Continuo ad alta risoluzione osservazione microscopica di replicativo invecchiamento nel lievito germogliante

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di tracciare le singole cellule di lievito aplo durante la loro intera vita replicativa. Il primo passo è creare un chip microfluidico contenente una serie di micro cuscinetti. Successivamente, le cellule di lievito vengono caricate nel chip microfluidico e, poiché l'area sotto i micro cuscinetti ha un'altezza simile al diametro di una cellula di lievito, le cellule si depositeranno lì.

Successivamente, un flusso continuo di terreno fresco viene applicato sulle cellule di lievito intrappolate e le cellule figlie emergenti vengono lavate via dal flusso di campo chiaro e fluorescenza del mezzo. La microscopia viene utilizzata per visualizzare i cambiamenti nella morfologia cellulare o degli organelli, nell'espressione proteica e nella localizzazione proteica che possono verificarsi nelle cellule di lievito invecchiate. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto al classico metodo di microdissezione è che è meno laboriosa e che consente immagini microscopiche continue a lungo termine dell'intera durata di vita delle singole cellule di lievito.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sull'invecchiamento replicativo, può essere utilizzato anche per studi che richiedono un'osservazione microscopica continua per periodi di tempo prolungati. In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché è necessario prestare attenzione in particolari fasi della produzione del chip micro feic. Inoltre, il caricamento delle celle nel chip micro feic può richiedere una certa esperienza.

Lo stampo per wafer di silicio è prodotto mediante litografia morbida. Per i dettagli sulla sua produzione si rimanda al protocollo allegato. Testo Taglia un pezzo di etichetta resistente in strisce sottili di circa 0,5 millimetri per tre millimetri.

Con un bisturi, posizionare con cura le strisce sullo stampo per wafer di silicone leggermente sopra la struttura del canale tra i canali di ingresso e il micro padre. Quindi, copri una capsula di Petri di vetro con un doppio strato di carta stagnola e metti il wafer nella capsula di Petri. Il foglio di alluminio impedirà al PDMS di scorrere tra il wafer e la capsula di Petri durante la produzione dei chip microfluidici.

Per iniziare la procedura per la produzione di chip microfluidici, posizionare un bicchiere di plastica vuoto sulla bilancia e strappare la bilancia. Versare 40 grammi di base PDMS nel bicchiere di plastica. Aggiungere l'agente indurente PDMS in un rapporto peso/peso di uno a 10, che in questo caso è di circa quattro millilitri.

Utilizzando la pipetta di plastica monouso miscelata accuratamente per diversi minuti, è importante che la miscela sia ben miscelata per garantire una corretta polimerizzazione del PDMS in seguito. Versare il PDMS sopra il wafer nella capsula di Petri di vetro. La miscela PDMS nella capsula di Petri conterrà molte bolle per Degas.

Il PDMS posiziona la capsula di Petri in un essiccato collegato a una pompa a vuoto per circa 30 minuti quando tutte le bolle sono state rimosse. Polimerizzare il PDMS posizionando la piastra di Petri con il wafer sopra una piastra calda a 120 gradi Celsius per un'ora, seguita da 65 gradi Celsius per un'altra ora. Trascorse le due ore, rimuovere il wafer di foglio di alluminio e il PDMS polimerizzato dalla capsula di Petri in vetro.

Staccare il foglio di alluminio nel PDMS dal retro del wafer. Quindi sollevare con cautela lo strato di PDMS dalla parte superiore del wafer. Posizionare lo strato PDMS capovolto con i canali rivolti verso l'alto sul banco e ritagliare con cura i disegni dei singoli chip impressi sul PDMS con il bisturi.

Cercate di mantenere circa tre millimetri di PDMS attorno ai bordi dei canali. Il passo successivo consiste nel praticare dei fori nel PDMS alle estremità dell'uscita di ingresso e del canale laterale, come illustrato in questo diagramma. Per fare un foro, spingere un tronchetto di esca calibro 20 fino in fondo attraverso il PDMS in modo rettilineo.

Rimuovere la colonna di PDMS nel tronchetto dell'esca prima di estrarre il troncone. Anche in questo caso, questo impedisce alla colonna PDMS di bloccare il foro appena perforato. Una volta che tutti i fori sono stati perforati, pulire le superfici del chip dalle particelle di polvere e dai residui di PDMS posizionando dello scotch su di esso e rimuovendo immediatamente il nastro.

Allo stesso modo, pulire il vetro di copertura a cui verrà attaccato il chip. Posizionare il chip e il vetro di copertura sotto la lampada UV di un pulitore all'ozono UV da banco con i lati che devono essere incollati insieme, di fronte alla lampada esposta alla luce UV per sei-otto minuti e posizionare le superfici esposte una sopra l'altra. Picchiettare delicatamente intorno ai lati del chip per favorire il fissaggio del PDMS al vetro di copertura e per rimuovere eventuali bolle d'aria.

Non picchiettare sulla parte superiore della struttura del canale in quanto ciò potrebbe causare l'attaccamento dei micro cuscinetti al coperchio. Anche il vetro. Posizionare la configurazione microfluidica appena realizzata su una piastra calda a 100 gradi Celsius per un'ora.

Successivamente, controllare l'incollaggio del vetro di copertura al chip PDMS sollevando leggermente i bordi del chip PDMS. Se ciò non è possibile, l'incollaggio ha successo e il chip è pronto per l'uso. Per preparare il chip microfluidico per il caricamento delle celle, posizionare il chip nel supporto metallico con gel di silicone tra il vetro del chip e le parti metalliche del supporto.

Per creare una tenuta impermeabile, avvitare delicatamente i dadi per evitare di rompere il vetro. Collegare i tubi sottili al canale laterale e al canale di uscita del chip. L'uso di pinzette facilita l'inserimento del tubo nei fori praticati.

Riempire una siringa con blocco esche da 50 millilitri con terreno di coltura. Rimuovere l'aria dalla siringa e collegarla in sequenza a una siringa. Filtra un tronchetto di esche calibro 20, un tubo corto e spesso e un tubo sottile.

Posizionare la siringa nella pompa a siringa e far avanzare rapidamente la pompa fino a quando il tubo sottile non è completamente riempito di fluido. Spingere il tubo sottile collegato alla siringa nel canale di ingresso e lasciare che il fluido fluisca attraverso il chip a una velocità di 10 microlitri al minuto. Raccogli il terreno lasciando il chip in una capsula di Petri.

Il fluido si esaurirà attraverso il canale laterale. A causa della differenza di resistenza tra il canale laterale grande e resistente e il canale di uscita. Posizionare il chip sul tavolino del microscopio e impostare la messa a fuoco del microscopio sui pad.

Per iniziare questa procedura, collegare una siringa con punta da cinque millilitri a un tronchetto di esca calibro 20 e un tubo spesso. Caricare la siringa con circa un millilitro della sospensione cellulare da caricare nel chip. Il numero di cellule preferito per il carico è compreso tra una e cinque volte 10 delle sei cellule per millilitro.

Diminuire la portata della pompa a siringa a 0,5 microlitri al minuto. La parte più difficile di questa procedura è il caricamento delle cellule nel chip del microma. Questo di solito richiede un po' di pratica.

Collegare la siringa contenente la sospensione cellulare al tubo del canale di uscita. Caricare le celle premendo sullo stantuffo della siringa. Osserva delicatamente le cellule che entrano e si depositano sotto i micro cuscinetti tramite l'oculare o lo schermo del computer.

Mantenere la pressione sullo stantuffo fino a quando non si depositano celle sufficienti sotto i cuscinetti. Il carico ottimale è da una a tre celle per pad. Scollegare la siringa utilizzata per il caricamento delle celle e lavare il canale laterale per un paio di minuti a portate più elevate per rimuovere le bolle d'aria e/o le cellule che non sono ancora uscite dal chip.

Ridurre nuovamente il flusso della pompa a siringa a 0,5 microlitri al minuto e chiudere il canale laterale collegandolo a un tubo spesso contenente un tappo del catetere all'estremità. Aumentare il flusso della pompa a siringa fino a una portata finale da uno a cinque microlitri al minuto. Le portate possono variare a seconda del mezzo e del ceppo di lievito.

Inizia un filmato con il microscopio e la fotocamera con l'impostazione adatta all'obiettivo dell'esperimento. Questo è un esempio di filmato time-lapse di una singola cellula E di tipo selvatico che cresce su YPD. Le immagini medie sono state scattate ogni 10 minuti e la barra della scala appena mostrata rappresenta cinque micrometri.

La cellula produce un totale di 30 gemme prima di morire. La durata della vita replicativa può essere determinata contando il numero di gemme prodotte da una singola cellula madre. Questi dati vengono trasformati in una curva della durata della vita tracciando la percentuale di cellule vitali rispetto al numero di gemme prodotte o al numero di generazioni.

Questa figura mostra un esempio di curve di durata della vita ottenute per un ceppo di lievito wild type e due ceppi mutanti. La delezione del gene SER 2 si traduce in una durata di vita più breve, mentre la delezione del gene FOB 1 si traduce in una durata di vita più lunga. La morfologia mitocondriale in funzione dell'età può essere studiata utilizzando il dispositivo microfluidico.

È stato eseguito un esperimento di invecchiamento con BY 7 42 cellule di lievito wild type che esprimono ILV 3G FP, che è mirato ai mitocondri. In questa figura, un esempio rappresentativo di cambiamenti associati all'età nella morfologia mitocondriale in una singola cellula è indicato dalla freccia bianca. Tutte le immagini sono scalate in modo identico e la barra della scala rappresenta cinque micrometri.

Il secondo filmato time lapse è di una singola cellula che esprime ILV 3G FP dall'esperimento in cui è stata osservata la morfologia mitocondriale in funzione dell'età. Le immagini sono state scattate ogni 30 minuti e la barra della scala rappresenta cinque micrometri. Questa figura finale mostra le morfologie mitocondriali osservate nello stesso insieme di cellule a diverse età replicative prima di produrre la loro prima gemma dopo 10 gemme e prima della morte.

Un'immagine di esempio di ciascuna classe di morfologia è inclusa tubolare, tubolare frammentato e macchie e macchie grandi. I cambiamenti morfologici osservati nelle cellule di mezza età assomigliano a quelli riportati in precedenza monitorando continuamente le cellule mentre si dividono. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nell'invecchiamento replicativo del lievito, ad esempio perché una cellula di lievito invecchia, quali cambiamenti fenotipici stanno avvenendo e in che modo questi influenzano la durata della vita replicativa del lievito?

Dopo aver visto questo video, dovresti sapere come creare i tuoi microchip e studiare l'invecchiamento replicativo nelle cellule usando praticamente qualsiasi microscopio a fluorescenza.