Un metodo statico auto-diretto per generare organiidi cerebrali da cellule staminali embrionali umane

Gli organoidi cerebrali umani sono uno strumento significativo per studiare le malattie in un sistema che è facilmente manipolabile e incorpora un ambiente umano e l'interazione appropriata di più tipi di cellule. Questa tecnica può essere applicata per studiare numerose malattie del cervello, tra cui disturbi del neurosviluppo, insulti tossici e la crescita e il trattamento del cancro nel cervello. Il principale vantaggio di questo protocollo è la capacità di generare organoidi cerebrali altamente riproducibili con un'ampia varietà di tipi di cellule neuronali.

Questo viene fatto utilizzando un flusso di lavoro molto semplicistico che potrebbe essere realizzato dalla maggior parte dei laboratori. E questi sono prodotti in modo temporaneo appropriato senza l'influenza di fattori di crescita specializzati o matrici indefinite che lo rende un sistema molto semplice ed economico. Per iniziare, combinare 100 microlitri di matrice con 5,9 millilitri di mezzi Eagle Medium o F12 a freddo ghiaccio in un tubo conico da 15 millilitri.

Rivestire ogni bene in una piastra a sei pozzetti con un millilitro della matrice di membrana. Avvolgere il piatto in pellicola di paraffina e conservare durante la notte a quattro gradi Celsius. Il giorno dopo, aspirare i supporti in eccesso da ogni pozzo, sciacquare i pozzi con F12 e aggiungere H9 hESCS in un volume totale di due millilitri di supporti mTeSR1 per pozzo.

Coltura delle cellule di settimana in settimana. Fornire quotidianamente due millilitri di supporti mTeSR1 e posizionare la piastra in un incubatore di ossigeno basso Celsius di 37 gradi con 5% di ossigeno e 5% di anidride carbonica. Usa strumenti di vetro per distogliare le cellule differenzianti dalla coltura tra i passaggi.

Aggiornare i contenuti multimediali ogni giorno. Le cellule devono essere passaggio da quattro a sei giorni prima di utilizzare le celle H9 per la produzione di organoidi. Per passare le cellule, iniziare risciacquandole con mezzi DMEM F12 e aspirando il liquido in eccesso.

Dopo il risciacquo, aggiungere la soluzione di proteasi e incubare le cellule per 40 minuti affinché le colonie galleggino all'interno del pozzo. Successivamente, lavare le celle tre volte utilizzando DMEM F12 e, se necessario, titolare per rendere i pezzi più piccoli. Quindi distribuire le cellule con un rapporto approssimativo uno a otto su quattro piastre a sei pozzi e posizionare le piastre nell'incubatrice e nutrirsi quotidianamente.

Dopo quattro o sei giorni, le celle raggiungono circa l'80% di confluenza. Passa a un incubatore regolare. Diluire la soluzione di proteasi a una concentrazione di lavoro aggiungendo un millilitro della soluzione stock a cinque millilitri di mezzo DMEM o F12 per ogni piastra a sei pozzetti di hESCS.

Aspirare e rimuovere il supporto di coltura cellulare, quindi coprire l'hESCS con la soluzione di proteasi. Posizionare le piastre nell'incubatrice per 10-15 minuti o fino a quando i bordi delle colonie si arrotondano e iniziano a separarsi dalla matrice ma prima che si arrotondano completamente. Inclinare la piastra, aspirare la soluzione di proteasi e lavare delicatamente le cellule con due millilitri di DMEM o F12 per ogni pozzo tre volte.

Assicurati che le colonie rimangano attaccate alla matrice. Quindi è fondamentale che i pezzi di cellule ES abbiano le dimensioni appropriate, quindi assicurati che siano in dispasi per la quantità appropriata di tempo. Se sono lì dentro per troppo poco tempo, può essere molto difficile scaricarli e separarli.

E se sono lì dentro per troppo tempo, possono semplicemente staccarsi durante i passaggi di lavaggio. Aggiungere di nuovo circa uno o 1,5 millilitri di supporti mTeSR freschi a ciascun pozzo e sciacquare le celle dalla piastra in un tubo conico da 50 millilitri utilizzando una tubazione delicata. Aspirare e erogare hESCS all'interno della piastra fino a raggiungere circa 1/30 della loro dimensione originale.

Ora gli ammassi di colonie assomigliano a pezzi di dimensioni da 250 a 350 micrometri. Trasferire le celle in un singolo pallone T75 ad attacco ultra basso contenente 30 millilitri di supporti mTeSR senza bFGF. Il giorno dopo, inclina il pallone in modo che le cellule vive si bilivano nell'angolo.

Se ci sono un gran numero di cellule che hanno aderito al fondo del pallone, utilizzare una pipetta da 10 millilitri per trasferire le cellule in un nuovo pallone. Aspettatevi di avere un'alta popolazione di cellule morte per i primi giorni. Una volta che le cellule si depositano, aspirare il mezzo e le cellule morte lasciando circa 10 millilitri di mezzi contenenti le cellule vive e aggiungere 20 millilitri di supporti bFGF bassi integrati con 30 nanogrammi per millilitro di bFGF.

Dopo due giorni, controllare le celle. La maggior parte delle cellule dovrebbe apparire sana e luminosa. Tuttavia, se più di un terzo delle cellule appare scuro, inclinare il pallone e sostituire 20 millilitri di supporti con 20 millilitri di supporti bFGF bassi integrati con 20 nanogrammi per millilitro di bFGF.

Il terzo giorno, rimuovere metà del supporto e sostituire con 15 millilitri di supporti hESC integrati con 10 nanogrammi per millilitro di bFGF. Il quinto giorno, sostituire metà dei media con 15 millilitri di mezzi di induzione neurale. Dopodi tempo, a giorni nostri, sostituisci metà del mezzo con mezzi di induzione neurale.

Dopo tre settimane di coltura, aggiungere 100X Penicillina-Streptomicina ai supporti ad una concentrazione finale di 1X se lo si desidera. Aggiorna metà dei media a giorni diversi. In questo protocollo, gli organoidi cerebrali formati sembravano luminosi e di dimensioni simili senza cellule morenti scure al centro di questi ammassi.

Le cellule sono state gradualmente svezzate da bFGF. Il quinto giorno, sono stati collocati in mezzi di induzione neurale e sono rimasti in questi media per tutto il periodo della cultura. Sebbene gli organoidi siano aumentati e quindi più scuri nel tempo, le strutture simili a rosetta neurali si sono espanse, il che indica l'inizio della differenziazione neurale e contiene caratteristiche del tubo neurale embrionale.

Per dare un'occhiata più approfondita all'espressione genica all'interno delle cellule, è stata eseguita l'analisi qPCR. Il trasportatore di glutammato VLGUT1 è stato espresso a due settimane e mezza, è aumentato a cinque settimane e è rimasto coerente attraverso cinque mesi di cultura. Un marcatore di forebraina Foxg1 è stato espresso a bassi livelli fino a cinque settimane in cultura.

Il marcatore dello strato profondo Tbr1 ha raggiunto il picco di circa cinque settimane e si è successivamente ridotto. Mentre l'espressione del marcatore dello strato superiore Satb2, il marcatore ventrale Eng1, il marcatore del midollo spinale del cervello posteriore Hoxb4, così come il marcatore oligodendrocita Olig2 sono aumentati nel tempo. Al contrario, il marcatore di cellule staminali Sox2 è diminuito nel tempo.

Il marcatore gliale GFAP raggiunse il picco di cinque settimane e rimase relativamente costante in seguito. Ricorda di prestare la massima attenzione quando maneggia le cellule ES negli organoidi in fase iniziale per evitare la contaminazione mentre vengono coltivate senza antibiotici e ricorda anche di nutrirsi secondo i tempi previsti. Seguendo questa procedura, è possibile valutare gli organoidi utilizzando tecniche come rt-PCR quantitativa per l'espressione genica e l'immunofluorescenza per l'espressione e la localizzazione delle proteine.

Utilizzando questa tecnica, siamo stati in grado di studiare la capacità di una piccola molecola di alleviare gli aspetti della lesione ipossia neonatale umana modellata in una camera di ipossia. È significativo che questi organoidi cerebrali umani si siano comportati in modo simile agli esperimenti sui topi in vivo.