Name: Un metodo semplice per lisolamento di protoplasti di soia e lapplicazione di analisi di espressione genica transitoria (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: Impara un metodo semplice per isolare protoplasti di soia di alta qualità per studiare meccanismi regolatori e di segnalazione nelle cellule vegetali vive. Questa tecnica produce grandi quantità di cellule uniformi.

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Questo lavoro è stato supportato dal programma di ricerca del genoma di pianta dalla National Science Foundation (NSF-PGRP-IOS-1339388).

1. la crescita delle piante
<ol><li>Seminare i semi di soia 5-10 (Williams 82) in un vaso di 13 cm in serra in condizioni di giorno lungo (16 h luce alle 1.500 µmol m-2 s-1) a 25 ° C sul mix di terreno personalizzato per la soia (1:1:1 rapporto di sabbia del suolo, la perlite e la torpedine).</li>
</ol>2. preparazione del DNA del plasmide
<ol><li>Utilizzando una pipetta sterile o uno stuzzicadenti, scegli una singola Colonia o glicerolo congelati stock di e. coli che trasportano il plasmide contenente il gene di interesse e inoculare esso in 20 mL di terreno liquido di Luria-Bertani (LB) con gli antibiotici adatti in un pallone da 50 mL.</li>
	<li>Incubare la beuta a 37 ° C durante la notte su un agitatore. Raccogliere i batteri da centrifugazione la sospensione a 12.000 x g a temperatura ambiente per 5 minuti e scartare il surnatante. Estrarre e purificare il plasmide seguendo la procedura del produttore di un kit di preparazione del plasmide.</li>
</ol>3. isolamento di protoplasti
<ol><li>Tagliare foglie unifoliate recentemente ampliate da piantine di soia 10 - giorno di vita (Figura 1). Nota: Selezione di foglie in una fase inerente allo sviluppo appropriata è la chiave per il successo per la preparazione di protoplasti di soia. Utilizzare solo foglie appena ampliati alle prime fasi dello sviluppo. Come lascia maturo, pareti cellulari diventano più difficile da digerire.</li>
	<li>Con una lama di rasoio fresca, togliere la foglia unifoliata e quindi tagliare i resti in 0,5-1 mm strisce la nervatura centrale. Nota: Due foglie unifoliate digeriti in 10 mL di soluzione di enzima darà protoplasti sufficienti per più di 10 trasformazioni.</li>
	<li>Usando un paio di pinze, trasferimento la foglia strisce immediatamente e delicatamente in 10 mL di soluzione enzimatica preparata al momento (tabella 1) in una provetta da 15 mL. Vuoto si infiltra in foglia strisce per 15 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Incubare le strisce di foglia nella soluzione enzimatica con agitazione delicata (40 giri) sotto luce bassa per 4-6 h a temperatura ambiente. Assicurarsi che la soluzione di enzima diventa giallo-verde come protoplasti vengono rilasciati. Verificare la soluzione di enzima/protoplasti al microscopio (X10). Nota: I protoplasti rilasciati sono sferici a forma, mentre le cellule non digerite hanno forma ovale o irregolare.</li>
	<li>Trasferire i 10 mL di soluzione di enzima/protoplasti in una provetta da 50 mL versando delicatamente e aggiungere 10 mL di soluzione di W5 (tabella 1) a temperatura ambiente per interrompere la digestione. Capovolgere delicatamente la provetta un paio di volte. Versare delicatamente la soluzione enzima/protoplasti su una maglia di nylon pulito 75 µm posizionata sopra un tubo da 50 mL per rimuovere i tessuti della foglia non digerito.</li>
	<li>Centrifugare la soluzione di flusso continuo enzima/protoplasti a 100 x g nel tubo 50 mL per 1-2 min a temperatura ambiente. Rimuovere delicatamente il supernatante utilizzando una pipetta sierologica 10ml senza disturbare il pellet di protoplasti.</li>
	<li>Risospendere i protoplasti e contando il numero di protoplasti su un emocitometro sotto il microscopio (x10), diluire ad una concentrazione di 2 x 105 mL-1 in soluzione di W5 refrigerati a 4 ° C. Mantenere i protoplasti su ghiaccio per 30 min.</li>
	<li>Centrifugare la sospensione a 100 x g per 1-2 min a temperatura ambiente e rimuovere delicatamente la soluzione W5 utilizzando una pipetta da 1 mL senza disturbare il pellet di protoplasti. Risospendere i protoplasti nella soluzione MMG (tabella 1) ad una concentrazione di 2 x 105 mL-1 a temperatura ambiente.</li>
</ol>4. trasformazione di protoplasti
<ol><li>Fai aliquote di 100 µ l dei protoplasti (2 x 104 protoplasti a 2 x 105 mL-1) in 1,5 mL bassa adesione per microcentrifuga utilizzando puntali per pipette uncut 200 µ l. Mettere un'aliquota da parte per servire come controllo negativo. Aggiungere 10 µ l di plasmide (10-20 µ g) in ciascuna dell'aliquota resto dei protoplasti.</li>
	<li>Aggiungere lentamente 110 µ l di soluzione preparata di PEG (tabella 1) sulla parete interna del tubo per microcentrifuga da 1,5 mL e quindi capovolgere delicatamente e ruotare il tubo fino a quando la soluzione diventa omogenea.</li>
	<li>Incubare la miscela di trasformazione a temperatura ambiente per 15 min.</li>
	<li>Per fermare la trasformazione, lentamente aggiungere 400 µ l di soluzione di W5 per la provetta da 1,5 mL a temperatura ambiente e capovolgere delicatamente la provetta fino a quando la soluzione diventa omogenea. Centrifugare la provetta a 100 g per 1-2 min a temperatura ambiente e scartare il surnatante con una pipetta.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di soluzione WI (tabella 1) al tubo e risospendere pipettando delicatamente 1 - 2 volte. Aggiungere 1 mL di siero di vitello sterile (vol/vol) 5% in ogni pozzetto di una piastra di coltura del tessuto 6 pozzetti per rivestire la superficie ed evitare i protoplasti di attaccarsi alla piastra.</li>
	<li>Dopo pochi secondi, scartare il siero di vitello utilizzando una pipetta. Trasferire i protoplasti sedimento in un pozzetto della piastra di coltura. Coprire la piastra con un coperchio.</li>
</ol>5. protoplasti incubazione e raccolta
<ol><li>Incubare i protoplasti a temperatura ambiente per 1-2 giorni al buio. Nota: Abbiamo trovato che due-giorni di incubazione produce più forte segnale di proteina fluorescente in generale rispetto ad un giorno incubazione, e che il segnale di proteina fluorescente può durare fino a 3-4 giorni.</li>
	<li>Trasferire la soluzione di protoplasti di un tubo del microcentrifuge bassa adesione di 1,5 mL. Centrifugare la provetta a 100 x g per 1-2 min a temperatura ambiente per raccogliere protoplasti. Rimuovere il surnatante con una pipetta e trasferire 10 protoplasti µ l su una lastra di vetro.</li>
	<li>Osservare il segnale fluorescente sotto fluorescenza o microscopia confocale. Utilizzare non trasformate protoplasti come controllo negativo (non dovrebbe essere osservato nessun segnale).</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.

Questo protocollo per l'isolamento di protoplasti di soia e l'applicazione di studi di espressione transitoria è stato accuratamente testato e funziona molto bene nel nostro laboratorio. Le procedure sono semplici e facili e richiedono apparecchiature ordinarie e minimo costo. Il nostro protocollo produce grandi quantità di protoplasti di uniforme, di alta qualità rispetto ai metodi precedentemente segnalati34,35,36,<...

Protoplasti sono cellule vegetali che hanno rimosse le pareti cellulari. Come mantengono la maggior parte delle caratteristiche e attività di cellule vegetali, protoplasti sono un sistema di buon modello di osservare e valutare diversi eventi cellulari e sono strumenti preziosi per studiare ibridazione somatica1 e impianto di rigenerazione2. Protoplasti sono stati anche ampiamente utilizzati per impianto trasformazione3,4,5, poiché le pareti cellulari altrimenti bloccherebbe il passaggio del DNA nella cellula. Protoplasti possiedono alcune delle risposte fisiologiche e processi cellulari di piante intatte, offrendo quindi un valore fondamentale nella ricerca di base per lo studio di proteine sottocellulari localizzazione6,7,8, interazioni proteina-proteina9,10e promotore attività11,12,13 in cellule vive.
L'isolamento di protoplasti di pianta in primo luogo è stato segnalato nel 196014 e i protocolli per l'isolamento e la trasformazione dei protoplasti sono stati sviluppati e ottimizzati. Una procedura standard di isolamento del protoplasto comporta il taglio delle foglie e la digestione enzimatica delle pareti cellulari, seguita dalla separazione dei protoplasti rilasciati da detriti del tessuto non digerito. Strategie di trasformazione include elettroporazione15,16, microinjection17,18e base di polietilenglicole (PEG)4,5,19 metodi. Una vasta gamma di specie sono stati segnalati successo per l'isolamento di protoplasti, compresi agrumi20, Brassica21, Solanaceae22 e altre piante ornamentali famiglie23,24. Mentre i tipi di tessuti diversi sono utilizzati in varie specie, un sistema di espressione transiente in protoplasti di Arabidopsis mesofillo (TEAMP) isolato dalle foglie della pianta modello Arabidopsis thaliana è stato affermata25 e ampiamente adottato per diverse applicazioni.
Soia (Glycine max (L.) Merr.) è una delle proteine più importanti e olio colture26. A differenza di Arabidopsis e riso, ottenimento di piante di soia transgenica è noto per essere piuttosto difficile e basso rendimento. Agrobacterium tumefaciens-mediata infiltrazione è stato popolarmente utilizzato per studi di espressione transiente in cellule epidermiche in tabacco27 e piantine in Arabidopsis28,29, considerando che Agrobacterium rhizogenes è stato utilizzato per la trasformazione delle radici pelosi in soia30. Approcci di silenziamento genica indotta da virus sono stati utilizzati per downregulation di destinazione geni31,32 e transitori espressione33 in maniera sistematica. Protoplasti forniscono una preziosa e versatile alternativa a questi approcci. Protoplasti possono essere ottenuti da materiali aboveground di soia e consentono l'espressione del transgene rapido e sincronizzato. Tuttavia, poiché l'isolamento iniziale successo dei protoplasti di soia nel 198334, ci sono stati rapporti limitati sull'applicazione dei protoplasti in soia35,36,37, 38, principalmente a causa della relativamente basse rese dei protoplasti di soia.
Qui, descriviamo un protocollo semplice ed efficiente per l'isolamento di protoplasti di soia e la sua applicazione per studi di espressione genica transitoria. Utilizzando foglie giovani unifoliate da piantine di soia, siamo stati in grado di ottenere grandi quantità di protoplasti vitali entro poche ore. Inoltre, abbiamo ottimizzato un metodo di trasformazione di PEG-calcio-mediata che è semplice e a basso costo per trasportare DNA in protoplasti di soia con alta efficienza.

<table><tbody><tr><td>MES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8250-100G</td><td></td></tr><tr><td>Cellulasi CELF</td><td>Worthington Biological Corporation</td><td>LS002611</td><td></td></tr><tr><td>Pectoliasi Y-23</td><td>BioWorld</td><td>9033-35-6</td><td></td></tr><tr><td>CELLULASI "ONOZUKA" R-10</td><td>yakult</td><td>10g</td><td></td></tr><tr><td>MACEROZYME R-10</td><td>yakult</td><td>10g</td><td></td></tr><tr><td>Mannitolo</td><td>ICN Biomedicals</td><td>152540</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher</td><td>C79-500g</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>NEB</td><td>R3535S</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5545-5G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653-1kg</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher</td><td>P217-500g</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8266-100g</td><td></td></tr><tr><td></td><td>PEG4000 Fluka</td><td>81240</td><td></td></tr><tr><td>nylon mesh</td><td>carolina</td><td>652222N</td><td></td></tr><tr><td>Piastre per colture tissutali</td><td>USA Scientific</td><td>CC7682-7506</td><td></td></tr><tr><td>Lamette da barba</td><td>Fisher</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>emacitometro</td><td>hausserscientific</td><td>1483</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>Kit miniprep plasmidico EZNA</td><td>Omega</td><td>D6942-01</td><td></td></tr><tr><td>Kit miniprep plasmidico GeneJET</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0502</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga 5810</td><td>eppendorf</td><td>5811000827</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga 5424</td><td>eppendorf</td><td>22620401</td><td></td></tr><tr><td>Jencons Powerpette Plus Pipet Controller</td><td>Jencons</td><td>14526-202</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocale Zeiss 710</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Provette per microfuge antiaderenti prive di RNasi, 1,5 mL</td><td></td><td>Ambion AM12450</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Provette da centrifuga</td><td>Denville</td><td>C1018-P</td><td></td></tr><tr><td>Provette da centrifuga da 50 mL</td><td>Denville</td><td>C1060-P</td><td></td></tr><tr><td>Siero per vitelli neonati</td><td>Thermo Scientific</td><td>16010159</td><td></td></tr><tr><td>Soil</td><td>Ingram's Nursery</td><td></td><td></td></tr><tr><td>perlite</td><td>Vigoro</td><td>100521091</td><td></td></tr><tr><td>Torpedo Sabbia</td><td>JKS Ventures</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB Brodo, Lennox (Polvere)</td><td>Fisher</td><td>BP1427-500</td><td></td></tr></tbody></table>

un metodo semplice per l'isolamento di protoplasti di soia e l'applicazione di analisi di espressione genica transitoria

A Simple Method for Isolation of Soybean Protoplasts and Application to Transient Gene Expression Analyses

Soia (Glycine max (L.) Merr.) è una specie di coltura importante ed è diventato un modello di legumi per gli studi delle vie genetiche e biochimiche. Pertanto, è importante stabilire un sistema di espressione genica transitoria efficiente in soia. Qui, segnaliamo un semplice protocollo per la preparazione dei protoplasti di soia e la sua applicazione per l'analisi funzionale transitorie. Abbiamo trovato che le foglie giovani unifoliate da piantine di soia ha provocato grandi quantità di protoplasti di alta qualità. Grazie all'ottimizzazione di un metodo di trasformazione PEG-calcio-mediata, abbiamo raggiunto l'efficienza di trasformazione alta utilizzando protoplasti unifoliate soia. Questo sistema fornisce un modello efficiente e versatile per l'esame dei complessi meccanismi di regolamentazione e di segnalazione in cellule di soia dal vivo e può aiutare per meglio comprendere diversi processi cellulari, inerente allo sviluppo e fisiologici dei legumi.

Diversi organi di soia 10 - giorno-vecchio sono stati testati per la preparazione del protoplasto (Figura 1) e i rendimenti sono stati osservati al microscopio (Figura 2). Pareti cellulari da ipocotile ed epicotyl erano appena digeriti, e alcune cellule siamo stati attaccati alla vicenda (Figura 2B, 2C). Nel cotiledone (Figura 2D) e radice (<strong class...

Abbiamo sviluppato un protocollo semplice ed efficiente per la preparazione di grandi quantità di protoplasti di soia studiare i complessi meccanismi di regolamentazione e di segnalazione in cellule vive.

Un metodo semplice per l'isolamento di protoplasti di soia e l'applicazione di analisi di espressione genica transitoria

Soybean (Glycine max (L.) Merr.) is an important crop species and has become a legume model for the studies of genetic and biochemical pathways. ...

L'obiettivo generale di questo metodo è quello di ottenere cellule di protoplasti di alta qualità dalla soia per esaminare i meccanismi di regolazione e segnalazione nelle cellule di soia vive. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nelle reti regolative, come ad esempio qual è il loro gene bersaglio immediato, il fattore di trasfusione aperto e qual è il loro partner interagente, aprire una proteina. Il vantaggio principale di questa tecnica è l'arte.Produce grandi quantità di cellule di protoplasti di soia uniformi ed è semplice e facile. In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché è molto difficile ottenere bei protoplasti dalle foglie di soia a meno che non si unifoli in una fase specifica. La selezione delle foglie in una fase di sviluppo appropriata è la chiave per il successo della preparazione dei protoplasti di soia.Taglia le foglie unifogliate appena espanse da piantine di soia di 10 giorni. Per assicurarsi che quando un campione fornisce un'elevata resa di protoplasti, raccogliere almeno tre campioni di foglie unifogliate in stadi di sviluppo leggermente diversi. Con una lama di rasoio fresca, rimuovi la nervatura ce

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Questo video mostra una procedura per isolare protoplasti intatti da tessuti di 14-giorno-vecchie piantine di Arabidopsis. Dato che il protoplasti isolati rimangono intatte per almeno 96 ore e sono isolati da piantine invece di piante mature di un mese-vecchia, questa procedura accelera i test che richiedono protoplasti intatti.

Isolamento di protoplasti da tessuti di 14-giorni di età piantine di Arabidopsis thaliana</em

Riportiamo un metodo per l'introduzione, il monitoraggio e l'analisi quantitativa di espressione GFP nelle cellule vegetali. Questo metodo utilizza un sistema progettato su misura per la robotica semi-continua raccolta di immagini da un gran numero di campioni, nel corso del tempo. Abbiamo anche dimostrare l'uso di ImageJ e ImageReady per l'analisi delle serie di immagini.

Robotica e Image Analysis dinamica per gli Studi di espressione genica nei tessuti vegetali

Le basi molecolari delle risposte fitocromo spazio-specifica è indagato con le piante transgeniche che presentano tessuti e carenze fitocromo organo-specifiche. L'isolamento di cellule specifiche esporre indotte esaurimento fitocromo cromoforo da Fluorescence-Activated cella Ordinamento seguita da analisi di microarray viene utilizzata per identificare i geni coinvolti nello spazio-risposte specifiche fitocromo.

Indagare tessuti e risposte fitocromo organo-specifici utilizzando FACS-Cell-assistita di tipo profili specifici di espressione in Arabidopsis thaliana</em

Piante offrono un sistema innovativo per la produzione di proteine ​​farmaceutiche su scala commerciale che è più scalabile, economica e sicura rispetto paradigmi attuale espressione. In questo studio, riportiamo un approccio semplice e conveniente, ma scalabile per introdurre target-gene...

Agroinfiltration efficiente di impianti di alto livello espressione transiente di proteine ​​ricombinanti

Una metodologia high-throughput, la produzione di protoplasti di tabacco automatizzata e la trasformazione è descritto. Il sistema robotico consente l'espressione genica massicciamente parallelo e la scoperta nel sistema modello BY-2 che dovrebbe essere traducibile di colture non-modello.

Una piattaforma robotica per high-throughput Protoplast Isolamento e Trasformazione

I metodi esistenti per la modifica delle piante hanno un'applicabilità limitata. La nuova tecnologia derivata dai peptidi qui proposta promette semplicità ed efficienza nell'introduzione di proteine o geni esogeni nei compartimenti intracellulari desiderati di piante intatte.

Peptide di derivazione Metodo di Trasporto geni e proteine ​​Attraverso cellulari e barriere organelli in Piante

Connessioni intercellulari di pianta, la Plasmodesmi (Pd), giocano un ruolo centrale nella pianta interazioni pianta-virus e di fisiologia. Critica ai trasporti Pd sono smistamento segnali che indirizzano proteine al Pd. Tuttavia, la nostra conoscenza di queste sequenze è ancora nella sua infanzia. Descriviamo una strategia per identificare i segnali di localizzazione di Pd in proteine Pd-mirati.

Identificazione di sequenze di localizzazione Plasmodesmal in proteine In Planta

Qui, presentiamo un protocollo ad alto rendimento per trasfettare transitoriamente milioni di protoplasti di mais per testare grandi librerie di plasmidi nelle cellule di mesofillo del mais.

Trasfezione scalabile dei protoplasti mesofilli di mais

Qui, presentiamo un protocollo per la produzione ad alta efficienza di radici pelose di soia transgeniche.

Trasformazione della radice pelosa di soia per l'analisi della funzione genica

Questa procedura descrive come stabilire colture primarie di cellule emopoietiche dal midollo osseo murino ed è seguita dalla trasfezione con il gene Pulser sistema di elettroporazione MXCell.

La preparazione di colture primarie di cellule emopoietiche dal midollo osseo murino per elettroporazione

Impara un metodo semplice per isolare protoplasti di soia di alta qualità per studiare meccanismi regolatori e di segnalazione nelle cellule vegetali vive. Questa tecnica produce grandi quantità di cellule uniformi.

Un metodo semplice per l'isolamento di protoplasti di soia e l'applicazione di analisi di espressione genica transitoria

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