Chromosomics: Rilevamento delle alterazioni numeriche e strutturali in tutti i 24 cromosomi umani simultaneamente utilizzando un nuovo metodo di analisi FISH OctoChrome
6 febbraio 2012
Un romanzo fluorescenza In situ (FISH), metodo che prende in esame contemporaneamente sia alterazioni cromosomiche numeriche e strutturali, in particolare le specifiche traslocazioni cromosomiche associate a leucemia e linfoma, di tutti i 24 cromosomi umani su un singolo dispositivo in una ibridazione, è descritto.
Il saggio Octa Chrome Fish esamina contemporaneamente tutti e 24 i cromosomi umani in una singola ibridazione su un solo vetrino. Preparare innanzitutto dei preparati di metafase su un vetrino specifico suddiviso in otto quadrati. Successivamente, eseguire una scansione automatizzata del vetrino campione per facilitare l'individuazione di tutte le metafasi e la successiva rivalutazione di tutte le immagini cellulari.
Successiva posizione: gli otto quadrati scivolano sul dispositivo Octa chrome e ibridano le sonde. I risultati ottenuti possono mostrare tre cromosomi interi colorati diversamente in ciascun quadrato, in base alla disposizione delle combinazioni cromosomiche sul dispositivo RO. Ebbi per la prima volta l'idea di questo metodo RO FISH quando iniziai ad applicare la tecnica FISH negli studi sulle popolazioni umane all'inizio degli anni '90.
Quindi ho presentato la mia idea della pittura a tripla colorazione, una diapositiva quadrata divisa in otto settori, durante la conferenza annuale dell'A A CR nel 1994. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la classica curvatura cromosomica e il prototipaggio spettrale moderno, è la capacità di analizzare agevolmente tutti e 24 i cromosomi umani in un numero elevato di cellule. Si inizia con la preparazione di cellule in metafase fissate in sospensione, depositando con una pipetta una goccia di cellule su una lamella e verificando un'adeguata densità.
Ora immergere otto quadrati di cromo OC, quindi trasferirli in etanolo puro per due minuti. In una sequenza di quadrati alternati, distribuire cinque microlitri di sospensione cellulare sul vetrino stampo per evitare che le aree di diffusione delle cellule interferiscano tra loro. Lasciare asciugare all'aria i campioni prima di applicare coppie adiacenti.
Applicare 20 microlitri di colorante DAPI a 0,2 microgrammi per millilitro al centro di ciascuna metà del vetrino e posizionare un coprioggetto. Eseguire ora una scansione automatizzata del vetrino campione per localizzare le cellule in metafase. Utilizzare il software metaverse per facilitare l'individuazione di tutte le metafasi e la successiva rivalutazione di tutte le immagini cellulari.
Esaminare manualmente i risultati della scansione ed eliminare gli artefatti non metafasici. In primo luogo, rimuovere la colorazione DPI in due tamponi XSSC, quindi disidratare i campioni mediante una serie di lavaggi con etanolo. Lasciare asciugare il vetrino all'aria e quindi posizionarlo su una piastra scaldante a 37 gradi Celsius per cinque minuti.
Ora equilibrare la sonda cromatica, la camera di ibridazione a sonda multipla e il tampone di ibridazione in un bagnomaria a 37 gradi Celsius con il lato dell'etichetta rivolto verso il basso. Posizionare il dispositivo OC chrome su una piastra riscaldata a 37 gradi Celsius. Aggiungere due microlitri di soluzione di ibridazione preriscaldata a ciascuna delle otto aree.
Ribaltare con attenzione e orientare il template. Farlo scivolare sul dispositivo OC Chrome. Verificare che il vetrino del template sia allineato al dispositivo Octa Chrome.
Quindi abbassare con attenzione il vetrino sulle gocce della soluzione di ibridazione ed esercitare una leggera pressione uniforme per distribuire la soluzione di ibridazione ai bordi di ciascuna delle zone rialzate sul dispositivo OC chrome. Sollevare dal lato smerigliato del vetrino e capovolgere in modo che il vetrino si trovi al di sotto del dispositivo OC chrome. Posizionare su una piastra riscaldante a 37 gradi Celsius per 10 minuti.
Quindi trasferirlo su una piastra riscaldata a 75 gradi Celsius per cinque minuti. Per denaturare i campioni prima del passaggio di ibridazione, trasferirli in una camera di ibridazione Chroma Probe, Multi Probe. Chiudere il coperchio e lasciare galleggiare la camera nel bagnomaria a 37 gradi Celsius per tutta la notte.
Rimuovere con attenzione il vetrino dal dispositivo e lavarlo in eccesso di SC 0,4 a 72 gradi Celsius per due minuti. Eseguire il secondo lavaggio a temperatura ambiente per 30 secondi. Procedere aggiungendo 20 microlitri di DPI al centro di ciascuna metà del vetrino e posizionare un coprioggetto.
Incubare i campioni al buio per 10 minuti a temperatura ambiente prima dell'osservazione mediante microscopia a fluorescenza. Il saggio Octa chrome fish consente l'esame simultaneo di tutti e 24 i cromosomi umani utilizzando un'unica ibridazione su un singolo vetrino. Ogni quadrato contiene tre diversi sonde per la colorazione di interi cromosomi marcate direttamente con fluorocromi di diverso colore.
L'esame di una cellula metafasica normale nel quadrato due del sistema Octa CHRO mostra che i cromosomi 8, 21 e 12 sono colorati rispettivamente di rosso, verde e blu. Possono essere visualizzati singolarmente mediante filtri specifici oppure contemporaneamente attraverso un filtro triplo DAPI Fitzy, Texas Red. Questo approccio cromosomico è utile nel rilevamento di cellule anomale con traslocazioni cromosomiche specifiche della leucemia e aneuploidia.
Ad esempio, la traslocazione cromosomica T 8 21 è comune nella leucemia mieloide acuta. La trisomia 21, ovvero 3 copie del cromosoma 21, è una aneuploidia frequente nella leucemia dopo lo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada agli scienziati nel campo della citogenetica molecolare e dell'epidemiologia molecolare per esplorare le riorganizzazioni cromosomiche più comuni rilevate nella leucemia e nel linfoma, e per esaminare la ploidia selettiva tra tutti i cromosomi umani in pazienti clinici o popolazioni esposte a sostanze chimiche tossiche.
Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come esaminare simultaneamente tutti e 24 i cromosomi umani in un'unica ibridazione su un solo vetrino mediante il saggio Octo Chrome Fish. E definiamo questi come cromosomi.
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Panoramica
Questo articolo descrive un nuovo metodo di ibridazione fluorescente in situ (FISH) noto come saggio Octa Chrome Fish. Esso consente l'esame simultaneo di tutti e 24 i cromosomi umani in una singola ibridazione su un solo vetrino, concentrandosi sulle alterazioni cromosomiche associate alla leucemia e al linfoma.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Ibridazione fluorescente in situ (FISH)
- Analisi cromosomica
- Oncoologia
Sfondo
- FISH è una tecnica utilizzata per rilevare e localizzare la presenza o l'assenza di specifiche sequenze di DNA sui cromosomi.
- Le traslocazioni cromosomiche sono significative nello studio della leucemia e del linfoma.
- Il metodo consente un'analisi completa delle alterazioni cromosomiche.
- I metodi precedenti richiedevano molteplici ibridazioni, rendendo questo approccio più efficiente.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo che semplifichi il rilevamento di anomalie cromosomiche.
- Migliorare l'efficienza dell'analisi cromosomica in ambito clinico.
- Fornire uno strumento per una migliore comprensione della base genetica delle malattie ematologiche maligne.
Metodi Utilizzati
- Preparazione di strati metafasici su un vetrino specializzato con otto quadrati.
- Scansione automatica del vetrino per individuare le metafasi da analizzare.
- Ibridazione delle sonde mediante il dispositivo Octa Chrome.
- Visualizzazione dei risultati che mostrano diversi cromosomi interi colorati in base alle disposizioni.
Risultati principali
- Il saggio visualizza con successo tutti i 24 cromosomi in una singola ibridazione.
- I risultati possono mostrare tre cromosomi diversamente colorati in ogni quadrato del vetrino.
- Permette la rivalutazione delle immagini cellulari per un'analisi completa.
- Dimostra un potenziale applicativo negli studi sulle popolazioni umane.
Conclusioni
- Il saggio Octa Chrome Fish rappresenta un notevole progresso nella metodologia FISH.
- Questo metodo può migliorare il rilevamento di anomalie cromosomiche nei tumori ematologici.
- Offre un approccio più efficiente per ricercatori e clinici.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Il saggio OctoChrome-FISH consente la rilevazione simultanea di alterazioni cromosomiche numeriche e strutturali su tutti e 24 i cromosomi umani in un'unica ibridazione, risolvendo un collo di bottiglia fondamentale nell'analisi citogenetica delle neoplasie ematologiche. Integrando lo screening dell'intero genoma in un unico flusso di lavoro basato su vetrino, aumenta la produttività e la riproducibilità nella ricerca su leucemie e linfomi, favorendo la validazione precoce di bersagli e la riduzione dei rischi meccanicistici nella fase preclinica della scoperta. Questa capacità migliora l'affidabilità predittiva nell'identificazione di oncogeni indotti da traslocazioni e di modelli di aneuploidia rilevanti per la leucemogenesi indotta da benzene e altre esposizioni a sostanze tossiche.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Permette l'analisi di ipotesi terapeutiche mediante la visualizzazione di traslocazioni specifiche della leucemia, come t(9;22), t(15;17), t(8;21) e t(14;18), nel loro contesto cromosomico nativo.
- Valore operativo: Riduce la necessità di sottoporre a ibridazione FISH sequenziale ripetuta, preservando i campioni e accelerando la conferma degli obiettivi nella biologia della scoperta.
- Valore predittivo: Supporta la selezione del portafoglio fornendo una valutazione contemporanea di riarrangiamenti strutturali e di aneuploidia su scala genomica, migliorando la certezza nelle associazioni tra bersaglio e malattia.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Prepara sistemi cromosomici validati per analisi successive, stabilendo cariotipi di base e rilevando i tassi di alterazione spontanea in popolazioni esposte.
- Valore operativo: Standardizza le letture citogenetiche mediante etichettatura costante delle sonde e architettura delle vetrini, migliorando la riproducibilità tra laboratori e campagne di screening.
- Valore di scalabilità: Consente l'analisi ad alto contenuto di metafasi mediante scansione automatizzata, facilitando la rivalutazione e il monitoraggio longitudinale della stabilità cromosomica in studi tossicologici longitudinali.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore traslazionale: Collega la scoperta alla validazione preclinica consentendo il confronto diretto delle alterazioni cromosomiche in modelli cellulari, campioni da pazienti e coorti di popolazione esposte a leucemogeni come il benzene.
- De-risking meccanicistico: Chiarisce se le aneuploidie o le traslocazioni osservate siano eventi casuali o schemi associati all'esposizione, fornendo informazioni utili per la valutazione del rischio nello sviluppo di biomarcatori traslazionali.
- Valore di continuità: Favorisce una transizione fluida dai risultati in vitro alla rilevanza in vivo mantenendo la risoluzione cromosomica attraverso diversi sistemi modello e campioni umani.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il saggio si inserisce nel continuum dalla scoperta alla fase preclinica, consentendo l'analisi cromosomica in fasi iniziali di verifica delle ipotesi e supportando l'identificazione dei composti promettenti attraverso la riduzione del rischio meccanicistico legato all'instabilità genomica.
- Biologia della scoperta: Facilita la verifica di ipotesi sui meccanismi cromosomici nella leucemogenesi consentendo lo screening simultaneo di alterazioni note e nuove in tutto il genoma.
- Screening: Fornisce risultati quantitativi e multiplex (ad esempio, frequenza di traslocazioni, tassi di aneuploidia) che permettono il confronto degli effetti di composti o esposizioni in diverse condizioni.
- Analisi: Genera segnali fluorescenti multiplex compatibili con l'imaging automatizzato e il cariotipaggio assistito da software, consentendo un confronto oggettivo degli stati cromosomici.
- Ricerca traslazionale: Collega i risultati ottenuti in vitro alla rilevanza umana rilevando pattern cromosomici identici negli studi su popolazioni, sostenendo l'allineamento dei biomarcatori.
- Riutilizzo aziendale: Funziona come una piattaforma citogenetica riutilizzabile applicabile in programmi di oncologia, tossicologia e farmacogenomica che richiedono la valutazione dell'integrità cromosomica.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi riducendo i falsi negativi grazie a una copertura cromosomica completa.
- Valore operativo: Migliora la standardizzazione e la riproducibilità mediante set di sonde standardizzati e un formato di vetrino uniforme, riducendo la variabilità tra laboratori.
- Valore strategico: Potenzia l'efficienza del capitale riducendo il consumo di reagenti e il tempo di manipolazione manuale rispetto agli approcci FISH o SKY sequenziali.
- Impatto sul portafoglio: Consente decisioni di avanzamento corrette in base al rischio fornendo evidenze precoci di stabilità o instabilità genomica nei candidati principali.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in microscopia a fluorescenza e preparazione citogenetica per la corretta generazione di metafasi espanse e l'interpretazione dei segnali.
- È subordinato all'accesso al dispositivo OctoChrome e a camere di ibridazione compatibili per la somministrazione simultanea di più sonde.
- Necessita della standardizzazione delle procedure di manipolazione dei vetrini, denaturazione e lavaggio, al fine di garantire una penetrazione costante delle sonde e rapporti segnale-rumore uniformi.
- L'adattamento a sistemi modello non umani potrebbe richiedere una nuova validazione della specificità delle sonde e dell'efficienza della colorazione cromosomica.
- I limiti pratici includono la dipendenza da campioni di qualità metafasica e il possibile sovrapporsi dei segnali in genomi altamente riarrangiati, richiedendo un accurato smistamento spettrale.
