attivazione delle cellule T.

Controllo spaziale e temporale di attivazione delle cellule T utilizzando un agonista fuse

Qui, presentiamo un protocollo per visualizzare le cellule immunitarie incorporate in una matrice di collagene (3D) tridimensionale utilizzando la microscopia a luce-foglio. Questo protocollo elabora anche come tenere traccia di migrazione cellulare in 3D. Questo protocollo può essere impiegato per altri tipi di cellule in sospensione nella matrice 3D.

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Impara a visualizzare le dinamiche del recettore a cellule T in quattro dimensioni utilizzando la microscopia a fogli di luce a reticolo su cellule CD4+ vive. Questo metodo consente il tracciamento in tempo reale con alta risoluzione spaziotemporale.

Visualizzazione delle dinamiche del recettore a cellule T di superficie in modo quad-dimensionale utilizzando la microscopia A fogli di luce a reticolo (Video) | JoVE Journal

Visualizzazione delle dinamiche del recettore a cellule T di superficie in modo quad-dimensionale utilizzando la microscopia A fogli di luce a reticolo

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