Name: Continuo ad alta risoluzione osservazione microscopica di replicativo invecchiamento nel lievito germogliante (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: Scopri l'osservazione microscopica continua dell'invecchiamento replicativo nel lievito germogliante utilizzando un dispositivo microfluidico. Questo metodo consente il tracciamento a lungo termine delle singole cellule di Saccharomyces cerevisiae.

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Vorremmo ringraziare Laura Schippers per scrivere le prime versioni del protocollo di carico delle cellule e Marcus de Goffau e Guille Zampar per aver morfologie mitocondriali.

1. Produzione e preparazione di un wafer di silicio Mold Chip microfluidici sono creati da uno stampo wafer di silicio prodotto da litografia morbida. Questi wafer possono essere riutilizzati più volte per produrre chip microfluidici. È opportuno che la produzione di un rispettivo wafer viene eseguita da un gruppo specializzato nella microfluidica 6. Il wafer è realizzato in un processo di fotolitografia due fasi utilizzando due diversi strati di fotoresist negativo, SU-8 7. Lo strato inferiore è utilizzato per generare la zona di cattura cella (SU-8 2002; altezza 3-4 micron), mentre i canali sono realizzati con lo strato superiore (SU-8 2010; altezza 10 micron). Un&#39;impressione del processo di produzione di wafer può essere trovato in Huang et al 8. I disegni dei chip microfluidici sono disponibili presso gli autori, nonché consigli su come ottenere un rispettivo wafer. <ol><li> Una volta che il wafer viene ottenuta, tagliare un pezzo di dura-Tag into sottili strisce di circa 0,5 mm per 3 mm con un bisturi e metterli attenzione sul wafer leggermente sopra la struttura di canale tra i canali di entrata e l&#39;array Micropad (Figura 2A). Questo comporterà la formazione di un grande canale supplementare in ogni chip, che non sarà utilizzato solo durante il caricamento delle cellule, ma è anche importante per il funzionamento stabile del dispositivo microfluidica. </li><li> Coprire il piatto di vetro Petri con un doppio strato di foglio di alluminio e mettere il wafer nella scatola di Petri. Il foglio di alluminio impedisce l&#39;esecuzione in PDMS tra il wafer ed il piatto Petri. Se PDMS fa insinuarsi tra il wafer ed il piatto di vetro Petri, il wafer diventerà permanentemente fissata nella capsula di Petri. Sebbene il wafer è ancora utilizzabile, non sarà possibile sostituire il piatto di vetro Petri se si rompe e il PDMS dovrà essere tagliato in seguito. </li></ol> 2. Produzione di chip microfluidici <ol><li> Posizionare una plastica vuotacoppa sulla bilancia e tarare la bilancia. Versare 40 g di PDMS di base nella tazza di plastica (per un cm di diametro piatto di vetro Petri 12). Aggiungi PDMS catalizzatore con una pipetta monouso in rapporto p / w di 1:10, cioè circa 4 ml. </li><li> Mescolare il PDMS e vulcanizzante accuratamente per parecchi minuti. Questo può essere fatto con la pipetta monouso utilizzato per pipettare il catalizzatore. E &#39;importante che la miscela sia ben mescolata prima di versare sulla parte superiore del wafer. Povero miscelazione causerà parte del PDMS non a polimerizzare. </li><li> Versare il PDMS sopra il wafer nel piatto di vetro Petri. </li><li> Miscelazione di PDMS con il catalizzatore porterà alla formazione di bolle nella miscela PDMS. Queste bolle devono essere rimossi prima del PDMS polimerizza. Il PDMS può essere degassato dopo versandolo sulla cima del wafer mettendo la piastra di Petri in un essiccatore collegato ad una pompa a vuoto. Con questa configurazione, ci vogliono circa 30 min per rimuovere tutte le bolle dalla miscela. </li><li> Polimerizzare The PDMS ponendo capsula di Petri con la cialda sulla cima di una piastra calda a 120 ° C per 1 ora e poi a 65 ° C per un&#39;altra ora. </li><li> Rimuovere il foglio di alluminio insieme al wafer e polimerizzato PDMS dal piatto di vetro Petri. Staccare il foglio di alluminio e lo strato sottile di residuo polimerizzato PDMS dal retro del wafer. Lo strato di PDMS sopra il wafer può quindi essere separata dal wafer sollevandola attentamente. </li><li> Posizionare lo strato di PDMS a testa in giù (con i canali verso l&#39;alto) in panchina e ritagliare i disegni single chip impresse sul PDMS accuratamente con un bisturi. Cercare di trattenere circa 3 mm di PDMS attorno ai bordi dei canali per migliorare attaccamento del chip per il vetro di copertura in seguito. </li><li> Eseguire fori PDMS alle estremità del canale di ingresso, uscita e laterale (Figura 2A) spingendo un 20 Gauge stub Luer tutto il percorso attraverso il PDMS in modo rettilineo. </li></ol> Assicurarsi che il chip PDMSè ancora sdraiato a testa in giù sulla panca mentre punzonatura dei fori. Questo impedisce PDMS di attaccarsi alla parte interna del canale, che potrebbe causare il blocco del canale. <ol start="9"><li> Dopo la punzonatura ogni foro, rimuovere la colonna di PDMS nel stub Luer con le pinzette prima di tirare il mozzicone di nuovo fuori. La colonna PDMS potrebbe altrimenti rimanere dietro e bloccare il foro di appena un pugno. </li><li> Pulire le superfici del chip da particelle di polvere e residui PDMS mettendo nastro adesivo su di esso e rimuovendo immediatamente il nastro nuovo. Allo stesso modo la pulizia del vetro di copertura a cui verrà allegato il chip. </li><li> Posizionare il chip puliti e vetro di copertura sotto la lampada UV del banco UV-Ozono Cleaner. Le parti che devono essere legati insieme devono affrontare la lampada. </li><li> Esporre il PDMS e vetro di copertura alla luce UV per 6-8 minuti e poi mettere direttamente il chip sul vetro coperchio posizionando le superfici esposte sopra l&#39;altro. </li><li> Battere delicatamente intorno ai lati del chippromuovere fissaggio della PDMS al vetro di copertura e per rimuovere eventuali bolle d&#39;aria. Non toccare in cima alla struttura del canale in quanto ciò potrebbe causare la micropads di si attaccano al vetro di copertura pure. </li><li> Posizionare il setup microfluidica appena fatto su un piatto caldo a 100 ° C per 60 min. Testare la forza del legame tra il vetro di copertura e il chip PDMS cercando di sollevare i bordi del chip PDMS leggermente. Quando il blocco PDMS non può essere sollevato dalla superficie del vetro, il legame è riuscita e il chip è pronto all&#39;uso. </li></ol> 3. Preparazione del circuito integrato per cella di carico Guasto di un dispositivo microfluidica può potenzialmente causare perdite di media nel microscopio. Per evitare questo, è consultivo utilizzare un supporto metallico e / o sigillare i lati del circuito integrato dove il PDMS incontra il vetro con smalto o colla epossidica. Questo impedisce la fuoriuscita del fluido nel caso del chip PDMS non è incollato abbastanza bene per il vetro di copertura. Anche il tuboconnessioni possono essere fissate attorno ai punti di inserzione in un modo simile per evitare la fuoriuscita del fluido. Un sensore di acqua fatto in casa che spegne la pompa a siringa in caso di perdite può essere usato come una precauzione di sicurezza in più. Disegni del metallo titolare appositamente per il chip microfluidica sono disponibili presso gli autori. <ol><li> Posizionare il chip microfluidica nel supporto metallico, con gel di silicone tra il vetro del chip e le parti metalliche della porta per creare una tenuta stagna. Avvitare i dadi delicatamente, per non rompere il vetro. </li><li> Collegare tubi sottili (ca. lunga 5-15 cm) al canale laterale e il canale di uscita del chip. L&#39;uso di pinzette rende più facile inserire il tubo nei fori perforati. </li><li> Riempire un ml Luer-Lok siringa da 50 con terreno di coltura, rimuovere l&#39;aria dalla siringa e collegarla in modo sequenziale ad un filtro a siringa, una calibro 20 stub Luer, un tubo di spessore corta (lunga ca. 2 cm) e di un tubo sottile. Assicurarsi che il sottile vascae è abbastanza lungo da coprire la distanza tra la pompa siringa e la fase microscopio. </li><li> Posizionare la siringa nella pompa a siringa, l&#39;avanzamento rapido della pompa fino a quando il tubo sottile è completamente riempito con il mezzo. </li><li> Spingere il tubo sottile collegato alla siringa nel canale di entrata del chip e lasciare defluire mezzo attraverso il chip a 10 microlitri / min (Figura 2B). Raccogliere il mezzo lasciando il chip (ad esempio in una capsula di Petri). Il mezzo sarà eseguito mediante il canale laterale a causa della differenza tra la resistenza Duro-Tag reso grande canale laterale e il canale di uscita. </li><li> Posizionare il chip in fase microscopio e impostare il fuoco del microscopio sui pad. </li></ol> L&#39;uso di obiettivi di immersione in olio è preferito rispetto quella di obiettivi immersione in acqua perché l&#39;olio non secca nel tempo-corso dell&#39;esperimento. A seconda del microscopio ci potrebbero essere problemi con conservando il focus durante le prime ore di questo esperimento. Si consiglia pertanto di lasciare il chip per una o due ore in fase di microscopio in modo che possa stabilirsi prima di caricare le cellule e iniziare l&#39;esperimento. 4. Caricamento di cellule di lievito nel chip microfluidica <ol><li> Collegare un ml Luer siringa da 5 a 20 Gauge stub Luer e un tubo di spessore (ca. 3 cm). </li><li> Prelevare un campione della coltura cellulare per essere caricato nel chip. </li></ol> La conta delle cellule preferito per caricamento è tra 1-5 x 10 6 cellule per ml. Culture con conta delle cellule più alte devono essere diluite prima del caricamento. Quando le cellule in cultura in YPD, efficienza di carico cella possono essere migliorate molte volte se le cellule vengono lavate con prima e risospese in terreno minimo contenente una percentuale simile al glucosio prima del caricamento. Durante il funzionamento del chip, YPD mezzo può ancora essere utilizzato in modo sicuro. <ol start="3"><li> Caricare circa 1 ml di sospensione cellulare in the siringa e rimuovere tutta l&#39;aria dalla siringa. </li><li> Diminuire la portata della pompa a siringa 0,5 microlitri / min. Il flusso basso e costante applicata dalla pompa siringa durante il caricamento (nel passo 4.5) spingerà cellule non iscritti mediante il canale laterale (Figura 2C). </li><li> Collegare la siringa contenente la sospensione cellulare al tubo del canale di uscita. Caricare le celle premendo sullo stantuffo della siringa delicatamente. Osservare le cellule che entrano ed assestamento sotto le micropads via oculare o tramite lo schermo del computer. </li><li> Mantenere la pressione sullo stantuffo fino a quando le cellule sufficienti sistemano sotto i pad. Il carico ottimale è di 1-3 cellule per pad. Come le cellule si depositano sotto le pastiglie a caso, è abbastanza comune che un paio di pastiglie non contengono le cellule e gli altri rilievi sono completamente pieni di cellule. </li><li> Staccare la siringa usata per il carico delle cellule e il tubo di spessore ad esso collegato dal tubo sottile del canale di scarico, lavare la parte chAnnel per un paio di minuti a portate più elevate (10 microlitri / min) per rimuovere le bolle d&#39;aria e / o cellule che ancora non escono il chip (Figura 2B). Se le cellule non vengono rimossi dal canale laterale, possono iniziare a crescere nel canale laterale e interferire con l&#39;esperimento in seguito. </li><li> Mettere il flusso della pompa a siringa indietro fino a 0,5 microlitri / min e chiudere il canale laterale fuori collegandolo ad un tubo di spessore (lungo circa 5 cm) contenente una spina catetere alla sua estremità (Figura 2D). </li><li> Aumentare il flusso di una portata finale di 1-5 microlitri / min. La portata può variare a seconda di medie e ceppo di lievito. </li><li> Avviare un filmato con le impostazioni del microscopio e la fotocamera adatta per l&#39;obiettivo dell&#39;esperimento. Assicurarsi che la velocità della fase di microscopio è impostata una velocità bassa che l&#39;olio può seguire. Per la determinazione della durata della vita replicativa, celle di immagine ogni 10 min. Per proteggere le cellule dai minute quantità di luce UV emessa dalla alogenolampada, che è usato durante l&#39;acquisizione DIC, è consigliabile utilizzare un filtro UV supplementare nel percorso ottico. Quando si utilizza la microscopia a fluorescenza, si preferisce un&#39;immagine cellule minore frequenza (ad esempio ogni 20 min) per evitare effetti fototossiche. L&#39;esperimento è completato quando tutte le celle caricate all&#39;inizio dell&#39;esperimento sono morti, che in condizioni normali richiede fino a 5 giorni. Si raccomanda di controllare regolarmente la messa a fuoco delle immagini durante l&#39;esperimento e, se necessario, regolarlo. </li></ol>

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<li>Vanoni, M., Vai, M., Popolo, L., Alberghina, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+heterogeneity+in+populations+of+the+budding+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Structural heterogeneity in populations of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> J. Bacteriol. 156 (3), 1282-1291 (1983).</li>
<li>Huh, W. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+protein+localization+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global analysis of protein localization in budding yeast.</a> Nature. 425 (6959), 686-691 (2003).</li>
<li>Zhang, Y., Luo, C., Zou, K., Xie, Z., Brandman, O., Ouyang, Q., Li, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+analysis+of+yeast+replicative+aging+using+a+new+generation+of+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Single cell analysis of yeast replicative aging using a new generation of microfluidic device.</a> PLoS One. 7 (11), e48275(2012).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Il metodo microfluidica descritto qui è un importante strumento di romanzo in ricerca di invecchiamento in quanto permette semplice e automatizzato generazione di lievito replicative dati di durata della vita in combinazione con immagini in sequenza ad alta risoluzione. Questi attributi sono importanti miglioramenti rispetto alle possibilità sperimentali del metodo classico dissezione, ma ci sono alcune limitazioni del metodo che devono essere presi in considerazione. Si noti che la durata d...

Gemmazione lievito è un importante organismo modello per la ricerca di invecchiamento 1. Fino a poco studiando replicativa invecchiamento in cellule di lievito è un processo complesso che richiede un metodo di dissezione, in cui ciascuna gemma stata rimossa manualmente dalla cellula madre 2,3. Per risolvere questo problema, abbiamo recentemente presentato una nuova impostazione microfluidica in grado di tenere traccia di cellule madri singole in tutto il loro intero ciclo di vita 4. Nel nostro chip microfluidica, le cellule di lievito sono intrappolati sotto morbide micropads a base di elastomeri (vedi Figura 1). Un flusso continuo di medie lava via cellule figlie di nuova formazione e fornisce le cellule con sostanze nutritive fresche. In un singolo esperimento, fino a 50 cellule madri possono essere monitorati in modo completamente automatico durante il loro intero ciclo di vita replicativa. A causa delle eccellenti proprietà ottiche del chip microfluidica, è possibile monitorare contemporaneamente diversi aspetti della biologia delle cellule di lievito (es </em&gt;, utilizzando proteine ​​fluorescenti). Rispetto al metodo classico dissezione, la configurazione microfluidica offre notevoli vantaggi. Si garantisce un ambiente definito e costante durante l&#39;intero esperimento invecchiamento. Non richiede attrezzature specializzate costoso e può essere eseguito su qualsiasi microscopio dotato di messa a fuoco automatica e capacità di time-lapse, nonché di controllo della temperatura per la coltivazione delle cellule. La produzione e il funzionamento dei chip microfluidici possono essere apprese in pochi giorni. Inoltre, le cellule possono essere caricate direttamente da una coltura in crescita esponenziale, un vantaggio rispetto ad un altro metodo microfluidica recentemente pubblicato 5, che richiede biotinilazione di cellule madri. Combinato con un imaging ad alta risoluzione, il metodo qui descritto può essere usato per misurare cambiamenti graduali nella morfologia cellulare, l&#39;espressione della proteina e localizzazione durante lievito invecchiamento in un modo senza precedenti. La possibilità dimonitoraggio a lungo termine di cellule singole fornisce anche possibilità uniche per studi ciclo cellulare del lievito. un Questo metodo è stato recentemente ottimizzato per rimuovere la biotinilazione dal protocollo 16, che è stato pubblicato mentre questo manoscritto era in revisione.

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENTS</td></tr><tr><td>DC Sylgard 184 elastomero </td><td>Mavom bv</td><td>1060040</td><td>Questa confezione contiene la base PDMS e l'agente indurente PDMS.</td></tr><tr><td>Piastre di Petri in vetro 120/20 mm </td><td>VWR International</td><td>391-2850</td><td></td></tr><tr><td>Occhiali di copertura 22x40 mm </td><td>CBN Labsuppliers BV</td><td>190002240</td><td></td></tr><tr><td>Tough-Tags </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359106</td><td></td></tr><tr><td>Foglio </td><td></td><td></td><td></td>di alluminio</tr> <tr><td>Tazza </td><td></td><td></td><td></td>monouso in plastica</tr> <tr><td>Pipetta sierologica 5 ml </td><td>VWR International</td><td>612-1245</td><td></td></tr><tr><td>Nastro adesivo </td><td>VWR International</td><td>819-1460</td><td></td></tr><tr><td>Pasta Baysilone (siliconi GE Bayer) </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85403-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Tubo microforo in PTFE, 0,012"ID x 0,030"OD </td><td>Cole Parmer</td><td>EW-06417-11</td><td>Indicato come tubo sottile </td></tr><tr><td>Tubo microborato Tygon, 0,030"ID x 0,090"OD </td><td>Cole Parmer</td><td>EW-06418-03</td><td>Indicato come tubo spesso </td></tr><tr><td>Bisturi </td><td>VWR International</td><td>233-5334</td><td></td></tr><tr><td>Siringhe Luer-Lok da 50 ml </td><td>300137</td><td></td><td></td></tr><tr><td>siringhe BD da 5 ml, pinzette Luer tip </td><td>VWR International</td><td>613-1599</td><td></td></tr><tr><td> </td><td>VWR International</td><td>232-2132</td><td></td></tr><tr><td>Tronchetti Luer calibro 20 </td><td>Instech Solomon</td><td>LS20</td><td></td></tr><tr><td>Filtri per siringhe (dimensione dei pori 0,20 &mu; m) </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>16534K</td><td></td></tr><tr><td>Tappo per catetere in acciaio inossidabile, 20 ga x12 mm </td><td>Instech Solomon</td><td>SP20/12</td><td></td></tr><tr><td>Piastre di Petri </td><td>VWR International</td><td>391-0892</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> EQUIPMENT</td></tr><tr><td>Detergente per ozono UV da banco </td><td>NOVA Scan</td><td>PSD-UVT</td><td></td></tr><tr><td>Pompa Harvard 11 Apparecchio Harvard Elite </td><td></td><td>70-4505</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 Stampo master in silicone (wafer) </td><td></td><td></td><td>Autocostruito; Per i dettagli contattare l'autore corrispondente </td></tr><tr><td>Balance </td><td>Sartorius corporation</td><td>ED4202S</td><td></td></tr><tr><td>Pompa per vuoto </td><td>KNF Neuberger</td><td>N022 AN.18</td><td></td></tr><tr><td>Essiccatore </td><td>VWR International</td><td>467-2115</td><td></td></tr><tr><td>Piastra riscaldante </td><td>VWR International</td><td>460-3267</td><td></td></tr><tr><td>Opzionale: Supporto in metallo per vetro di copertura (22x40 mm) </td><td></td><td></td><td>Autoprodotto; Per i dettagli contattare l'autore corrispondente </td></tr><tr><td>(Fluorescenza) Microscopio con obiettivo 60x, autofocus, capacità time-lapse e preferibilmente un tavolino automatizzato (controllo XY motorizzato) </td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti-E</td><td></td></tr></tbody></table>

continuo ad alta risoluzione osservazione microscopica di replicativo invecchiamento nel lievito germogliante

Continuous High-resolution Microscopic Observation of Replicative Aging in Budding Yeast

Dimostriamo l&#39;uso di una semplice impostazione microfluidica, in cui le cellule di lievito in erba singole possono essere monitorati in tutto il loro intero ciclo di vita. Il chip microfluidica sfrutta la differenza di dimensioni tra madre e figlia cellule utilizzando un array di micropads. Su caricamento, le cellule sono intrappolati sotto queste micropads, perché la distanza tra la Micropad e il vetro di copertura è simile al diametro di una cellula di lievito (3-4 micron). Dopo la procedura di caricamento, mezzo di coltura viene alimentata continuamente attraverso il chip, che non soltanto crea un ambiente costante e definita in tutto l&#39;intero esperimento, ma anche elimina le cellule figlie emergenti, non trattenuti sotto le pastiglie a causa della loro dimensione. Il setup conserva cellule madri modo così efficiente che in un singolo esperimento fino a 50 singole cellule possono essere monitorati in modo completamente automatizzato per 5 giorni o, se necessario, più lungo. Inoltre, le eccellenti proprietà ottiche del chip permettono elevatoImmagini a risoluzione di cellule durante l&#39;intero processo di invecchiamento.

In questo protocollo, le cellule vengono caricati nel chip microfluidica direttamente da coltura metà esponenziale. Per accertare se la distribuzione dell&#39;età di cellule intrappolate nel chip microfluidica è simile a quella della coltura prima del carico, le cellule sono state colorate con grano agglutinin coniugato a FITC (WGA-FITC) per visualizzare cicatrici gemma. Come visibile in figura 3, l&#39;intrappolamento delle cellule sotto le micropads del chip microfluidica non è polarizzato a cellule d...

Descriviamo qui il funzionamento di un dispositivo microfluidico che permette continuo e ad alta risoluzione di immagini microscopiche di cellule di lievito in erba singole durante la loro replicazione completa e / o durata cronologica.

Continuo ad alta risoluzione osservazione microscopica di replicativo invecchiamento nel lievito germogliante

We demonstrate the use of a simple microfluidic setup, in which single budding yeast cells can be tracked throughout their entire lifespan. The ...

L'obiettivo generale di questa procedura è seguire cellule di lievito aploidi singole durante l'intera durata della loro vita replicativa. Il primo passaggio consiste nel realizzare un chip microfluidico contenente un reticolo di micro piastre. Successivamente, le cellule di lievito vengono caricate nel chip microfluidico e, poiché lo spazio sotto le micro piastre ha un'altezza simile al diametro di una cellula di lievito, le cellule si depositano in quella zona.Successivamente, viene applicato un flusso continuo di mezzo fresco sulle cellule di lievito intrappolate, e le cellule figlie emergenti vengono rimosse dal flusso del mezzo in microscopia a campo chiaro e in fluorescenza. La microscopia viene utilizzata per visualizzare i cambiamenti nella morfologia cellulare o degli organelli, nell'espressione proteica e nel localizzazione proteica che possono verificarsi nelle cellule di lievito invecchianti. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto al metodo classico di microdissezione è che richiede meno lavoro ed è in grado di fornire immagini microscopiche continue a lungo termine dell'intera durata di vita di singole cellule di lievito.Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sull'invecchiamento replicativo, può anche essere utilizzato per studi che richiedono un'osservazione microscopica continua per periodi prolungati. In generale, le persone alle prime armi con questa tecnica potrebbero incontrare difficoltà poiché è necessaria particolare attenzione in determinati passaggi della produzione del chip micro feic. Inoltre, il caricamento delle cellule nel chip micro feic potrebbe richiedere una certa esperienza.Il getto in silicio è prodotto mediante litografia morbida. Per i dettagli sulla sua produzione, si prega di fare riferimento al protocollo allegato. Tagliare un pezzo di tough tag in strisce sottili di circa 0,5 millimetri per tre millimetri.Con un bisturi, posizionare con attenzione le strisce sullo stampo in wafer di silicio leggermente sopra la struttura del canale compresa tra i canali di ingresso e il micro padre. Successivamente, coprire una piastra di Petri in vetro con un doppio strato di carta d'alluminio e inserire il wafer nella piastra di Petri. La carta d'alluminio impedirà al PDMS di infiltrarsi tra il wafer e la piastra di Petri durante la produzione dei chip microfluidici.Per iniziare la procedura di fabbricazione di chip microfluidici, posizionare un bicchiere di plastica vuoto sulla bilancia e tarare la bilancia. Versare 40 grammi di base PDMS nel bicchiere di plastica. Aggiungere l'agente indurente PDMS in un rapporto ponderale di uno a 10, che in questo caso corrisponde a circa quattro millilitri.Utilizzando la pipetta di plastica monouso, mescolare accuratamente per diversi minuti; è importante che la miscela sia ben omogeneizzata per garantire una corretta polimerizzazione del PDMS in seguito. Versare il PDMS sulla superficie della wafer all'interno della piastra di Petri in vetro. La miscela di PDMS nella piastra di Petri conterrà molte bolle da sottoporre a degasaggio.Posizionare il PDMS, la piastra di Petri, in un essiccatore collegato a una pompa a vuoto per circa 30 minuti, fino a quando tutte le bolle sono state rimosse. Polimerizzare il PDMS ponendo la piastra di Petri con il wafer su una piastra riscaldante a 120 gradi Celsius per un'ora, seguita da 65 gradi Celsius per un'altra ora. Trascorse le due ore, rimuovere il wafer in foglio di alluminio e il PDMS polimerizzato dalla piastra di Petri in vetro.Sfilare con cura la lamina di alluminio dal PDMS partendo dal retro della wafer. Successivamente, sollevare delicatamente lo strato di PDMS dalla parte superiore della wafer. Posizionare lo strato di PDMS a testa in giù, con i canali rivolti verso l'alto, sul banco di lavoro e ritagliare con attenzione i singoli design dei chip impressi sul PDMS utilizzando il bisturi.Cercare di mantenere circa tre millimetri di PDMS attorno ai bordi dei canali. Il passaggio successivo consiste nel praticare dei fori nel PDMS alle estremità del canale di ingresso, di uscita e del canale laterale, come illustrato in questo diagramma. Per praticare un foro, spingere completamente attraverso il PDMS, in modo dritto, un ago da 20 gauge.Rimuovere la colonna di PDMS nel puntale dell'esca prima di estrarre il puntale. Anche in questo caso, ciò impedisce alla colonna di PDMS di ostruire il foro appena perforato. Una volta perforati tutti i fori, pulire le superfici del chip da particelle di polvere e da residui di PDMS applicando del nastro adesivo e rimuovendolo immediatamente.Allo stesso modo, pulire il vetrino al quale verrà fissato il chip. Posizionare il chip e il vetrino sotto la lampada UV di un pulitore a ozono UV da banco, con le superfici da legare rivolte verso la lampada, esponendole alla luce UV per sei-otto minuti, quindi appoggiare le superfici esposte una sull'altra. Toccare delicatamente lungo i bordi del chip per favorire l'adesione del PDMS al vetrino e rimuovere eventuali bolle d'aria.Non toccare la parte superiore della struttura del canale, poiché ciò potrebbe causare l'adesione delle micro pastiglie al coperchio. Anche il vetro. Posizionare il dispositivo microfluidico appena realizzato su una piastra riscaldante a 100 gradi Celsius per un'ora.Successivamente, verificare l'adesione del vetrino al chip in PDMS sollevando leggermente i bordi del chip in PDMS. Se ciò non è possibile, l'adesione è avvenuta con successo e il chip è pronto per l'uso. Per preparare il chip microfluidico al caricamento delle cellule, posizionare il chip nel supporto metallico con del gel di silicone tra il vetro del chip e le parti metalliche del supporto.Per creare una guarnizione impermeabile, avvitare delicatamente i dadi per evitare di rompere il vetro. Collegare dei tubicini al canale laterale e al canale di uscita del chip. L'uso di pinzette facilita l'inserimento dei tubicini nei fori praticati.Riempire una siringa da 50 millilitri con mezzo di coltura. Rimuovere l'aria dalla siringa e collegarla in sequenza a una siringa. Filtrare un ago da 20 gauge, un tubo corto e spesso e un tubo sottile.Posizionare la siringa nella pompa per siringhe e far avanzare rapidamente la pompa fino a quando il tubo sottile non sarà completamente riempito di mezzo. Inserire il tubo sottile collegato alla siringa nel canale di ingresso e far fluire il mezzo attraverso il chip a una velocità di 10 microlitri al minuto. Raccogliere il mezzo in uscita dal chip in una piastra di Petri.Il mezzo defluirà attraverso il canale laterale a causa della differenza di resistenza tra il canale laterale realizzato con il tag robusto di grandi dimensioni e il canale di uscita. Posizionare il chip sul palco del microscopio e regolare il fuoco del microscopio sui pad.Per iniziare questa procedura, collegare una siringa da cinque millilitri con ago a innesto da 20 gauge e un tubo spesso. Caricare la siringa con circa un millilitro della sospensione cellulare da inserire nel chip. Il numero di cellule consigliato per il caricamento è compreso tra uno e cinque per dieci alla sesta cellule per millilitro.Ridurre la portata della pompa a siringa a 0,5 microlitri al minuto. La parte più difficile di questa procedura è il caricamento delle cellule nel chip microme. Questo di solito richiede un po' di pratica.Collegare la siringa contenente la sospensione cellulare al tubo del canale di uscita. Caricare le cellule premendo lo stantuffo della siringa. Osservare delicatamente l'ingresso delle cellule e il loro posizionamento al di sotto dei micro supporti attraverso l'oculare o lo schermo del computer.Mantenere la pressione sul pistone fino a quando un numero sufficiente di cellule si deposita sotto i pad. Il carico ottimale è di una-tre cellule per pad. Scollegare la siringa utilizzata per il caricamento delle cellule e lavare il canale laterale per alcuni minuti a portate più elevate per rimuovere bolle d'aria e/o cellule che non hanno ancora lasciato il chip.Ridurre nuovamente il flusso della pompa a siringa a 0,5 microlitri al minuto e chiudere il canale laterale collegandolo a un tubo spesso contenente un tappo per catetere alla sua estremit&agrave;. Aumentare il flusso della pompa a siringa fino a un flusso finale compreso tra uno e cinque microlitri al minuto. I flussi possono variare a seconda del mezzo e del ceppo di lievito.Avviare un filmato utilizzando le impostazioni del microscopio e della telecamera adatte all'obiettivo dell'esperimento. Questo è un esempio di filmato in time-lapse di una singola cellula di tipo selvatico E in crescita su YPD. Le immagini del campo sono state acquisite ogni 10 minuti e la barra della scala mostrata rappresenta cinque micrometri.La cellula produce un totale di 30 gemme prima di morire. La durata della vita replicativa può essere determinata contando il numero di gemme prodotte da una singola cellula madre. Questi dati vengono trasformati in una curva di durata della vita tracciando la percentuale di cellule vitali in funzione del numero di gemme prodotte o del numero di generazioni.Questa figura mostra un esempio di curve di durata della vita ottenute per un ceppo di lievito di tipo selvaggio e due ceppi mutanti. L'eliminazione del gene SER due provoca una riduzione della durata della vita, mentre l'eliminazione del gene FOB uno determina un allungamento della durata della vita. La morfologia mitocondriale in funzione dell'età può essere studiata utilizzando il dispositivo microfluidico.È stato eseguito un esperimento sull'invecchiamento con cellule di lievito di tipo selvatico BY 7 42 che esprimono ILV 3G FP, una proteina indirizzata ai mitocondri. In questa figura, un esempio rappresentativo di modifiche associate all'età nella morfologia mitocondriale in una singola cellula è indicato dalla freccia bianca. Tutte le immagini sono riprodotte alla stessa scala e la barra di scala rappresenta cinque micrometri.Il secondo filmato a intervalli di tempo mostra una singola cellula che esprime ILV 3G FP, proveniente dall'esperimento in cui la morfologia mitocondriale è stata osservata in funzione dell'età. Le immagini sono state acquisite ogni 30 minuti e la barra della scala rappresenta cinque micrometri. Questa ultima figura mostra le morfologie mitocondriali osservate nello stesso gruppo di cellule a diverse età replicative, prima della formazione del primo gemmulo, dopo 10 gemmulazioni e poco prima della morte.È inclusa un'immagine esemplificativa per ciascuna classe di morfologia: tubolare, frammentata tubolare e punti e punti grandi. Le modifiche morfologiche osservate nelle cellule di età intermedia ricordano quelle precedentemente riportate monitorando continuamente le cellule durante la divisione. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali riguardo l'invecchiamento replicativo nei lieviti, come ad esempio perché una cellula di lievito invecchia, quali cambiamenti fenotipici avvengono e come questi influenzano la durata della vita replicativa del lievito?Dopo aver visto questo video, dovresti sapere come creare i tuoi microchip e studiare l'invecchiamento replicativo nelle cellule utilizzando praticamente qualsiasi microscopio a fluorescenza.

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