Preparazione di proteomica a cella singola per analisi di spettrometria di massa mediante lisi a calore freddo e un vettore isobarico

SCoPE2 può quantificare migliaia di proteine da migliaia di singole cellule di mammifero senza anticorpi. Questo protocollo può aiutare a scoprire l'eterogeneità del proteoma che altrimenti sarebbe invisibile alle analisi di massa. La proteomica a singola cellula, utilizzando l'approccio SCoPE2, è stata progettata per essere accessibile ai ricercatori con una gamma di risorse, dalla semplice pipetta, alla robotica per la gestione dei liquidi.

SCoPE2 è ampiamente applicabile a molte aree di ricerca, tra cui il cancro e l'immunologia, fornendo informazioni su come le proteine sono differenziali in abbondanza tra singole cellule della stessa popolazione. Per iniziare, avviare la procedura di lisi cellulare posizionando una piastra a 384 pozzetti con celle singole selezionate nel termociclatore, riscaldandola per 10 minuti a 90 gradi Celsius seguita da raffreddamento a 12 gradi Celsius. Ruotare brevemente il piatto in uno spinner da banco a 18-22 gradi Celsius.

Sonicare la piastra per cinque minuti in un sonicatore a bagnomaria a 18-22 gradi Celsius. Quindi, posizionalo sul ghiaccio. Per procedere con la digestione della tripsina, preparare 100 microlitri del master mix e aggiungere 0,2 microlitri del master mix a ciascun pozzetto della piastra a 384 pozzetti utilizzando un manipolatore di liquidi.

Sigillare la piastra, il vortice per cinque secondi e girare verso il basso in uno spinner da banco a 18-22 gradi Celsius. Riscaldare la piastra a 384 pozzetti per tre ore a 37 gradi Celsius con la temperatura del coperchio impostata su 52 gradi Celsius. Per impostare una reazione di marcatura di massa in tandem, estrarre le scorte di 85 millimolari di etichette di massa tandem dal congelatore a meno 80 gradi Celsius.

Prima di aprirli, riscaldare i tubi a temperatura ambiente e diluire le etichette a 22 millimole in acetonitrile anidro. Utilizzando questa strategia di etichettatura, aggiungere 0,5 microlitri di etichette di massa tandem diluite a ciascun pozzetto della piastra a 384 pozzetti, utilizzando un robot di erogazione del liquido o una pipetta manuale. Sigillare la piastra, il vortice per cinque secondi e girare verso il basso in uno spinner da banco a 18-22 gradi Celsius.

Lasciare che la reazione di etichettatura proceda da 18 a 22 gradi Celsius per un'ora. Per la tempra della reazione di marcatura della massa in tandem, aggiungere 0,2 microlitri di idrossilammina allo 0,5%, diluita in acqua di grado HPLC, a ciascun pozzetto della piastra a 384 pozzetti utilizzando un manipolatore di liquidi. Sigillare la piastra, il vortice per cinque secondi e girare verso il basso in uno spinner da banco prima di mantenere la piastra a 18-22 gradi Celsius per 30 minuti.

La preparazione dell'analisi LC-MS viene avviata rimuovendo il supporto combinato o il materiale di riferimento dal congelatore a meno 80 gradi Celsius. Per ogni set, pipettare un microlitro di supporto e materiale di riferimento nel primo pozzetto, farà parte di un singolo set. Pipettare il volume completo dal primo pozzetto al pozzetto successivo.

Continuare a pipettare il volume completo da un pozzetto all'altro fino a quando tutti i pozzetti inclusi in un singolo set sono stati combinati nel pozzetto finale. Per ogni set, aggiungere cinque microlitri di acetonitrile al 50% diluito in acqua di grado HPLC per il primo pozzetto a cella singola da includere in ciascun set. Pipettare il volume completo dal primo pozzetto al pozzetto successivo.

Continuare a pipettare il volume completo da una cella all'altra, fino a quando tutti i pozzetti inclusi in un singolo set sono stati combinati nel pozzetto finale. Ora trasferisci ogni set nei loro inserti di vetro dell'autocampionatore. Asciugare i campioni una volta combinati tutti i set e inseriti in inserti di vetro.

Prima dell'analisi LC-MS-MS, aggiungere 1,2 microlitri di acido formico allo 0,1% a ciascun set per risospendere i peptidi marcati. Posizionare gli inserti dell'autocampionatore in flaconcini di vetro e chiudere ciascun campione con un tappo. Vortice ogni flaconcino per cinque secondi per assicurarsi che la risospensione sia completa, quindi ruotare verso il basso in un filatore di flaconcino a 18-22 gradi Celsius.

Assicurarsi che ogni campione si trovi nella parte inferiore dell'inserto anziché spruzzato sui lati. Posizionare i flaconcini nel vassoio dell'autocampionatore e per ciascun set, iniettare un campione da un microlitro per l'analisi LC-MS-MS. L'efficienza di digestione ed etichettatura delle singole celle potrebbe non essere valutata direttamente come con il vettore, ma il software DO-MS fornisce grafici che stimano l'efficienza della digestione e dell'etichettatura.

La cattiva digestione è indicata da un alto rapporto tra l'intensità dei peptidi scissi e le loro controparti completamente scisse. Un altro fattore da considerare nei set è la frazione di dati mancanti nell'intensità ionica mediana del reporter in ciascun canale di marcatura di massa tandem. Quando le singole cellule vengono preparate con successo, i dati mancanti per cellula e il controllo positivo sono molto inferiori rispetto ai campioni di controllo negativi.

Un'attenta manipolazione dei liquidi durante la preparazione del campione LC-MS-MS è fondamentale per il massimo recupero dei peptidi. Piccoli campioni di circa 100 picogrammi a 100 nanogrammi per pozzetto possono essere preparati per l'analisi proteomica utilizzando un vettore isobarico. SCoPE2 rende le misurazioni proteomiche a singola cellula accessibili ai ricercatori di tutto il mondo utilizzando solo reagenti comuni e apparecchiature disponibili in commercio.

È suscettibile di elaborazione manuale o automazione ad alta produttività mediante movimentazione robotizzata dei liquidi.