Chromosomics: Rilevamento delle alterazioni numeriche e strutturali in tutti i 24 cromosomi umani simultaneamente utilizzando un nuovo metodo di analisi FISH OctoChrome

Il test Octa Chrome Fish esamina simultaneamente tutti i 24 cromosomi umani in un'unica ibridazione su un unico vetrino. Per prima cosa, preparare gli spread di metafase sullo specifico vetrino a otto quadrati. Quindi eseguire una scansione automatizzata del vetrino campione per facilitare la localizzazione di tutte le fasi meta e la futura rivalutazione di tutte le immagini cellulari.

La posizione successiva, gli otto quadrati scorrono sul dispositivo Octa chrome e ibridano le sonde. I risultati ottenuti possono mostrare tre diversi cromosomi interi dipinti in ogni quadrato in base alla disposizione delle combinazioni cromosomiche sul dispositivo RO. Ho avuto l'idea di questo metodo RO FISH quando ho iniziato ad applicare i pesci negli studi sulla popolazione umana nei primi anni '90.

Poi ho introdotto la mia idea di pittura a tre colori, otto diapositive quadrate per impostare la cella alla conferenza annuale A A CR nel 1994. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la classica curvatura cromosomica e la moderna prototipazione spettrale è che può analizzare facilmente tutti i 24 cromosomi umani in un numero maggiore di cellule. Iniziare con una preparazione di cellule in metafase fissate in sospensione come pipetta di controllo su un vetrino e verificare la densità appropriata.

Ora immergere in otto OC quadrati di cromo, scivolare in etanolo puro per due minuti. In una sequenza di quadrati alternati, distribuire cinque microlitri di sospensione cellulare sul vetrino modello per evitare che le propagazioni cellulari interferiscano tra loro. Asciugare i campioni all'aria prima di individuare le coppie adiacenti.

Applicare 20 microlitri da 0,2 microgrammi per millilitro di colorante DAPI al centro di ciascuna metà del vetrino e posizionare un vetrino coprioggetti. A questo punto, eseguire una scansione automatica del vetrino del campione per localizzare le cellule in metafase. Utilizza il software del metaverso per facilitare la localizzazione di tutte le fasi del metaverso e la futura rivalutazione di tutte le immagini delle celle.

Visualizzare manualmente i risultati della scansione ed eliminare gli artefatti non in metafase. Per prima cosa, rimuovere la colorazione DPI in due tamponi XSSC, quindi disidratare i campioni attraverso una serie di lavaggi con etanolo. Asciugare il vetrino all'aria e poi posizionarlo su una piastra di luppolo a 37 gradi Celsius per cinque minuti.

Equilibrare ora la sonda di crominanza, la camera di ibridazione multisonda e il tampone di ibridazione in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius con l'etichetta rivolta verso il basso. Posizionare il dispositivo OC Chrome su una piastra riscaldante a 37 gradi Celsius. Aggiungere due microlitri di soluzione di ibridazione preriscaldata a ciascuna delle otto aree.

Capovolgere e orientare con attenzione il modello. Scorri sul dispositivo OC Chrome. Verifica che la diapositiva del modello sia allineata al dispositivo Octa Chrome.

Quindi abbassare con cautela il vetrino sulle gocce di soluzione di ibridazione e applicare una leggera pressione uniforme per distribuire la soluzione di ibridazione sui bordi di ciascuna delle aree rialzate sul dispositivo OC chrome. Sollevare l'estremità smerigliata del vetrino e capovolgerlo in modo che il vetrino si trovi sotto il dispositivo OC cromato. Mettere su una piastra calda a 37 gradi Celsius per 10 minuti.

Quindi trasferirlo su una piastra riscaldante a 75 gradi Celsius per cinque minuti. Per denaturare i campioni per la fase di ibridazione, trasferirli in una sonda di crominanza, camera di ibridazione multi-sonda. Riposizionare il coperchio e far galleggiare la camera nel bagnomaria a 37 gradi Celsius per una notte.

Rimuovere con cautela il vetrino dal dispositivo e lavare con 0,4 SC in eccesso a 72 gradi Celsius per due minuti. Eseguire il secondo lavaggio a temperatura ambiente per 30 secondi. Procedere all'aggiunta di 20 microlitri di DPI al centro di ciascuna metà del vetrino e posizionare un vetrino coprioggetti.

Incubare i campioni al buio per 10 minuti a temperatura ambiente prima di visualizzarli al microscopio a fluorescenza. Il test Octa chrome fish facilita l'esame simultaneo di tutti i 24 cromosomi umani utilizzando una singola ibridazione su un singolo vetrino. Ogni quadrato contiene tre diverse sonde di verniciatura cromosomica intera etichettate direttamente con fluoro di colore diverso.

L'esame a quattro punti di una cellula di metafase normale nel secondo quadrato del sistema Octa CHRO mostra che i cromosomi 8, 21 e 12 sono dipinti di rosso, verde e blu. Possono essere visualizzati singolarmente utilizzando i rispettivi filtri o visualizzati contemporaneamente attraverso un triplo filtro DAPI Fitzy, Texas Red. Questo approccio cromosomico è utile nella rilevazione di cellule anomale con cromosoma specifica per leucemia, traslocazione e aneuploidia.

Ad esempio, T 8 21 è una traslocazione cromosomica comune nella leucemia mieloide acuta. La trisomia 21 3 copie del cromosoma 21 è un'aneuploidia comune nella leucemia dopo lo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada agli scienziati nel campo della citogenetica molecolare e dell'epidemiologia molecolare per esplorare i riarrangiamenti cromosomici più comuni rilevati nella leucemia e nel linfoma e per esaminare la ploidia selettiva tra tutti i cromosomi umani in pazienti clinici o popolazioni esposte a sostanze chimiche tossiche.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come esaminare simultaneamente tutti i 24 cromosomi umani in un'unica ibridazione su un vetrino mediante il saggio Octo Chrome Fish. E lo definiamo cromosomi.