Microdissezione laser industrializzata guidata dall'intelligenza artificiale per l'analisi proteomica microscalata del microambiente tumorale

Questo protocollo integra l'analisi delle immagini basata sull'intelligenza artificiale per la segmentazione dei tessuti. Con l'istologia raccolta selettiva mediante microdissezione laser e ci avvicina alla realtà della Patomica. La definizione del ROI dei tessuti utilizzando l'intelligenza artificiale, limita il tempo di permanenza dei vetrini di tessuto a temperatura ambiente, riduce lo sforzo di manodopera per eseguire questi raccolti e diminuisce la variabilità dell'operatore.

Questa tecnica è ampiamente applicabile a qualsiasi ricerca basata su malattie o patologie che coinvolga la raccolta o l'arricchimento di specifiche popolazioni cellulari da campioni di tessuto. Questo metodo è semplice per gli utenti con conoscenze istopatologiche di base ed esperienza LMD. La chiave è assicurarsi di tagliare il calibratore pulito per le celle e addestrare bene il classificatore.

Per iniziare, assicurarsi che la slitta sia completamente asciutta prima di tagliare i fiduciali di calibrazione di riferimento. Aprire il software Laser Microdissection e aprire il file sld del punto di calibrazione predefinito sotto l'opzione importa forme. Caricare il vetrino con il tessuto rivolto verso il basso e il lato dell'etichetta più vicino all'operatore.

Nel supporto della slitta sullo stadio di microdissezione laser, selezionare l'opzione di messa a fuoco automatica prima del taglio. Utilizzando il microscopio laser e il file di calibrazione predefinito, tagliare i fiduciali di calibrazione nella membrana PEN. Solo per le collezioni arricchite di microdissezione laser, aprire il software di analisi delle immagini.

Selezionare le immagini aperte e, dalla finestra popup, selezionare il file di immagine dot svs generato dalla scansione della diapositiva. Passare alla scheda Annotazioni, selezionare e utilizzare lo strumento di annotazione rettangolo per disegnare una casella attorno al tessuto. Seleziona l'annotazione della casella e fai clic con il pulsante destro del mouse sull'immagine.

Seleziona il menu a discesa avanzato, quindi fai clic sull'opzione di partizionamento. Impostare le dimensioni e lo spazio dei riquadri rispettivamente tra 500 e 40 e selezionare OK per generare i riquadri. Selezionare ed eliminare l'annotazione della casella perimetrale utilizzata per generare i riquadri.

Selezionate il menu a discesa Azioni livello, quindi fate clic su Esporta per salvare le annotazioni affiancate come file di annotazione a punti. Inserisci una copia salvata dell'algoritmo dapa Python, sviluppato per unire i livelli di annotazione classificati AI nella stessa cartella del file di annotazioni affiancate. Copiare il nome del file di annotazione affiancato.

Aprire il programma Python utilizzando l'ambiente di sviluppo integrato inattivo e incollare il nome del file di annotazione affiancato tra le virgolette nella parte inferiore del programma. Seleziona il menu a discesa Esegui, quindi fai clic su Esegui modulo. Attendi che vengano generati alcuni file che avranno tutte le annotazioni affiancate unite sotto un singolo livello.

Aprire il software di analisi delle immagini e passare alla scheda annotazioni. Selezionate il menu a discesa Azioni livello, quindi fate clic su Elimina tutti i livelli per rimuovere tutte le annotazioni dall'immagine. Selezionare il menu a discesa Azioni livello, quindi fare clic su Importa file di annotazione locale.

Nella finestra popup, selezionare il file di annotazione a punti unito generato dallo script. Assicuratevi che tutti i riquadri importati si trovino sotto lo stesso livello di annotazione. Dalla scheda classificatore, seguire le istruzioni del produttore per evidenziare le aree rappresentative del tumore, dello stroma e del ROI di sfondo del vetrino bianco.

Prima di eseguire il classificatore, fare clic su Opzioni classificatore avanzate, selezionare il livello di annotazione desiderato selezionando la casella ROI o le caselle nella scheda annotazioni. Utilizzate l'opzione del livello di annotazione dal menu delle azioni del classificatore per eseguire il classificatore. Una volta completata l'analisi del classificatore, passare alla scheda Annotazioni e selezionare il livello di annotazione generato dall'analisi.

Selezionate il menu a discesa Azioni livello, quindi fate clic su Elimina tutti i livelli ma correnti per rimuovere tutti gli altri livelli di annotazione dall'immagine. Quindi, selezionare il menu a discesa Azioni livello, quindi fare clic su Esporta per salvare le annotazioni come file di annotazione a punti. Creare una cartella per la sessione o il progetto e salvare il file di annotazione a punti all'interno di una sottocartella.

Etichettato con l'identificatore univoco per la diapositiva. Passare alla scheda Annotazioni, selezionare il menu a discesa Azioni livello, quindi fare clic su Elimina tutti i livelli per rimuovere tutte le annotazioni dall'immagine. Selezionate lo strumento penna e tracciate una breve linea da ogni fiduciale di calibrazione.

Disegna linee dai segni nell'ordine seguente. In alto a sinistra, in alto a destra, in basso a destra. Selezionate il menu a discesa azioni livello, quindi fate clic su Esporta per salvare le annotazioni affiancate come file di annotazione.

Aggiungere il calib di sottolineatura al nome del file e posizionare il file nella sottocartella che contiene le coordinate per le forme affiancate. Copiare l'indirizzo del progetto principale. Aprire il malliator di script di generazione dell'importazione XML utilizzando l'ambiente di sviluppo integrato inattivo, quindi incollare l'indirizzo della cartella del progetto tra le virgolette nella parte inferiore dello script.

Selezionare il menu a discesa Esegui, quindi fare clic su Esegui modulo per eseguire lo script. Caricare il vetrino a membrana contrassegnato con il tessuto rivolto verso il basso e il lato dell'etichetta più vicino all'operatore nel supporto del vetrino sullo stadio del microscopio laser. Selezionare Importa forme dal menu a discesa dei file.

Selezionare il file di importazione DOT XML, LMD generato per la diapositiva. Selezionare no nella finestra popup per evitare di caricare punti di riferimento dal file e no nella seconda finestra popup per evitare di utilizzare punti di riferimento memorizzati in precedenza per la calibrazione. Seguire le istruzioni dell'applicazione di micro dissezione laser e allineare la croce di calibrazione a ciascuno dei tre fiduciali di calibrazione sulla diapositiva.

Cerca i fiduciali di calibrazione visualizzati in alto a sinistra, in alto a destra e in basso a destra dell'immagine della diapositiva. Nel software di analisi delle immagini che corrisponderà ai punti di riferimento del vetrino di microdissezione laser invertita sullo stadio del microscopio. Passare dall'utilizzo dell'obiettivo soggettivo 5x per localizzare e l'obiettivo soggettivo 63x per allineare ogni fiduciale di calibrazione.

Selezionare no nella finestra popup per evitare di salvare i punti di riferimento nel file e andare bene nella seconda finestra popup per confermare che la diapositiva è inserita. Spostare l'obiettivo soggettivo 5x in posizione e selezionare sì nella finestra popup per utilizzare l'ingrandimento effettivo. Una volta visualizzate le forme importate, focalizzare la fotocamera sul tessuto.

Evidenziare e selezionare tutte le forme nella finestra dell'elenco delle forme. Trascinateli in posizione utilizzando una o due annotazioni all'interno del campo visivo come riferimenti e allineate l'asse Z verticale per il taglio con il laser. Caricare i tubi in un supporto universale per tubi progettato per microtubi PCT.

Esaminare le forme importate e assegnarle alla posizione del tubo appropriata per la raccolta. Premere start cut per avviare il laser. Scaricare e chiudere la provetta con tessuti LMD e mettere su ghiaccio secco.

Dopo il termociclismo e la centrifugazione, l'LMD ha raccolto campioni di tessuto, rimosso e scartato i microcap dai microtubi PCT. Aggiungere tripsina, aggiungere un rapporto di un microgrammo per 30 millimetri di tessuto quadrato. E inserisci un micro pestello nel micro tubo usando lo strumento microcap.

Trasferire i microtubi in una cartuccia a ciclo barilotto e assemblare la cartuccia completa. Posizionare la cartuccia nella camera di pressione del ciclo della canna e fissare il coperchio. Ciclo della canna a 45.000 PSI per 50 secondi e pressione atmosferica per 10 secondi a 50 gradi Celsius per 60 cicli.

Per l'analisi LC-MS MS, caricare i flaconcini del campionatore automatico nelle posizioni appropriate nel campionatore automatico per cromatografia liquida. Chiudere il campionatore automatico e analizzare le singole frazioni con un metodo appropriato di gradiente e spettrometria di massa. Clustering gerarchico non supervisionato utilizzando le 100 proteine più variabili.

Ha provocato la segregazione del carcinoma ovarico sieroso di alto grado e dei tipi di carcinoma a cellule chiare ovariche dai campioni di tumore arricchiti con microdissezione laser e interi. Al contrario, la microdissezione laser ha arricchito campioni di stroma sia dal carcinoma ovarico sieroso di alto grado che dal carcinoma ovarico a cellule chiare. Raggruppati insieme e indipendentemente dalla microdissezione laser arricchiti tumore e interi campioni tumorali.

Tra le 5.971 proteine quantificate, 215 sono state significativamente alterate tra intere raccolte tumorali da carcinoma ovarico sieroso di alto grado e campioni di carcinoma ovarico a cellule chiare. Delle 76 proteine di firma quantificate da Hughes, 57 sono state coquanificate in questo set di dati ed erano altamente correlate Addestrare il classificatore è la parte più impegnativa. Seguendo le istruzioni del software Indica Lab e perfezionando il classificatore ha riprodotto i risultati più accurati.

Tutto il resto è standardizzato. Il tessuto raccolto utilizzando questo flusso di lavoro LMD basato sull'intelligenza artificiale è compatibile con una varietà di applicazioni analitiche a valle, tra cui la proteomica basata sulla spettrometria di massa descritta qui o genomi, trascrittomica o altre analisi omiche.