Continuo ad alta risoluzione osservazione microscopica di replicativo invecchiamento nel lievito germogliante

L'obiettivo generale di questa procedura è seguire cellule di lievito aploidi singole durante l'intera durata della loro vita replicativa. Il primo passaggio consiste nel realizzare un chip microfluidico contenente un reticolo di micro piastre. Successivamente, le cellule di lievito vengono caricate nel chip microfluidico e, poiché lo spazio sotto le micro piastre ha un'altezza simile al diametro di una cellula di lievito, le cellule si depositano in quella zona.

Successivamente, viene applicato un flusso continuo di mezzo fresco sulle cellule di lievito intrappolate, e le cellule figlie emergenti vengono rimosse dal flusso del mezzo in microscopia a campo chiaro e in fluorescenza. La microscopia viene utilizzata per visualizzare i cambiamenti nella morfologia cellulare o degli organelli, nell'espressione proteica e nel localizzazione proteica che possono verificarsi nelle cellule di lievito invecchianti. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto al metodo classico di microdissezione è che richiede meno lavoro ed è in grado di fornire immagini microscopiche continue a lungo termine dell'intera durata di vita di singole cellule di lievito.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sull'invecchiamento replicativo, può anche essere utilizzato per studi che richiedono un'osservazione microscopica continua per periodi prolungati. In generale, le persone alle prime armi con questa tecnica potrebbero incontrare difficoltà poiché è necessaria particolare attenzione in determinati passaggi della produzione del chip micro feic. Inoltre, il caricamento delle cellule nel chip micro feic potrebbe richiedere una certa esperienza.

Il getto in silicio è prodotto mediante litografia morbida. Per i dettagli sulla sua produzione, si prega di fare riferimento al protocollo allegato. Tagliare un pezzo di tough tag in strisce sottili di circa 0,5 millimetri per tre millimetri.

Con un bisturi, posizionare con attenzione le strisce sullo stampo in wafer di silicio leggermente sopra la struttura del canale compresa tra i canali di ingresso e il micro padre. Successivamente, coprire una piastra di Petri in vetro con un doppio strato di carta d'alluminio e inserire il wafer nella piastra di Petri. La carta d'alluminio impedirà al PDMS di infiltrarsi tra il wafer e la piastra di Petri durante la produzione dei chip microfluidici.

Per iniziare la procedura di fabbricazione di chip microfluidici, posizionare un bicchiere di plastica vuoto sulla bilancia e tarare la bilancia. Versare 40 grammi di base PDMS nel bicchiere di plastica. Aggiungere l'agente indurente PDMS in un rapporto ponderale di uno a 10, che in questo caso corrisponde a circa quattro millilitri.

Utilizzando la pipetta di plastica monouso, mescolare accuratamente per diversi minuti; è importante che la miscela sia ben omogeneizzata per garantire una corretta polimerizzazione del PDMS in seguito. Versare il PDMS sulla superficie della wafer all'interno della piastra di Petri in vetro. La miscela di PDMS nella piastra di Petri conterrà molte bolle da sottoporre a degasaggio.

Posizionare il PDMS, la piastra di Petri, in un essiccatore collegato a una pompa a vuoto per circa 30 minuti, fino a quando tutte le bolle sono state rimosse. Polimerizzare il PDMS ponendo la piastra di Petri con il wafer su una piastra riscaldante a 120 gradi Celsius per un'ora, seguita da 65 gradi Celsius per un'altra ora. Trascorse le due ore, rimuovere il wafer in foglio di alluminio e il PDMS polimerizzato dalla piastra di Petri in vetro.

Sfilare con cura la lamina di alluminio dal PDMS partendo dal retro della wafer. Successivamente, sollevare delicatamente lo strato di PDMS dalla parte superiore della wafer. Posizionare lo strato di PDMS a testa in giù, con i canali rivolti verso l'alto, sul banco di lavoro e ritagliare con attenzione i singoli design dei chip impressi sul PDMS utilizzando il bisturi.

Cercare di mantenere circa tre millimetri di PDMS attorno ai bordi dei canali. Il passaggio successivo consiste nel praticare dei fori nel PDMS alle estremità del canale di ingresso, di uscita e del canale laterale, come illustrato in questo diagramma. Per praticare un foro, spingere completamente attraverso il PDMS, in modo dritto, un ago da 20 gauge.

Rimuovere la colonna di PDMS nel puntale dell'esca prima di estrarre il puntale. Anche in questo caso, ciò impedisce alla colonna di PDMS di ostruire il foro appena perforato. Una volta perforati tutti i fori, pulire le superfici del chip da particelle di polvere e da residui di PDMS applicando del nastro adesivo e rimuovendolo immediatamente.

Allo stesso modo, pulire il vetrino al quale verrà fissato il chip. Posizionare il chip e il vetrino sotto la lampada UV di un pulitore a ozono UV da banco, con le superfici da legare rivolte verso la lampada, esponendole alla luce UV per sei-otto minuti, quindi appoggiare le superfici esposte una sull'altra. Toccare delicatamente lungo i bordi del chip per favorire l'adesione del PDMS al vetrino e rimuovere eventuali bolle d'aria.

Non toccare la parte superiore della struttura del canale, poiché ciò potrebbe causare l'adesione delle micro pastiglie al coperchio. Anche il vetro. Posizionare il dispositivo microfluidico appena realizzato su una piastra riscaldante a 100 gradi Celsius per un'ora.

Successivamente, verificare l'adesione del vetrino al chip in PDMS sollevando leggermente i bordi del chip in PDMS. Se ciò non è possibile, l'adesione è avvenuta con successo e il chip è pronto per l'uso. Per preparare il chip microfluidico al caricamento delle cellule, posizionare il chip nel supporto metallico con del gel di silicone tra il vetro del chip e le parti metalliche del supporto.

Per creare una guarnizione impermeabile, avvitare delicatamente i dadi per evitare di rompere il vetro. Collegare dei tubicini al canale laterale e al canale di uscita del chip. L'uso di pinzette facilita l'inserimento dei tubicini nei fori praticati.

Riempire una siringa da 50 millilitri con mezzo di coltura. Rimuovere l'aria dalla siringa e collegarla in sequenza a una siringa. Filtrare un ago da 20 gauge, un tubo corto e spesso e un tubo sottile.

Posizionare la siringa nella pompa per siringhe e far avanzare rapidamente la pompa fino a quando il tubo sottile non sarà completamente riempito di mezzo. Inserire il tubo sottile collegato alla siringa nel canale di ingresso e far fluire il mezzo attraverso il chip a una velocità di 10 microlitri al minuto. Raccogliere il mezzo in uscita dal chip in una piastra di Petri.

Il mezzo defluirà attraverso il canale laterale a causa della differenza di resistenza tra il canale laterale realizzato con il tag robusto di grandi dimensioni e il canale di uscita. Posizionare il chip sul palco del microscopio e regolare il fuoco del microscopio sui pad.

Per iniziare questa procedura, collegare una siringa da cinque millilitri con ago a innesto da 20 gauge e un tubo spesso. Caricare la siringa con circa un millilitro della sospensione cellulare da inserire nel chip. Il numero di cellule consigliato per il caricamento è compreso tra uno e cinque per dieci alla sesta cellule per millilitro.

Ridurre la portata della pompa a siringa a 0,5 microlitri al minuto. La parte più difficile di questa procedura è il caricamento delle cellule nel chip microme. Questo di solito richiede un po' di pratica.

Collegare la siringa contenente la sospensione cellulare al tubo del canale di uscita. Caricare le cellule premendo lo stantuffo della siringa. Osservare delicatamente l'ingresso delle cellule e il loro posizionamento al di sotto dei micro supporti attraverso l'oculare o lo schermo del computer.

Mantenere la pressione sul pistone fino a quando un numero sufficiente di cellule si deposita sotto i pad. Il carico ottimale è di una-tre cellule per pad. Scollegare la siringa utilizzata per il caricamento delle cellule e lavare il canale laterale per alcuni minuti a portate più elevate per rimuovere bolle d'aria e/o cellule che non hanno ancora lasciato il chip.

Ridurre nuovamente il flusso della pompa a siringa a 0,5 microlitri al minuto e chiudere il canale laterale collegandolo a un tubo spesso contenente un tappo per catetere alla sua estremità. Aumentare il flusso della pompa a siringa fino a un flusso finale compreso tra uno e cinque microlitri al minuto. I flussi possono variare a seconda del mezzo e del ceppo di lievito.

Avviare un filmato utilizzando le impostazioni del microscopio e della telecamera adatte all'obiettivo dell'esperimento. Questo è un esempio di filmato in time-lapse di una singola cellula di tipo selvatico E in crescita su YPD. Le immagini del campo sono state acquisite ogni 10 minuti e la barra della scala mostrata rappresenta cinque micrometri.

La cellula produce un totale di 30 gemme prima di morire. La durata della vita replicativa può essere determinata contando il numero di gemme prodotte da una singola cellula madre. Questi dati vengono trasformati in una curva di durata della vita tracciando la percentuale di cellule vitali in funzione del numero di gemme prodotte o del numero di generazioni.

Questa figura mostra un esempio di curve di durata della vita ottenute per un ceppo di lievito di tipo selvaggio e due ceppi mutanti. L'eliminazione del gene SER due provoca una riduzione della durata della vita, mentre l'eliminazione del gene FOB uno determina un allungamento della durata della vita. La morfologia mitocondriale in funzione dell'età può essere studiata utilizzando il dispositivo microfluidico.

È stato eseguito un esperimento sull'invecchiamento con cellule di lievito di tipo selvatico BY 7 42 che esprimono ILV 3G FP, una proteina indirizzata ai mitocondri. In questa figura, un esempio rappresentativo di modifiche associate all'età nella morfologia mitocondriale in una singola cellula è indicato dalla freccia bianca. Tutte le immagini sono riprodotte alla stessa scala e la barra di scala rappresenta cinque micrometri.

Il secondo filmato a intervalli di tempo mostra una singola cellula che esprime ILV 3G FP, proveniente dall'esperimento in cui la morfologia mitocondriale è stata osservata in funzione dell'età. Le immagini sono state acquisite ogni 30 minuti e la barra della scala rappresenta cinque micrometri. Questa ultima figura mostra le morfologie mitocondriali osservate nello stesso gruppo di cellule a diverse età replicative, prima della formazione del primo gemmulo, dopo 10 gemmulazioni e poco prima della morte.

È inclusa un'immagine esemplificativa per ciascuna classe di morfologia: tubolare, frammentata tubolare e punti e punti grandi. Le modifiche morfologiche osservate nelle cellule di età intermedia ricordano quelle precedentemente riportate monitorando continuamente le cellule durante la divisione. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali riguardo l'invecchiamento replicativo nei lieviti, come ad esempio perché una cellula di lievito invecchia, quali cambiamenti fenotipici avvengono e come questi influenzano la durata della vita replicativa del lievito?

Dopo aver visto questo video, dovresti sapere come creare i tuoi microchip e studiare l'invecchiamento replicativo nelle cellule utilizzando praticamente qualsiasi microscopio a fluorescenza.