Monitoraggio dell'assemblaggio eIF4F misurando l'interazione eIF4E-eIF4G nelle cellule vive

La regolazione della segnalazione del complesso eIF4F è associata ad un aumento della traduzione del sottogruppo di mRNA coinvolto nella proliferazione e nella sopravvivenza del cancro. Qui descriviamo un saggio di interazione proteina-proteina basato su cellule eIF4E-eIF4G che ci consente di valutare la perturbazione indotta da farmaci nell'integrità del complesso eIF4F in cellule vive. C'è un crescente interesse per lo sviluppo di modalità che mirano in modo efficiente all'interfaccia proteina-proteina.

Abbiamo immaginato che i nostri test PPI eIF4E-eIF4G aiuteranno a promuovere queste strategie e a convalidarle. Questo test fornirà uno schema primario ottimale per guidare l'ottimizzazione degli inibitori di eIF4E-eIF4G. La corretta semina della cellula e l'esecuzione della trasfezione di trasferimento sono gli aspetti più impegnativi di questo prodotto, poiché possono riflettersi direttamente sulla soppressione del sistema di segnalazione PPI.

Dopo lo scongelamento e il conteggio delle cellule, seminare piastre a 6 pozzetti con cellule HEK 293, utilizzando 2 millilitri di terreno di crescita standard per pozzetto. La mattina del giorno 2, per ogni trasfezione piallata, diluire 9 microlitri di soluzione a base di liposomi in un tubo contenente 125 microlitri di terreno sierico ridotto senza rosso fenolo. Mentre i liposomi diluiti incubano a temperatura ambiente per 5 minuti, preparare la miscela master di DNA diluendo 3 microgrammi di ciascun plasmide in 125 microlitri di terreno sierico ridotto per ciascuna provetta di trasfezione.

Aggiungere 12 microlitri di reagenti enhancer al DNA master mix 2, quindi mescolare bene. Aggiungere immediatamente questa miscela a ciascun tubo di liposomi diluiti in un rapporto di 1 a 1. Dopo aver incubato questo complesso lipidico di DNA per 15 minuti a temperatura ambiente, aggiungere il complesso a ciascun pozzetto delle piastre a 6 pozzetti.

Incubare le cellule a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per 24 ore. La mattina del giorno 3, sciacquare ogni pozzetto con 1 millilitro di PBS e aggiungere 0,3 millilitri di tripsina. Incubare le piastre a 37 gradi Celsius per 5 minuti.

Dopo l'incubazione, neutralizzare la tripsina aggiungendo 2 millilitri a ciascun pozzetto del terreno di siero ridotto senza rosso fenolo. Trasferire le cellule trasfettate in una provetta da 15 millilitri. Quindi, centrifugare le celle a 290x G per 5 minuti.

Aspirare il terreno e risospendere il pellet cellulare in 2 millilitri del terreno di siero ridotto. Seminare le cellule HEK 293 trasfettate in piastre opache a 96 pozzetti, a una densità di 30.000 cellule per pozzetto in 90 microlitri di terreno. Per ottenere 3 repliche tecniche per 3 diversi composti all'interno dello stesso esperimento, seminare 60 pozzetti.

Escludere i pozzetti sui bordi. Immediatamente dopo aver seminato le cellule trasfettate, aggiungere 10 microlitri di soluzione composta di DMSO al 10% in ciascun pozzetto. Preparare soluzioni madre composte da 1 millimolare sciogliendo ciascun composto di interesse in DMSO al 100%.

Per avere 3 repliche per ogni titolazione del composto, utilizzare 8 microlitri della soluzione madre di composto da 1 millimolare. Eseguire una doppia diluizione in serie di ciascuna soluzione di composto madre in 8 pozzetti di una piastra PCR a 96 pozzetti pipettando 4 microlitri del materiale da 1 millimolare in 4 microlitri di DMSO al 100% per ogni punto di titolazione. Scartare i 4 microlitri in eccesso dopo l'ultimo punto della doppia diluizione seriale.

Aggiungere 36 microlitri di acqua sterile di grado HPLC a ciascuna provetta per preparare 40 microlitri di soluzioni di diluizione seriale composte 10x in DMSO al 10%. Inoltre, prepara un controllo. 10% di DMS solo soluzione madre in acqua sterile di grado HPLC.

Aggiungere 10 microlitri di soluzioni di lavoro 10x alle cellule della piastra opaca a 96 pozzetti per ottenere la concentrazione finale prevista, con una concentrazione residua di DMSO dell'1%Incubare la piastra a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per 3 ore. Dopo 3 ore, iniziare a preparare il reagente del substrato della luciferasi combinando 1 volume di substrato con 19 volumi del reagente di diluizione. Utilizzare una pipetta multicanale per aggiungere immediatamente 25 microlitri di reagente del substrato a ciascun pozzetto della piastra da 96 pozzetti con le cellule.

Agitare la piastra su un agitatore orbitale a 350 giri/min, per 50 minuti a temperatura ambiente. Per valutare la luminescenza, posizionare la lastra su un lettore di piastre. Impostare il lettore a specchio su luminescenza e il filtro di emissione su 455.

Utilizzare un'altezza di misurazione di 6,5 millimetri con un tempo di misurazione di 1 secondo. Per valutare la vitalità cellulare, aggiungere 33 microlitri di reagente per il test di vitalità a ciascun pozzetto. Dopo 15 minuti a temperatura ambiente, valutare la luminescenza con il lettore di piastre impostando il lettore a specchio su luminescenza e il filtro di emissione su 600.

Utilizzare un'altezza di misurazione di 6,5 millimetri e un tempo di misurazione di 1 secondo. Utilizzare i dati del lettore di piastre per determinare il valore IC 50 di ciascun composto, adattando i dati all'equazione della curva di adattamento a 4 parametri descritta nel manoscritto. Le cellule HEK 293 sono state trasfettate con il sistema di complementazione eIF4E-eIF4G, quindi ritirate e trattate con inibitori di mTOR.

Quando la luminescenza è stata valutata 4 ore dopo il trattamento, PP242 e rapamicina hanno entrambi prodotto un'inibizione dose-dipendente del segnale. Né PP242 né rapamicina hanno prodotto una diminuzione significativa della vitalità cellulare, indicando che la diminuzione della luminescenza nel sistema di complementazione eIF4E-eIF4G non è dovuta alla morte cellulare non specifica, ma piuttosto all'interruzione dell'interazione EIF4E-4G. L'analisi Western blot, a seguito dell'esperimento di pull down m7GTP, ha mostrato che l'interruzione mediata da 4EBP1 dell'interazione endogena eIF4E-eIF4G è correlata con il segnale del saggio misurato eIF4E-eIF4G.

PP242 era un inibitore più potente della fosforilazione totale di 4EBP1 rispetto alla rapamicina. Entrambi gli inibitori hanno mostrato un impatto sulla normale trasduzione del segnale di mTOR, con la rapamicina più attiva contro i substrati di mTORC1 e PP242 che ha come bersaglio sia mTORC1 che mTORC2. Gli aspetti più critici di questo prodotto sono la semina delle cellule il giorno della transazione, la risemina delle cellule in un terreno privo di rosso fenolo, la valutazione della luminescenza del saggio di complementazione eIF4E-eIF4G e l'esecuzione del saggio di vitalità sulla stessa piastra.

Un test di vitalità secondaria può essere eseguito per valutare qualsiasi farmaco di destinazione e gli effetti specifici noti.