Un metodo semplice per l'isolamento di protoplasti di soia e l'applicazione di analisi di espressione genica transitoria

Abbiamo sviluppato un protocollo semplice ed efficiente per la preparazione di grandi quantità di protoplasti di soia studiare i complessi meccanismi di regolamentazione e di segnalazione in cellule vive.

L'obiettivo generale di questo metodo è quello di ottenere cellule di protoplasti di alta qualità dalla soia per esaminare i meccanismi di regolazione e segnalazione nelle cellule di soia vive. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nelle reti regolative, come ad esempio qual è il loro gene bersaglio immediato, il fattore di trasfusione aperto e qual è il loro partner interagente, aprire una proteina. Il vantaggio principale di questa tecnica è l'arte.

Produce grandi quantità di cellule di protoplasti di soia uniformi ed è semplice e facile. In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché è molto difficile ottenere bei protoplasti dalle foglie di soia a meno che non si unifoli in una fase specifica. La selezione delle foglie in una fase di sviluppo appropriata è la chiave per il successo della preparazione dei protoplasti di soia.

Taglia le foglie unifogliate appena espanse da piantine di soia di 10 giorni. Per assicurarsi che quando un campione fornisce un'elevata resa di protoplasti, raccogliere almeno tre campioni di foglie unifogliate in stadi di sviluppo leggermente diversi. Con una lama di rasoio fresca, rimuovi la nervatura centrale da ogni foglia unifogliata, quindi taglia i resti in strisce da 0,5 a un millimetro.

Utilizzando un paio di pinze, trasferire delicatamente le strisce fogliari immediatamente in 10 millilitri di soluzione enzimatica appena preparata in una provetta da 15 millilitri. Aspirare e infiltrare le strisce fogliari per 15 minuti a temperatura ambiente. Incubare le strisce fogliari nella soluzione enzimatica con una leggera agitazione in condizioni di scarsa illuminazione per quattro-sei ore a temperatura ambiente.

Quando i protoplasti vengono rilasciati, la soluzione enzimatica diventerà di colore giallo-verde. Controllare la soluzione di protoplasto enzimatico al microscopio con un ingrandimento di 10x per selezionare il campione con la migliore digestione del protoplasto. I protoplasti rilasciati sono di forma sferica, mentre le cellule non digerite hanno forme irregolari o ovali.

Per fermare la digestione, versare delicatamente i 10 millilitri di soluzione di protoplasto enzimatico con la migliore digestione di protoplasti in un tubo da 50 millilitri e aggiungere 10 millilitri di soluzione W5 a temperatura ambiente. Capovolgere delicatamente il tubo alcune volte. Quindi, versare delicatamente la soluzione di protoplasto enzimatico in una rete di nylon pulita da 75 micron posta sopra un tubo da 50 millilitri per rimuovere i tessuti fogliari non digeriti.

Quindi, centrifugare il flusso attraverso la soluzione di protoplasto enzimatico a 100 volte G per uno o due minuti a temperatura ambiente. Quindi, utilizzare una pipetta sierologica da 10 millilitri per rimuovere delicatamente il surnatante senza disturbare il pellet di protoplasto. Risospendere il protoplasto in una soluzione W5 raffreddata e mantenere il tubo da 50 millilitri sul ghiaccio.

Dopo aver contato il numero di protoplasti su un emocitometro al microscopio, diluire a una concentrazione di due volte 10 al quinto protoplasto per millilitro in soluzione W5 refrigerata. Tenere il protoplasto in ghiaccio per 30 minuti. Centrifugare la sospensione a 100 volte G per uno o due minuti a temperatura ambiente.

Quindi utilizzare una pipetta da un millilitro per rimuovere delicatamente la soluzione W5 senza disturbare il pellet di protoplasto. Risospendere il protoplasto in soluzione di MMG a temperatura ambiente ad una concentrazione di due volte 10 al quinto protoplasto per millilitro. Per preparare il protoplasto per la trasformazione, utilizzare puntali di pipette da 200 microlitri non tagliati per produrre aliquote da 100 microlitri di protoplasti in provette per microcentrifuga a bassa adesione da 1,5 millilitri.

Mettere da parte un'aliquota che funga da controllo negativo. All'aliquota rimanente di protoplasti, aggiungere 10 microlitri di DNA plasmidico. Aggiungere lentamente 110 microlitri di soluzione di peg appena preparata sulla parete interna della provetta per microcentrifuga da 1,5 millilitri.

Quindi capovolgere delicatamente e ruotare il tubo fino a quando la soluzione diventa omogenea. Incubare le miscele di trasformazione per 15 minuti a temperatura ambiente. Per fermare la trasformazione, aggiungere lentamente 400 microlitri di soluzione W5 a ciascuna provetta da 1,5 millilitri a temperatura ambiente e capovolgere delicatamente la provetta fino a quando la soluzione non diventa omogenea.

Centrifugare le provette a 100 volte G per uno o due minuti a temperatura ambiente. Scartare il surnatante. Aggiungere un millilitro di soluzione WI a ciascun tubo.

Rivestire la superficie del pozzetto di una piastra di coltura tissutale a sei pozzetti per evitare che i protoplasti si attacchino alla piastra. Aggiungere un millilitro di siero di vitello sterile al cinque percento in ciascun pozzetto e, dopo alcuni secondi, rimuovere il siero di vitello utilizzando una pipetta. Trasferire i protoplasti risospesi nei pozzetti della piastra di coltura e coprire la piastra con un coperchio.

Prima della raccolta, incubare i protoplasti a temperatura ambiente per due giorni al buio. Dopo due giorni, trasferire la soluzione di protoplasto in una provetta per microcentrifuga a bassa adesione da 1,5 millilitri. Centrifugare le provette a 100 volte G per uno o due minuti a temperatura ambiente.

Rimuovere il surnatante utilizzando una pipetta. Trasferire 10 microlitri di protoplasto su un vetrino. Osservare i segnali fluorescenti sotto fluorescenza o microscopia confocale utilizzando protoplasti non trasformati come controllo negativo.

Le cellule di protoplasto sono state preparate da diversi organi di semi di soia di 10 giorni e osservate al microscopio. Le pareti cellulari dell'ipocaudale e dell'epicaudale erano difficilmente digeribili. E alcune cellule sono rimaste attaccate l'una all'altra.

Nel piombo caudale e nella radice, le pareti cellulari sono state rimosse solo in una piccola porzione delle cellule. Al contrario, è stato osservato un gran numero di protoplasti quando è stato utilizzato l'unifoliato. Le piantine in questa foto da sinistra a destra illustrano foglie unifogliate che non sono espanse, appena espanse o completamente espanse.

Mentre sia le foglie unifogliate non espanse che quelle appena espanse hanno portato ad alte rese di protoplasti, la dimensione dei protoplasti dell'unifoliato appena espanso era più uniforme rispetto all'unifoliato non espanso. Per l'unifoliato completamente espanso, le pareti cellulari erano ancora intatte nella maggior parte delle cellule. L'analisi di una serie di diverse quantità di DNA plasmidico ha suggerito che quantità maggiori di DNA hanno portato a una maggiore efficienza di trasformazione.

Immagini confocali di protoplasti di soia trasformati con il costrutto che esprime GFP fuso al gene E1 specifico del legume, hanno mostrato la localizzazione nucleare della proteina di fusione GFP E1, in linea con lo studio precedente che utilizzava il sistema protoplasto Arabidopsis. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di ottimizzare empiricamente ogni condizione sperimentale, come la selezione del giusto stadio del materiale fogliare, la lunghezza del tempo di digestione della parete cellulare, l'età di concentrazione e la quantità di DNA plasmidico per la trasformazione. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la replicazione dell'RNA e delle proteine per rispondere a ulteriori domande come quali geni o quali proteine sono regolati o non regolati?

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come ottenere cellule di protoplasti di soia di alta qualità.