Generazione di standardizzato e riproducibile del Forebrain-tipo Organoids cerebrale da umani cellule staminali pluripotenti indotte

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di generare organoidi di tipo proencefalico altamente standardizzati e riproducibili da cellule staminali pluripotenti umane. Questo metodo è un potente strumento per la modellazione dei meccanismi di nuove NTZ di sviluppo. In particolare, può aiutare ad affrontare le questioni chiave associate alla genesi corticale umana precoce.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente la generazione standardizzata ed efficiente in termini di tempo di tessuto corticale umano con piccole variazioni tra i singoli organoidi e i lotti di organoidi. La tecnologia degli organoidi può fornire informazioni sullo sviluppo, la struttura e la funzione del cervello umano, in particolare per quegli aspetti che non si trovano nei modelli cerebrali delle specie inferiori. Per generare aggregati di cellule staminali pluripotenti, quando le colture di cellule staminali raggiungono una confluenza compresa tra il 70 e il 90%, aggiungere 500 microlitri di reagente di dissociazione cellulare a un pozzetto della piastra di coltura a sei pozzetti per staccare le cellule.

Le cellule staminali pluripotenti indotte, che sono adattate alle condizioni di coltura monostrato, sono un buon tipo di cellula per generare aggregati in quanto sono meno inclini alla morte cellulare indotta dallo stress durante la procedura di dissociazione e aggregazione. Dopo 5-10 minuti a 37 gradi Celsius, picchiettare delicatamente la piastra e utilizzare due millilitri di DMEM/F-12 per lavare le cellule dal fondo del pozzetto. Trasferire la sospensione cellulare risultante in una provetta conica da 15 millilitri e portare il volume della soluzione cellulare fino a 10 millilitri con altro terreno DMEM/F-12.

Dopo il conteggio, trasferire 4,5 volte 10 nella terza cellula per aggregato di cellule staminali pluripotenti in una nuova provetta da 15 millilitri e raccogliere le cellule mediante centrifugazione. Sospendiamo il pellet nel volume appropriato di terreno di cellule staminali pluripotenti, integrato con 50 inibitori di roccia micromolare per ottenere un 4,5 volte 10 alle terze cellule per 150 microlitri di concentrazione media. Quindi, aggiungere 150 microlitri di cellule ai singoli pozzetti di una piastra con fondo a U a 96 pozzetti e posizionare la piastra in un incubatore a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica.

Per monitorare l'induzione del neuroectoderma anteriore, utilizzare un microscopio per colture tissutali per osservare da vicino i cambiamenti morfologici degli aggregati di cellule staminali pluripotenti ogni giorno a basso ingrandimento. Il primo giorno, è necessario osservare gli aggregati cellulari con bordi chiari. Il secondo giorno, aspirare con cura circa due terzi del terreno, senza disturbare gli aggregati cellulari sul fondo di ciascun pozzetto, e sostituire il terreno scartato con 100 microlitri di terreno di cellule staminali pluripotenti fresche.

Tra i quattro e i sei giorni dopo, quando gli aggregati cellulari raggiungono i 350-450 micrometri di diametro e mostrano bordi lisci, utilizzare una punta per pipetta modificata da 100 microlitri per trasferire fino a 20 aggregati in un'unica piastra di coltura a basso attacco di sei centimetri contenente cinque millilitri di terreno di induzione corticale. Sostituire il terreno di induzione corticale con terreno fresco una volta ogni tre giorni, monitorando quotidianamente la morfologia degli aggregati con l'obiettivo 4X. Dopo quattro o cinque giorni nel mezzo di induzione corticale, i bordi degli aggregati cellulari dovrebbero iniziare a schiarirsi in superficie, indicando la differenziazione neuroectodermica e l'organizzazione radiale di un epitelio pseudostratificato.

Per incorporare gli aggregati neuroectodermici in un'impalcatura a matrice, scongelare l'estratto della membrana basale su ghiaccio per due o tre ore. Mentre l'estratto si sta scongelando, utilizzare delle forbici sterili per tagliare la pellicola di paraffina di plastica in un quadrato di quattro per quattro centimetri per 16 organoidi e posizionare ogni pezzo di pellicola su un vassoio vuoto per micropipette da 100 microlitri. Premere la pellicola di paraffina con la punta del dito guantata in modo che appaiano piccole fossette e pulire la pellicola con etanolo al 70%.

Dopo la radiazione UV in una camera di biosicurezza chiusa e sterile per 30 minuti, utilizzare un puntale per pipetta modificato da 100 microlitri con un'apertura da un millimetro e mezzo a due millimetri per trasferire ogni aggregato cellulare in una fossetta nel film. Quando tutti gli aggregati sono stati trasferiti, utilizzare una punta di pipetta da 100 microlitri non tagliata per aspirare accuratamente il terreno da ciascuna fossetta e aggiungere 40 microlitri di estratto di membrana basale non diluito a ciascun aggregato cellulare. Fare attenzione a non danneggiare gli organoidi mediante manipolazione brusca o aspirazione nella punta della pipetta, poiché ciò danneggerebbe il neuroepitelio in via di sviluppo.

Utilizzare la punta della pipetta per posizionare gli aggregati al centro di ogni goccia e utilizzare una pinza sterile per trasferire con cura il foglio di pellicola di paraffina di plastica in una capsula di Petri da 10 centimetri. Mettere il piatto nell'incubatrice per 15-20 minuti. Mentre l'estratto si sta solidificando, aggiungere cinque millimetri di terreno di induzione corticale fresco a un piatto di coltura a basso attacco di sei centimetri.

Al termine dell'incubazione, capovolgere il foglio di pellicola di paraffina e utilizzare una pinza sterile per spremere delicatamente fino a 16 goccioline polimerizzate in ogni piatto di sei centimetri. Quindi rimettere gli aggregati nell'incubatore per colture cellulari. Il giorno successivo, trasferire i piatti di coltura degli organoidi su un agitatore per colture cellulari a dondolo, inclinato di un angolo di cinque gradi a 14 giri/min all'interno di un incubatore per colture cellulari, con monitoraggio giornaliero al microscopio ottico, fino a quando gli aggregati non raggiungono la fase di differenziazione di interesse.

Il giorno 20, utilizzare una punta per pipetta modificata da un millilitro con un'apertura da tre a tre millilitri e mezzo per raccogliere sei organoidi dalle colture aggregate. Mettere tre degli organoidi in un pozzetto di una piastra a 24 pozzetti contenente 500 microlitri di PBS e utilizzare una pipetta da cinque millilitri per lavare gli organoidi due volte con 500 microlitri di PBS fresco per lavaggio. Dopo il secondo lavaggio, fissare gli organoidi in paraformaldeide fredda al 4% per 15 minuti, seguiti da tre lavaggi di 10 minuti in PBS a temperatura ambiente e una disidratazione finale notturna in soluzione di saccarosio al 30% a quattro gradi Celsius.

Il giorno successivo, pre-colorare gli organoidi disidratati con una diluizione da uno a 50 di Trypan Blue per 10 minuti per consentire la visualizzazione degli organoidi durante la procedura di criosezione e sostituire il saccarosio con un terreno di inclusione appena preparato. Riscaldare la piastra su un termoforo a 60 gradi Celsius per 15 minuti per equilibrare gli organoidi nel mezzo di inclusione e coprire il fondo di uno stampo da inclusione per organoide con un mezzo di inclusione fresco. Posizionare lo stampo sul ghiaccio per solidificare il mezzo di inclusione, trasferire gli organoidi negli stampi di inclusione e aggiungere il terreno di inclusione fresco fino a coprire ogni organoide.

Quindi congelare gli organoidi in un bagno di congelamento con ghiaccio secco al 100% di etanolo per almeno un minuto e utilizzare un criostato per ottenere sezioni spesse 20 micrometri di ciascun organoide per l'analisi immunocitochimica. Per generare organoidi di tipo proencefalico, utilizzare solo colture IPSC che si presentano come un monostrato omogeneo di cellule indifferenziate nella popolazione di partenza. Il secondo giorno, gli aggregati dovrebbero aver formato gemme cellulari compatte con bordi lisci.

Gli aggregati del giorno 10 dovrebbero mostrare tessuto liscio e otticamente liscio e otticamente traslucido sulla superficie esterna, che rappresenta l'induzione del neuroectoderma. Se il protocollo è stato seguito attentamente, verranno generati lotti di organoidi altamente standardizzati che dimostrano un'omogeneità maggiore o uguale al 90% nella formazione di neuroectodermi polarizzati all'interno e tra i lotti. L'analisi immunocitochimica degli organoidi del giorno 20 rivela anse neuroepiteliali stratificate che esprimono il marcatore delle cellule staminali neurali Sox2, i marcatori del proencefalo Pax6 e Otx2 e il marcatore corticale dorsale Emx1.

Queste anse corticali sono ulteriormente caratterizzate da una localizzazione apicale di N-caderina e ZO-1, microtubulo derivato da cellule gliali radiali della zona ventricolare, che si estende dal lato apicale a quello basale delle strutture, e cellule divisorie apicali che si colorano positivamente per la vimentina fosforilata. Per analizzare il piano di divisione delle cellule gliali radiali apicali, è possibile eseguire la doppia colorazione per vimentina e Tpx2, una proteina associata ai microtubuli che può essere utilizzata per visualizzare il fuso mitotico e i processi apicali durante la migrazione nucleare intercinetica. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come generare organoidi di tipo proencefalico altamente standardizzati e omogenei da cellule staminali pluripotenti umane.

Questa tecnica facilita lo studio degli aspetti specifici dell'uomo dei disturbi del neurosviluppo utilizzando un complesso modello cellulare 3D organizzato in modo neurotessuto-specifico. Una volta padroneggiata la tecnica, questi organoidi corticali possono essere utilizzati per una varietà di applicazioni, come studi sullo sviluppo neurologico, evolutivi o sulla funzione genica, tra cui la modellazione della malattia e potenzialmente test o terapie farmacologiche.