Name: Un metodo semplice per lisolamento di protoplasti di soia e lapplicazione di analisi di espressione genica transitoria (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: Impara un metodo semplice per isolare protoplasti di soia di alta qualità per studiare meccanismi regolatori e di segnalazione nelle cellule vegetali vive. Questa tecnica produce grandi quantità di cellule uniformi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questo lavoro è stato supportato dal programma di ricerca del genoma di pianta dalla National Science Foundation (NSF-PGRP-IOS-1339388).

1. la crescita delle piante
<ol><li>Seminare i semi di soia 5-10 (Williams 82) in un vaso di 13 cm in serra in condizioni di giorno lungo (16 h luce alle 1.500 µmol m-2 s-1) a 25 ° C sul mix di terreno personalizzato per la soia (1:1:1 rapporto di sabbia del suolo, la perlite e la torpedine).</li>
</ol>2. preparazione del DNA del plasmide
<ol><li>Utilizzando una pipetta sterile o uno stuzzicadenti, scegli una singola Colonia o glicerolo congelati stock di e. coli che trasportano il plasmide contenente il gene di interesse e inoculare esso in 20 mL di terreno liquido di Luria-Bertani (LB) con gli antibiotici adatti in un pallone da 50 mL.</li>
	<li>Incubare la beuta a 37 ° C durante la notte su un agitatore. Raccogliere i batteri da centrifugazione la sospensione a 12.000 x g a temperatura ambiente per 5 minuti e scartare il surnatante. Estrarre e purificare il plasmide seguendo la procedura del produttore di un kit di preparazione del plasmide.</li>
</ol>3. isolamento di protoplasti
<ol><li>Tagliare foglie unifoliate recentemente ampliate da piantine di soia 10 - giorno di vita (Figura 1). Nota: Selezione di foglie in una fase inerente allo sviluppo appropriata è la chiave per il successo per la preparazione di protoplasti di soia. Utilizzare solo foglie appena ampliati alle prime fasi dello sviluppo. Come lascia maturo, pareti cellulari diventano più difficile da digerire.</li>
	<li>Con una lama di rasoio fresca, togliere la foglia unifoliata e quindi tagliare i resti in 0,5-1 mm strisce la nervatura centrale. Nota: Due foglie unifoliate digeriti in 10 mL di soluzione di enzima darà protoplasti sufficienti per più di 10 trasformazioni.</li>
	<li>Usando un paio di pinze, trasferimento la foglia strisce immediatamente e delicatamente in 10 mL di soluzione enzimatica preparata al momento (tabella 1) in una provetta da 15 mL. Vuoto si infiltra in foglia strisce per 15 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Incubare le strisce di foglia nella soluzione enzimatica con agitazione delicata (40 giri) sotto luce bassa per 4-6 h a temperatura ambiente. Assicurarsi che la soluzione di enzima diventa giallo-verde come protoplasti vengono rilasciati. Verificare la soluzione di enzima/protoplasti al microscopio (X10). Nota: I protoplasti rilasciati sono sferici a forma, mentre le cellule non digerite hanno forma ovale o irregolare.</li>
	<li>Trasferire i 10 mL di soluzione di enzima/protoplasti in una provetta da 50 mL versando delicatamente e aggiungere 10 mL di soluzione di W5 (tabella 1) a temperatura ambiente per interrompere la digestione. Capovolgere delicatamente la provetta un paio di volte. Versare delicatamente la soluzione enzima/protoplasti su una maglia di nylon pulito 75 µm posizionata sopra un tubo da 50 mL per rimuovere i tessuti della foglia non digerito.</li>
	<li>Centrifugare la soluzione di flusso continuo enzima/protoplasti a 100 x g nel tubo 50 mL per 1-2 min a temperatura ambiente. Rimuovere delicatamente il supernatante utilizzando una pipetta sierologica 10ml senza disturbare il pellet di protoplasti.</li>
	<li>Risospendere i protoplasti e contando il numero di protoplasti su un emocitometro sotto il microscopio (x10), diluire ad una concentrazione di 2 x 105 mL-1 in soluzione di W5 refrigerati a 4 ° C. Mantenere i protoplasti su ghiaccio per 30 min.</li>
	<li>Centrifugare la sospensione a 100 x g per 1-2 min a temperatura ambiente e rimuovere delicatamente la soluzione W5 utilizzando una pipetta da 1 mL senza disturbare il pellet di protoplasti. Risospendere i protoplasti nella soluzione MMG (tabella 1) ad una concentrazione di 2 x 105 mL-1 a temperatura ambiente.</li>
</ol>4. trasformazione di protoplasti
<ol><li>Fai aliquote di 100 µ l dei protoplasti (2 x 104 protoplasti a 2 x 105 mL-1) in 1,5 mL bassa adesione per microcentrifuga utilizzando puntali per pipette uncut 200 µ l. Mettere un'aliquota da parte per servire come controllo negativo. Aggiungere 10 µ l di plasmide (10-20 µ g) in ciascuna dell'aliquota resto dei protoplasti.</li>
	<li>Aggiungere lentamente 110 µ l di soluzione preparata di PEG (tabella 1) sulla parete interna del tubo per microcentrifuga da 1,5 mL e quindi capovolgere delicatamente e ruotare il tubo fino a quando la soluzione diventa omogenea.</li>
	<li>Incubare la miscela di trasformazione a temperatura ambiente per 15 min.</li>
	<li>Per fermare la trasformazione, lentamente aggiungere 400 µ l di soluzione di W5 per la provetta da 1,5 mL a temperatura ambiente e capovolgere delicatamente la provetta fino a quando la soluzione diventa omogenea. Centrifugare la provetta a 100 g per 1-2 min a temperatura ambiente e scartare il surnatante con una pipetta.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di soluzione WI (tabella 1) al tubo e risospendere pipettando delicatamente 1 - 2 volte. Aggiungere 1 mL di siero di vitello sterile (vol/vol) 5% in ogni pozzetto di una piastra di coltura del tessuto 6 pozzetti per rivestire la superficie ed evitare i protoplasti di attaccarsi alla piastra.</li>
	<li>Dopo pochi secondi, scartare il siero di vitello utilizzando una pipetta. Trasferire i protoplasti sedimento in un pozzetto della piastra di coltura. Coprire la piastra con un coperchio.</li>
</ol>5. protoplasti incubazione e raccolta
<ol><li>Incubare i protoplasti a temperatura ambiente per 1-2 giorni al buio. Nota: Abbiamo trovato che due-giorni di incubazione produce più forte segnale di proteina fluorescente in generale rispetto ad un giorno incubazione, e che il segnale di proteina fluorescente può durare fino a 3-4 giorni.</li>
	<li>Trasferire la soluzione di protoplasti di un tubo del microcentrifuge bassa adesione di 1,5 mL. Centrifugare la provetta a 100 x g per 1-2 min a temperatura ambiente per raccogliere protoplasti. Rimuovere il surnatante con una pipetta e trasferire 10 protoplasti µ l su una lastra di vetro.</li>
	<li>Osservare il segnale fluorescente sotto fluorescenza o microscopia confocale. Utilizzare non trasformate protoplasti come controllo negativo (non dovrebbe essere osservato nessun segnale).</li>
</ol>

<ol><li>Melchers, G., Labib, G. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/BF00271144">Somatic hybridisation of plants by fusion of protoplasts.</a> Mol. Gen. Genet. 135 (4), 277-294 (1974).</li>
<li>Gresshoff, P. M. <a target="_blank" href="https://www.jstor.org/stable/2474847">In vitro culture of white clover: callus, suspension, protoplast culture, and plant regeneration.</a> Bot. Gaz. 141 (2), 157-164 (1980).</li>
<li>Lörz, H., Baker, B., Schell, J. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/BF00330256">Gene transfer to cereal cells mediated by protoplast transformation.</a> Mol. Gen. Genet. 199 (2), 178-182 (1985).</li>
<li>Hayashimoto, A., Li, Z., Murai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+polyethylene+glycol-mediated+protoplast+transformation+system+for+production+of+fertile+transgenic+rice+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">A polyethylene glycol-mediated protoplast transformation system for production of fertile transgenic rice plants.</a> Plant Physiol. 93 (3), 857-863 (1990).</li>
<li>Koop, H. -U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+foreign+sequences+into+the+tobacco+plastome+via+polyethylene+glycol-mediated+protoplast+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Integration of foreign sequences into the tobacco plastome via polyethylene glycol-mediated protoplast transformation.</a> Planta. 199 (2), 193-201 (1996).</li>
<li>Hrazdina, G., Wagner, G. J., Siegelman, H. W. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S003194220089679X">Subcellular localization of enzymes of anthocyanin biosynthesis in protoplasts.</a> Phytochemistry. 17 (1), 53-56 (1978).</li>
<li>Lin, W., Wittenbach, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+localization+of+proteases+in+wheat+and+corn+mesophyll+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Subcellular localization of proteases in wheat and corn mesophyll protoplasts.</a> Plant Physiol. 67 (5), 969-972 (1981).</li>
<li>Vögeli-Lange, R., Wagner, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+localization+of+cadmium+and+cadmium-binding+peptides+in+tobacco+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Subcellular localization of cadmium and cadmium-binding peptides in tobacco leaves.</a> Plant Physiol. 92 (4), 1086-1093 (1990).</li>
<li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+efficient+transient+protoplast+system+for+analyzing+defence+gene+expression+and+protein-protein+interactions+in+rice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant+Pathol%22%5BJournal%5D)">A highly efficient transient protoplast system for analyzing defence gene expression and protein-protein interactions in rice.</a> Mol. Plant Pathol. 7 (5), 417-427 (2006).</li>
<li>Wu, F. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tape-Arabidopsis+Sandwich-a+simpler+Arabidopsis+protoplast+isolation+method%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+methods%22%5BJournal%5D)">Tape-Arabidopsis Sandwich-a simpler Arabidopsis protoplast isolation method.</a> Plant methods. 5 (1), 16(2009).</li>
<li>Christensen, A. H., Sharrock, R. A., Quail, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maize+polyubiquitin+genes%3A+structure%2C+thermal+perturbation+of+expression+and+transcript+splicing%2C+and+promoter+activity+following+transfer+to+protoplasts+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Maize polyubiquitin genes: structure, thermal perturbation of expression and transcript splicing, and promoter activity following transfer to protoplasts by electroporation.</a> Plant Mol. Biol. 18 (4), 675-689 (1992).</li>
<li>Marcotte, W. R., Bayley, C. C., Quatrano, R. S. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/nature/journal/v335/n6189/abs/335454a0.html">Regulation of a wheat promoter by abscisic acid in rice protoplasts.</a> Nature. 335 (6189), 454-457 (1988).</li>
<li>Dron, M., Clouse, S. D., Dixon, R. A., Lawton, M. A., Lamb, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutathione+and+fungal+elicitor+regulation+of+a+plant+defense+gene+promoter+in+electroporated+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22P.+Natl.+A.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Glutathione and fungal elicitor regulation of a plant defense gene promoter in electroporated protoplasts.</a> P. Natl. A. Sci. USA. 85 (18), 6738-6742 (1988).</li>
<li>Cocking, E. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/nature/journal/v187/n4741/abs/187962a0.html">A method for the isolation of plant protoplasts and vacuoles.</a> Nature. 187 (4741), 962-963 (1960).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+rice+plants+produced+by+electroporation-mediated+plasmid+uptake+into+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Transgenic rice plants produced by electroporation-mediated plasmid uptake into protoplasts.</a> Plant Cell Rep. 7 (6), 379-384 (1988).</li>
<li>Fromm, M., Taylor, L. P., Walbot, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+genes+transferred+into+monocot+and+dicot+plant+cells+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22P.+Natl.+A.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Expression of genes transferred into monocot and dicot plant cells by electroporation.</a> P. Natl. A. Sci. USA. 82 (17), 5824-5828 (1985).</li>
<li>Crossway, A., et al. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/BF00331634">Integration of foreign DNA following microinjection of tobacco mesophyll protoplasts.</a> Mol. Gen. Genet. 202 (2), 179-185 (1986).</li>
<li>Holm, P. B., Olsen, O., Schnorf, M., Brinch-Pedersen, H., Knudsen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+barley+by+microinjection+into+isolated+zygote+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Res%22%5BJournal%5D)">Transformation of barley by microinjection into isolated zygote protoplasts.</a> Transgenic Res. 9 (1), 21-32 (2000).</li>
<li>Schapire, A. L., Lois, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+and+rapid+method+for+the+isolation+and+transfection+of+Arabidopsis+leaf+mesophyll+protoplasts+for+large-scale+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Signal+Transduction%3A+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">A simplified and rapid method for the isolation and transfection of Arabidopsis leaf mesophyll protoplasts for large-scale applications.</a> Plant Signal Transduction: Methods and Protocols. 1363, 79-88 (2016).</li>
<li>Niedz, R. P. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s11240-005-9028-4">Regeneration of somatic embryos from sweet orange (C. sinensis) protoplasts using semi-permeable membranes.</a> Plant Cell Tiss. Org. Cult. 84 (3), 353-357 (2006).</li>
<li>Sheng, X., et al. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s11240-011-0002-z">Protoplast isolation and plant regeneration of different doubled haploid lines of cauliflower (Brassica oleracea var. botrytis).</a> Plant Cell Tiss. Org. 107 (3), 513-520 (2011).</li>
<li>Grun, P., Chu, L. -J. <a target="_blank" href="https://www.jstor.org/stable/2442587">Development of plants from protoplasts of Solanum (Solanaceae).</a> Am. J. Bot. 65 (5), 538-543 (1978).</li>
<li>Davey, M. R., Anthony, P., Power, J. B., Lowe, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+protoplasts%3A+status+and+biotechnological+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Adv%22%5BJournal%5D)">Plant protoplasts: status and biotechnological perspectives.</a> Biotechnol. Adv. 23 (2), 131-171 (2005).</li>
<li>Pitzschke, A., Persak, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poinsettia+protoplasts-a+simple%2C+robust+and+efficient+system+for+transient+gene+expression+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+methods%22%5BJournal%5D)">Poinsettia protoplasts-a simple, robust and efficient system for transient gene expression studies.</a> Plant methods. 8 (1), 14(2012).</li>
<li>Yoo, S. -D., Cho, Y. -H., Sheen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+mesophyll+protoplasts%3A+a+versatile+cell+system+for+transient+gene+expression+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis.</a> Nat. Protoc. 2 (7), 1565(2007).</li>
<li>Sedivy, E. J., Wu, F., Hanzawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soybean+domestication%3A+the+origin%2C+genetic+architecture+and+molecular+bases%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">Soybean domestication: the origin, genetic architecture and molecular bases.</a> New Phytol. 214 (2), 539-553 (2017).</li>
<li>Yang, Y., Li, R., Qi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+analysis+of+plant+promoters+and+transcription+factors+by+agroinfiltration+of+tobacco+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">In vivo analysis of plant promoters and transcription factors by agroinfiltration of tobacco leaves.</a> Plant J. 22 (6), 543-551 (2000).</li>
<li>Marion, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+analysis+of+protein+subcellular+localization+and+interaction+using+high-throughput+transient+transformation+of+Arabidopsis+seedlings%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Systematic analysis of protein subcellular localization and interaction using high-throughput transient transformation of Arabidopsis seedlings.</a> Plant J. 56 (1), 169-179 (2008).</li>
<li>Wu, H. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AGROBEST%3A+an+efficient+Agrobacterium-mediated+transient+expression+method+for+versatile+gene+function+analyses+in+Arabidopsis+seedlings%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+methods%22%5BJournal%5D)">AGROBEST: an efficient Agrobacterium-mediated transient expression method for versatile gene function analyses in Arabidopsis seedlings.</a> Plant methods. 10 (1), 19(2014).</li>
<li>Govindarajulu, M., Elmore, J. M., Fester, T., Taylor, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+constitutive+viral+promoters+in+transgenic+soybean+roots+and+nodules%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Plant+Pathol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of constitutive viral promoters in transgenic soybean roots and nodules.</a> Mol Plant Pathol. 21 (8), 1027-1035 (2008).</li>
<li>Nagamatsu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+soybean+genes+involved+in+flavonoid+biosynthesis+by+virus-induced+gene+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnol.+J%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of soybean genes involved in flavonoid biosynthesis by virus-induced gene silencing.</a> Plant Biotechnol. J. 5 (6), 778-790 (2007).</li>
<li>Juvale, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+and+spatial+Bean+pod+mottle+virus-induced+gene+silencing+in+soybean%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant+Pathol%22%5BJournal%5D)">Temporal and spatial Bean pod mottle virus-induced gene silencing in soybean.</a> Mol. Plant Pathol. 13 (9), 1140-1148 (2012).</li>
<li>Zhang, C., Bradshaw, J. D., Whitham, S. A., Hill, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+an+efficient+multipurpose+bean+pod+mottle+virus+viral+vector+set+for+foreign+gene+expression+and+RNA+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">The development of an efficient multipurpose bean pod mottle virus viral vector set for foreign gene expression and RNA silencing.</a> Plant Physiol. 153 (1), 52-65 (2010).</li>
<li>Lin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mesophyll+protoplasts+from+mature+leaves+of+soybeans%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Isolation of mesophyll protoplasts from mature leaves of soybeans.</a> Plant Physiol. 73 (4), 1067-1069 (1983).</li>
<li>Yi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-repeat+MYB+transcription+factor%2C+GmMYB176%2C+regulates+CHS8+gene+expression+and+affects+isoflavonoid+biosynthesis+in+soybean%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">A single-repeat MYB transcription factor, GmMYB176, regulates CHS8 gene expression and affects isoflavonoid biosynthesis in soybean.</a> Plant J. 62 (6), 1019-1034 (2010).</li>
<li>Faria, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NAC+domain-containing+protein%2C+GmNAC6%2C+is+a+downstream+component+of+the+ER+stress-and+osmotic+stress-induced+NRP-mediated+cell-death+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">The NAC domain-containing protein, GmNAC6, is a downstream component of the ER stress-and osmotic stress-induced NRP-mediated cell-death signaling pathway.</a> BMC Plant Biol. 11 (1), 129(2011).</li>
<li>Kidokoro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soybean+DREB1%2FCBF-type+transcription+factors+function+in+heat+and+drought+as+well+as+cold+stress-responsive+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Soybean DREB1/CBF-type transcription factors function in heat and drought as well as cold stress-responsive gene expression.</a> Plant J. 81 (3), 505-518 (2015).</li>
<li>Sun, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+mutagenesis+in+soybean+using+the+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep-UK%22%5BJournal%5D)">Targeted mutagenesis in soybean using the CRISPR-Cas9 system.</a> Sci Rep-UK. 5, 10342(2015).</li>
<li>Karimi, M., Inzé, D., Depicker, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11992820">GATEWAY™ vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation.</a> Trends Plant Sci. 7 (5), 193-195 (2002).</li>
<li>Xia, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positional+cloning+and+characterization+reveal+the+molecular+basis+for+soybean+maturity+locus+E1+that+regulates+photoperiodic+flowering%5BTitle%5D)+AND+%22P.+Natl.+A.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Positional cloning and characterization reveal the molecular basis for soybean maturity locus E1 that regulates photoperiodic flowering.</a> P. Natl. A. Sci. USA. 109 (32), E2155-E2164 (2012).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.

Questo protocollo per l'isolamento di protoplasti di soia e l'applicazione di studi di espressione transitoria è stato accuratamente testato e funziona molto bene nel nostro laboratorio. Le procedure sono semplici e facili e richiedono apparecchiature ordinarie e minimo costo. Il nostro protocollo produce grandi quantità di protoplasti di uniforme, di alta qualità rispetto ai metodi precedentemente segnalati34,35,36,<...

Protoplasti sono cellule vegetali che hanno rimosse le pareti cellulari. Come mantengono la maggior parte delle caratteristiche e attività di cellule vegetali, protoplasti sono un sistema di buon modello di osservare e valutare diversi eventi cellulari e sono strumenti preziosi per studiare ibridazione somatica1 e impianto di rigenerazione2. Protoplasti sono stati anche ampiamente utilizzati per impianto trasformazione3,4,5, poiché le pareti cellulari altrimenti bloccherebbe il passaggio del DNA nella cellula. Protoplasti possiedono alcune delle risposte fisiologiche e processi cellulari di piante intatte, offrendo quindi un valore fondamentale nella ricerca di base per lo studio di proteine sottocellulari localizzazione6,7,8, interazioni proteina-proteina9,10e promotore attività11,12,13 in cellule vive.
L'isolamento di protoplasti di pianta in primo luogo è stato segnalato nel 196014 e i protocolli per l'isolamento e la trasformazione dei protoplasti sono stati sviluppati e ottimizzati. Una procedura standard di isolamento del protoplasto comporta il taglio delle foglie e la digestione enzimatica delle pareti cellulari, seguita dalla separazione dei protoplasti rilasciati da detriti del tessuto non digerito. Strategie di trasformazione include elettroporazione15,16, microinjection17,18e base di polietilenglicole (PEG)4,5,19 metodi. Una vasta gamma di specie sono stati segnalati successo per l'isolamento di protoplasti, compresi agrumi20, Brassica21, Solanaceae22 e altre piante ornamentali famiglie23,24. Mentre i tipi di tessuti diversi sono utilizzati in varie specie, un sistema di espressione transiente in protoplasti di Arabidopsis mesofillo (TEAMP) isolato dalle foglie della pianta modello Arabidopsis thaliana è stato affermata25 e ampiamente adottato per diverse applicazioni.
Soia (Glycine max (L.) Merr.) è una delle proteine più importanti e olio colture26. A differenza di Arabidopsis e riso, ottenimento di piante di soia transgenica è noto per essere piuttosto difficile e basso rendimento. Agrobacterium tumefaciens-mediata infiltrazione è stato popolarmente utilizzato per studi di espressione transiente in cellule epidermiche in tabacco27 e piantine in Arabidopsis28,29, considerando che Agrobacterium rhizogenes è stato utilizzato per la trasformazione delle radici pelosi in soia30. Approcci di silenziamento genica indotta da virus sono stati utilizzati per downregulation di destinazione geni31,32 e transitori espressione33 in maniera sistematica. Protoplasti forniscono una preziosa e versatile alternativa a questi approcci. Protoplasti possono essere ottenuti da materiali aboveground di soia e consentono l'espressione del transgene rapido e sincronizzato. Tuttavia, poiché l'isolamento iniziale successo dei protoplasti di soia nel 198334, ci sono stati rapporti limitati sull'applicazione dei protoplasti in soia35,36,37, 38, principalmente a causa della relativamente basse rese dei protoplasti di soia.
Qui, descriviamo un protocollo semplice ed efficiente per l'isolamento di protoplasti di soia e la sua applicazione per studi di espressione genica transitoria. Utilizzando foglie giovani unifoliate da piantine di soia, siamo stati in grado di ottenere grandi quantità di protoplasti vitali entro poche ore. Inoltre, abbiamo ottimizzato un metodo di trasformazione di PEG-calcio-mediata che è semplice e a basso costo per trasportare DNA in protoplasti di soia con alta efficienza.

<table><tbody><tr><td>MES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8250-100G</td><td></td></tr><tr><td>Cellulasi CELF</td><td>Worthington Biological Corporation</td><td>LS002611</td><td></td></tr><tr><td>Pectoliasi Y-23</td><td>BioWorld</td><td>9033-35-6</td><td></td></tr><tr><td>CELLULASI "ONOZUKA" R-10</td><td>yakult</td><td>10g</td><td></td></tr><tr><td>MACEROZYME R-10</td><td>yakult</td><td>10g</td><td></td></tr><tr><td>Mannitolo</td><td>ICN Biomedicals</td><td>152540</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher</td><td>C79-500g</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>NEB</td><td>R3535S</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5545-5G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653-1kg</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher</td><td>P217-500g</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8266-100g</td><td></td></tr><tr><td></td><td>PEG4000 Fluka</td><td>81240</td><td></td></tr><tr><td>nylon mesh</td><td>carolina</td><td>652222N</td><td></td></tr><tr><td>Piastre per colture tissutali</td><td>USA Scientific</td><td>CC7682-7506</td><td></td></tr><tr><td>Lamette da barba</td><td>Fisher</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>emacitometro</td><td>hausserscientific</td><td>1483</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>Kit miniprep plasmidico EZNA</td><td>Omega</td><td>D6942-01</td><td></td></tr><tr><td>Kit miniprep plasmidico GeneJET</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0502</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga 5810</td><td>eppendorf</td><td>5811000827</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga 5424</td><td>eppendorf</td><td>22620401</td><td></td></tr><tr><td>Jencons Powerpette Plus Pipet Controller</td><td>Jencons</td><td>14526-202</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocale Zeiss 710</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Provette per microfuge antiaderenti prive di RNasi, 1,5 mL</td><td></td><td>Ambion AM12450</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Provette da centrifuga</td><td>Denville</td><td>C1018-P</td><td></td></tr><tr><td>Provette da centrifuga da 50 mL</td><td>Denville</td><td>C1060-P</td><td></td></tr><tr><td>Siero per vitelli neonati</td><td>Thermo Scientific</td><td>16010159</td><td></td></tr><tr><td>Soil</td><td>Ingram's Nursery</td><td></td><td></td></tr><tr><td>perlite</td><td>Vigoro</td><td>100521091</td><td></td></tr><tr><td>Torpedo Sabbia</td><td>JKS Ventures</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB Brodo, Lennox (Polvere)</td><td>Fisher</td><td>BP1427-500</td><td></td></tr></tbody></table>

un metodo semplice per l'isolamento di protoplasti di soia e l'applicazione di analisi di espressione genica transitoria

A Simple Method for Isolation of Soybean Protoplasts and Application to Transient Gene Expression Analyses

Soia (Glycine max (L.) Merr.) è una specie di coltura importante ed è diventato un modello di legumi per gli studi delle vie genetiche e biochimiche. Pertanto, è importante stabilire un sistema di espressione genica transitoria efficiente in soia. Qui, segnaliamo un semplice protocollo per la preparazione dei protoplasti di soia e la sua applicazione per l'analisi funzionale transitorie. Abbiamo trovato che le foglie giovani unifoliate da piantine di soia ha provocato grandi quantità di protoplasti di alta qualità. Grazie all'ottimizzazione di un metodo di trasformazione PEG-calcio-mediata, abbiamo raggiunto l'efficienza di trasformazione alta utilizzando protoplasti unifoliate soia. Questo sistema fornisce un modello efficiente e versatile per l'esame dei complessi meccanismi di regolamentazione e di segnalazione in cellule di soia dal vivo e può aiutare per meglio comprendere diversi processi cellulari, inerente allo sviluppo e fisiologici dei legumi.

Diversi organi di soia 10 - giorno-vecchio sono stati testati per la preparazione del protoplasto (Figura 1) e i rendimenti sono stati osservati al microscopio (Figura 2). Pareti cellulari da ipocotile ed epicotyl erano appena digeriti, e alcune cellule siamo stati attaccati alla vicenda (Figura 2B, 2C). Nel cotiledone (Figura 2D) e radice (<strong class...

Abbiamo sviluppato un protocollo semplice ed efficiente per la preparazione di grandi quantità di protoplasti di soia studiare i complessi meccanismi di regolamentazione e di segnalazione in cellule vive.

Un metodo semplice per l'isolamento di protoplasti di soia e l'applicazione di analisi di espressione genica transitoria

Soybean (Glycine max (L.) Merr.) is an important crop species and has become a legume model for the studies of genetic and biochemical pathways. ...

L'obiettivo generale di questo metodo è quello di ottenere cellule di protoplasti di alta qualità dalla soia per esaminare i meccanismi di regolazione e segnalazione nelle cellule di soia vive. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nelle reti regolative, come ad esempio qual è il loro gene bersaglio immediato, il fattore di trasfusione aperto e qual è il loro partner interagente, aprire una proteina. Il vantaggio principale di questa tecnica è l'arte.Produce grandi quantità di cellule di protoplasti di soia uniformi ed è semplice e facile. In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché è molto difficile ottenere bei protoplasti dalle foglie di soia a meno che non si unifoli in una fase specifica. La selezione delle foglie in una fase di sviluppo appropriata è la chiave per il successo della preparazione dei protoplasti di soia.Taglia le foglie unifogliate appena espanse da piantine di soia di 10 giorni. Per assicurarsi che quando un campione fornisce un'elevata resa di protoplasti, raccogliere almeno tre campioni di foglie unifogliate in stadi di sviluppo leggermente diversi. Con una lama di rasoio fresca, rimuovi la nervatura centrale da ogni foglia unifogliata, quindi taglia i resti in strisce da 0,5 a un millimetro.Utilizzando un paio di pinze, trasferire delicatamente le strisce fogliari immediatamente in 10 millilitri di soluzione enzimatica appena preparata in una provetta da 15 millilitri. Aspirare e infiltrare le strisce fogliari per 15 minuti a temperatura ambiente. Incubare le strisce fogliari nella soluzione enzimatica con una leggera agitazione in condizioni di scarsa illuminazione per quattro-sei ore a temperatura ambiente.Quando i protoplasti vengono rilasciati, la soluzione enzimatica diventerà di colore giallo-verde. Controllare la soluzione di protoplasto enzimatico al microscopio con un ingrandimento di 10x per selezionare il campione con la migliore digestione del protoplasto. I protoplasti rilasciati sono di forma sferica, mentre le cellule non digerite hanno forme irregolari o ovali.Per fermare la digestione, versare delicatamente i 10 millilitri di soluzione di protoplasto enzimatico con la migliore digestione di protoplasti in un tubo da 50 millilitri e aggiungere 10 millilitri di soluzione W5 a temperatura ambiente. Capovolgere delicatamente il tubo alcune volte. Quindi, versare delicatamente la soluzione di protoplasto enzimatico in una rete di nylon pulita da 75 micron posta sopra un tubo da 50 millilitri per rimuovere i tessuti fogliari non digeriti.Quindi, centrifugare il flusso attraverso la soluzione di protoplasto enzimatico a 100 volte G per uno o due minuti a temperatura ambiente. Quindi, utilizzare una pipetta sierologica da 10 millilitri per rimuovere delicatamente il surnatante senza disturbare il pellet di protoplasto. Risospendere il protoplasto in una soluzione W5 raffreddata e mantenere il tubo da 50 millilitri sul ghiaccio.Dopo aver contato il numero di protoplasti su un emocitometro al microscopio, diluire a una concentrazione di due volte 10 al quinto protoplasto per millilitro in soluzione W5 refrigerata. Tenere il protoplasto in ghiaccio per 30 minuti. Centrifugare la sospensione a 100 volte G per uno o due minuti a temperatura ambiente.Quindi utilizzare una pipetta da un millilitro per rimuovere delicatamente la soluzione W5 senza disturbare il pellet di protoplasto. Risospendere il protoplasto in soluzione di MMG a temperatura ambiente ad una concentrazione di due volte 10 al quinto protoplasto per millilitro. Per preparare il protoplasto per la trasformazione, utilizzare puntali di pipette da 200 microlitri non tagliati per produrre aliquote da 100 microlitri di protoplasti in provette per microcentrifuga a bassa adesione da 1,5 millilitri.Mettere da parte un'aliquota che funga da controllo negativo. All'aliquota rimanente di protoplasti, aggiungere 10 microlitri di DNA plasmidico. Aggiungere lentamente 110 microlitri di soluzione di peg appena preparata sulla parete interna della provetta per microcentrifuga da 1,5 millilitri.Quindi capovolgere delicatamente e ruotare il tubo fino a quando la soluzione diventa omogenea. Incubare le miscele di trasformazione per 15 minuti a temperatura ambiente. Per fermare la trasformazione, aggiungere lentamente 400 microlitri di soluzione W5 a ciascuna provetta da 1,5 millilitri a temperatura ambiente e capovolgere delicatamente la provetta fino a quando la soluzione non diventa omogenea.Centrifugare le provette a 100 volte G per uno o due minuti a temperatura ambiente. Scartare il surnatante. Aggiungere un millilitro di soluzione WI a ciascun tubo.Rivestire la superficie del pozzetto di una piastra di coltura tissutale a sei pozzetti per evitare che i protoplasti si attacchino alla piastra. Aggiungere un millilitro di siero di vitello sterile al cinque percento in ciascun pozzetto e, dopo alcuni secondi, rimuovere il siero di vitello utilizzando una pipetta. Trasferire i protoplasti risospesi nei pozzetti della piastra di coltura e coprire la piastra con un coperchio.Prima della raccolta, incubare i protoplasti a temperatura ambiente per due giorni al buio. Dopo due giorni, trasferire la soluzione di protoplasto in una provetta per microcentrifuga a bassa adesione da 1,5 millilitri. Centrifugare le provette a 100 volte G per uno o due minuti a temperatura ambiente.Rimuovere il surnatante utilizzando una pipetta. Trasferire 10 microlitri di protoplasto su un vetrino. Osservare i segnali fluorescenti sotto fluorescenza o microscopia confocale utilizzando protoplasti non trasformati come controllo negativo.Le cellule di protoplasto sono state preparate da diversi organi di semi di soia di 10 giorni e osservate al microscopio. Le pareti cellulari dell'ipocaudale e dell'epicaudale erano difficilmente digeribili. E alcune cellule sono rimaste attaccate l'una all'altra.Nel piombo caudale e nella radice, le pareti cellulari sono state rimosse solo in una piccola porzione delle cellule. Al contrario, è stato osservato un gran numero di protoplasti quando è stato utilizzato l'unifoliato. Le piantine in questa foto da sinistra a destra illustrano foglie unifogliate che non sono espanse, appena espanse o completamente espanse.Mentre sia le foglie unifogliate non espanse che quelle appena espanse hanno portato ad alte rese di protoplasti, la dimensione dei protoplasti dell'unifoliato appena espanso era più uniforme rispetto all'unifoliato non espanso. Per l'unifoliato completamente espanso, le pareti cellulari erano ancora intatte nella maggior parte delle cellule. L'analisi di una serie di diverse quantità di DNA plasmidico ha suggerito che quantità maggiori di DNA hanno portato a una maggiore efficienza di trasformazione.Immagini confocali di protoplasti di soia trasformati con il costrutto che esprime GFP fuso al gene E1 specifico del legume, hanno mostrato la localizzazione nucleare della proteina di fusione GFP E1, in linea con lo studio precedente che utilizzava il sistema protoplasto Arabidopsis. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di ottimizzare empiricamente ogni condizione sperimentale, come la selezione del giusto stadio del materiale fogliare, la lunghezza del tempo di digestione della parete cellulare, l'età di concentrazione e la quantità di DNA plasmidico per la trasformazione. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la replicazione dell'RNA e delle proteine per rispondere a ulteriori domande come quali geni o quali proteine sono regolati o non regolati?Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come ottenere cellule di protoplasti di soia di alta qualità.

a-simple-method-for-isolation-soybean-protoplasts-application-to

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Questo video mostra una procedura per isolare protoplasti intatti da tessuti di 14-giorno-vecchie piantine di Arabidopsis. Dato che il protoplasti isolati rimangono intatte per almeno 96 ore e sono isolati da piantine invece di piante mature di un mese-vecchia, questa procedura accelera i test che richiedono protoplasti intatti.

Isolamento di protoplasti da tessuti di 14-giorni di età piantine di Arabidopsis thaliana</em

Riportiamo un metodo per l'introduzione, il monitoraggio e l'analisi quantitativa di espressione GFP nelle cellule vegetali. Questo metodo utilizza un sistema progettato su misura per la robotica semi-continua raccolta di immagini da un gran numero di campioni, nel corso del tempo. Abbiamo anche dimostrare l'uso di ImageJ e ImageReady per l'analisi delle serie di immagini.

Robotica e Image Analysis dinamica per gli Studi di espressione genica nei tessuti vegetali

Le basi molecolari delle risposte fitocromo spazio-specifica è indagato con le piante transgeniche che presentano tessuti e carenze fitocromo organo-specifiche. L'isolamento di cellule specifiche esporre indotte esaurimento fitocromo cromoforo da Fluorescence-Activated cella Ordinamento seguita da analisi di microarray viene utilizzata per identificare i geni coinvolti nello spazio-risposte specifiche fitocromo.

Indagare tessuti e risposte fitocromo organo-specifici utilizzando FACS-Cell-assistita di tipo profili specifici di espressione in Arabidopsis thaliana</em

Piante offrono un sistema innovativo per la produzione di proteine ​​farmaceutiche su scala commerciale che è più scalabile, economica e sicura rispetto paradigmi attuale espressione. In questo studio, riportiamo un approccio semplice e conveniente, ma scalabile per introdurre target-gene...

Agroinfiltration efficiente di impianti di alto livello espressione transiente di proteine ​​ricombinanti

Una metodologia high-throughput, la produzione di protoplasti di tabacco automatizzata e la trasformazione è descritto. Il sistema robotico consente l'espressione genica massicciamente parallelo e la scoperta nel sistema modello BY-2 che dovrebbe essere traducibile di colture non-modello.

Una piattaforma robotica per high-throughput Protoplast Isolamento e Trasformazione

I metodi esistenti per la modifica delle piante hanno un'applicabilità limitata. La nuova tecnologia derivata dai peptidi qui proposta promette semplicità ed efficienza nell'introduzione di proteine o geni esogeni nei compartimenti intracellulari desiderati di piante intatte.

Peptide di derivazione Metodo di Trasporto geni e proteine ​​Attraverso cellulari e barriere organelli in Piante

Connessioni intercellulari di pianta, la Plasmodesmi (Pd), giocano un ruolo centrale nella pianta interazioni pianta-virus e di fisiologia. Critica ai trasporti Pd sono smistamento segnali che indirizzano proteine al Pd. Tuttavia, la nostra conoscenza di queste sequenze è ancora nella sua infanzia. Descriviamo una strategia per identificare i segnali di localizzazione di Pd in proteine Pd-mirati.

Identificazione di sequenze di localizzazione Plasmodesmal in proteine In Planta

Qui, presentiamo un protocollo ad alto rendimento per trasfettare transitoriamente milioni di protoplasti di mais per testare grandi librerie di plasmidi nelle cellule di mesofillo del mais.

Trasfezione scalabile dei protoplasti mesofilli di mais

Qui, presentiamo un protocollo per la produzione ad alta efficienza di radici pelose di soia transgeniche.

Trasformazione della radice pelosa di soia per l'analisi della funzione genica

Questa procedura descrive come stabilire colture primarie di cellule emopoietiche dal midollo osseo murino ed è seguita dalla trasfezione con il gene Pulser sistema di elettroporazione MXCell.

La preparazione di colture primarie di cellule emopoietiche dal midollo osseo murino per elettroporazione

Impara un metodo semplice per isolare protoplasti di soia di alta qualità per studiare meccanismi regolatori e di segnalazione nelle cellule vegetali vive. Questa tecnica produce grandi quantità di cellule uniformi.

Un metodo semplice per l'isolamento di protoplasti di soia e l'applicazione di analisi di espressione genica transitoria

Esplora altri video