Name: Quantificazione simultanea di kynurenine selezionate analizzate dalla cromatografia liquida-spettrometria di massa in mezzo raccolto da colture cellulari tumorali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-09T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: Scopri come quantificare i metaboliti del triptofano nella via del chinurenina usando la cromatografia liquida-spettrometria di massa su colture cellulari tumorali. Questo protocollo validato garantisce dati affidabili per la ricerca oncologica.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questo lavoro è stato sostenuto dall'Unione Europea dal Fondo europeo di sviluppo regionale nell'ambito del programma operativo sviluppo della Polonia orientale 2007-2013 (POPW.01.03.00-06-003/09-00), dalla Facoltà di Biotecnologie e Scienze Ambientali dell'Università Cattolica Giovanni Paolo II di Lublino (sovvenzione giovani scienziati per Ilona Sadok), Centro nazionale di scienze polacco, OPUS13 (25/2017/B/NZ4/01198 per Magdalena Staniszewska, Principle Investigator).  Gli autori ringraziano la Prof.ssa Agnieszka Ścibior del Laboratorio di Stress Ossidativo, Centro per la Ricerca Interdisciplinare, JPII CUL per aver condiviso le attrezzature per la recupero cellulare e la quantificazione delle proteine.

1. Preparazione di soluzioni standard standard 3NT, Kyn, 3HKyn, 3HAA, XA standard stock
<ol><li>Pesare i reagenti in una fiala con la massima precisione (0,3 mg ciascuno). Per una migliore precisione, scalare i reagenti, regolando il volume del solvente in base al passaggio 1.2.</li>
	<li>Sciogliere i reagenti in 300 μL del solvente per ottenere una soluzione stock di 1 g/L. Sciogliere 3NT in acido formico 1% (v/v) (FA) in acqua; Kyn, 3HAA e XA in solfossido di dimetile (DMSO); 3HChin in acqua acidificata a pH 2,5 con acido cloridrico (HCl). ATTENZIONE: 3HAA irrita occhi, naso, gola e polmoni. È dannoso se inalato, a contatto con la pelle e se ingerito. Indossare una protezione appropriata, ad esempio guanti e maschera.</li>
	<li>Chiudere saldamente il flaconcino e posizionarlo in un bagno ad ultrasuoni per 1 minuto per accelerare la dissoluzione. NOTA: Conservare le soluzioni stock a -20 °C e ridurre al minimo il congelamento/scongelamento (3 cicli al massimo) a causa dell'instabilità delle soluzioni stock.</li>
</ol>2. Preparazione del mezzo di coltura trattato a carbone
<ol><li>In un tubo pesare 280 mg di carbone attivo e aggiungere 5 ml del mezzo liquido preparato per coltivare le cellule di interesse.</li>
	<li>Agitare il tubo con il supporto e il carbone su un rocker a sega trasparente per 2 ore, a temperatura ambiente (impostare la velocità su 50 oscillazioni / min). Quindi, centrifugare i tubi a 6000 x g per 15 minuti.</li>
	<li>Rimuovere il tubo dalla centrifuga e raccogliere con cura il supernatante senza disturbare il sedimento. Ripetere la centrifugazione, se necessario, per rimuovere tutti i residui di carbone.</li>
	<li>Filtrare il supernatante utilizzando un filtro siringa da 0,45 μm.</li>
	<li>Assicurarsi che il mezzo di coltura pretrattato a carbone sia privato delle tracce di cinurenine eseguendo un campione pilota su LC-MS come descritto al passaggio 6.3.2. In caso contrario, ripetere i passaggi 2.1-2.4. NOTA: Se il mezzo di coltura completo inizialmente non contiene cinurenine, la fase di purificazione con carbone potrebbe essere omessa. In questo caso, preparare standard di calibrazione e campioni di controllo qualità utilizzando il mezzo completo solitamente preparato per la coltivazione cellulare.</li>
	<li>Conservare il mezzo preparato a 4 °C fino all'analisi.</li>
</ol>3. Realizzare le soluzioni di calibrazione e le curve di calibrazione
<ol><li>A picco il mezzo di coltura pretrattato a carbone con 0,75 μL di soluzione 0,1 g/L 3NT e aggiungere quattro standard (3HKyn, 3HAA, Kyn, XA) almeno a sei diverse concentrazioni per coprire gli intervalli di calibrazione. Mantenere il volume finale di ciascun campione a 150 μL. Utilizzare tubi di centrifuga da 1,5 ml per la preparazione del campione. NOTA: Punti di calibrazione suggeriti per 3HKyn: 0,018, 0,045, 0,22, 1,12, 2,23, 4,46 μmol/L; per Kyn: 0,0096, 0,048, 0,24, 1,20, 2,40, 3,84 μmol/L; per 3HAA: 0,033, 0,16, 0,65, 3,27, 6,53, 13,06 μmol/L; per XA: 0,019, 0,13, 0,49, 1,22, 3,65, 4,87 μmol/L.</li>
	<li>Aggiungere 150 μL di metanolo freddo (mantenuto a -20 °C) contenente l'1% (v/v) di acido formico in ciascun tubo per la deproteinizzazione del campione. Chiudere saldamente bene i tubi e il vortice.</li>
	<li>Incubare i campioni a -20 °C per 40 min.</li>
	<li>Centrifugare i campioni a 14.000 x g per 15 min a 4 °C. Rimuovere i tubi dalla centrifuga. Raccogli i supernatanti nei nuovi tubi. Non disturbare il sedimento.</li>
	<li>Trasferire 270 μL del supernatante nel flaconcino di vetro utilizzando una pipetta automatica. Mettere le fiale nell'evaporatore ed evaporare delicatamente fino a quando non si asciuga. Utilizzare il programma appropriato per le frazioni acqua/metanolo per evaporare i componenti volatili. Non applicare temperature superiori a 40 °C ed evitare un'asciugatura troppo. NOTA: Le fiale di vetro a fondo piano, cioè le fiale cromatografiche facilitano un'evaporazione più rapida e recuperi più elevati rispetto ai tubi conici in plastica.</li>
	<li>Dopo 30 minuti, controllare lo stato di evaporazione. Se necessario, continuare l'evaporazione (ad esempio, aggiungere altri 10 minuti). Evitare un'asciugatura troppo.</li>
	<li>Rimuovere le fiale dall'evaporatore. Ricostituire ciascun campione in 60 μL dello 0,1% (v/v) di acido formico in acqua. Aggiungere il solvente nel flaconcino contenente il materiale residuo. Chiudere saldamente le fiale e il pozzo del vortice.</li>
	<li>Trasferire il campione in un tubo da 1,5 ml e girare a 14.000 x g per 15 minuti a 4 °C per separare la proteina precipitata.</li>
	<li>Senza disturbare il pellet proteico, trasferire i supernatinanti in flaconcini cromatografici con inserti in vetro conico con pipetta automatica. Chiudere saldamente le fiale.</li>
	<li>Verificare la presenza di bolle d'aria nel flaconcino inserto e rimuoverle se necessario (ad esempio, mediante vortice).</li>
	<li>Trasferire i flaconcini cromatografici contenenti campioni nell'autocampionatore LC. Registrare la posizione dei campioni inseriti in un vassoio di campionamento automatico.</li>
</ol>4. Preparazione di campioni di controllo qualità (QC)
<ol><li>A picco il mezzo di coltura pretrattato a carbone (preparato in un tubo centrifugo da 1,5 ml) con 0,75 μL di soluzione 0,1 g/L 3NT e standard di quattro cinurenine (3HKyn, 3HAA, Kyn, XA) ad una concentrazione selezionata dall'intervallo lineare delle curve di taratura. Mantenere il volume finale del campione a 150 μL. NOTA: Se applicabile, preparare più campioni di QC a diverse concentrazioni che rientrano nell'intervallo lineare della curva di calibrazione.</li>
	<li>Seguire il protocollo descritto nella sezione 3 (passaggi 3.2-3.11).</li>
</ol>5. Configurazione del sistema LC-MS
<ol><li>Preparare i solventi di fase mobile: Solvente A: formato ammonio da 20 mmol/L in acqua ultrapura (pH 4.3 regolato con acido formico); Solvente B: acetonitrile al 100%. NOTA: Utilizzare solo bottiglie di vetro borosilicato. Risciacquare le bottiglie con acqua ultrapura prima di riempirle. Non utilizzare bottiglie pulite con detergenti. ATTENZIONE: Acetonitrile provoca gravi effetti sulla salute o morte. È facilmente infiammabile dal calore. Acetonitrile liquido e vapore possono irritare occhi, naso, gola e polmoni.<ol>
<li>Preparare 5 mol/L di soluzione stock di formato ammonio sciogliendo un reagente cristallino (15,77 g) in 50 ml di acqua ultrapura in una bottiglia di vetro. Mescolare fino a quando tutti i residui si dissolvono. Filtrare attraverso la membrana di 0,45 μm per rimuovere eventuali detriti residui (ad esempio, utilizzando un filtro per siringhe di nylon). Conservare la soluzione stock a 4 °C.</li>
		<li>Preparare il solvente A aggiungendo 4 ml di formato ammonio 5 mol/L in acqua a 980 ml di acqua ultrapura in una bottiglia di vetro ambrato e mescolare bene. Immergere una barra di agitazione e mettere la bottiglia con il solvente su un agitatore magnetico. Immergere un elettrodo di pH nella soluzione e controllare il pH sotto agitazione. Aggiungere la soluzione di stock di acido formico (98%-100%) dropwise utilizzando una pipetta automatica con punta da 0,2 mL per ottenere pH 4.3, regolare il volume fino a 1 L con acqua ultrapura e mescolare bene. NOTA: Preparare i solventi almeno una volta alla settimana per prevenire qualsiasi crescita microbica. ATTENZIONE: L'acido formico (FA) è tossico se inalato, provoca ustioni cutanee e danni agli occhi. Lavorare sotto la cappa dei fumi; indossare guanti protettivi e cappotto.</li>
		<li>Filtrare tutte le soluzioni attraverso la membrana da 0,22 μm (ad esempio, filtro siringa di nylon) per rimuovere eventuali detriti residui. Facoltativamente, utilizzare i filtri di ingresso del solvente dedicati ai serbatoi di solvente LC per proteggere il sistema dalle particelle in arrivo.</li>
	</ol></li>
	<li>Avviare il software di controllo e acquisizione dati LC-MS.</li>
	<li>Eliminare il sistema LC con la fase mobile per rimuovere le bolle e innescare tutti i canali del solvente.</li>
	<li>Ensemble una colonna di guardia per proteggere la colonna analitica dall'intasamento.</li>
	<li>Lavare la protezione e la colonna analitica (C18, 2,1 x 100 mm, 1,8 μm) con acetonitrile al 100% per circa 30 minuti, e quindi con solvente al 100% A fino a quando non si osserva una pressione stabile nella colonna. Controllare le prestazioni del sistema utilizzando il software di controllo.</li>
	<li>Impostare i parametri LC appropriati nel software di acquisizione dati.<ol>
<li>Impostare il programma di gradiente: 0-8 min solvente B 0%; 8-17 min solvente B 0-2%; 17-20 min solvente B 2%; 20-32 min solvente B 10-30%; 32-45 min solvente B 0%.</li>
		<li>Impostare la portata di fase mobile a 0,15 mL/min, il tempo di esecuzione totale dell'analisi per 45 minuti, la temperatura della colonna a +40 °C e il volume di iniezione a 10 μL.</li>
	</ol></li>
	<li>Impostate i parametri di acquisizione del rivelatore di spettrometria di massa.<ol>
<li>Applicare parametri di ionizzazione: monitoraggio ionica singola (SIM), ionizzazione positiva, pressione nebulizzatore di 50 psi, +350 °C temperatura del gas di essiccazione, flusso di gas di essiccazione di 12 L /min e tensione capillare di 5500 V.</li>
		<li>Selezionare gli ioni di monitoraggio degli aliti: per 3HKyn m/z 225.0 (periodo di scansione: 2-6 min, fragmentor voltage: 100 V); per Kyn m/z 209.0 (periodo di scansione: 6-12 min, tensione frammentaria: 80 V); per 3HAA m/z 154,0 (periodo di scansione: 12-18 min, tensione frammentaria: 80 V); per 3NT m/z 227,0 (periodo di scansione: 18-23 min, tensione frammentaria: 100 V); per XA m/z 206.0 (periodo di scansione: 23-45 min, tensione frammentaria: 100 V).</li>
	</ol></li>
	<li>Costruire un worklist ed eseguire esempi nel sistema LC.</li>
	<li>In un primo momento, prima dell'analisi dei campioni sperimentali, eseguire un campione vuoto (solvente A) almeno in triplicati, seguito da un campione di QC.</li>
	<li>Aprire il software di analisi dei dati e caricare i risultati ottenuti per il campione qc.</li>
	<li>Controllare la posizione dei picchi di aliti sul cromatogramma. Quando i segnali si spostano oltre la posizione prevista, regolare i cancelli del tempo per un'adeguata raccolta di segnali di aliti. Consultare il manuale del software per istruzioni sull'integrazione del segnale.</li>
</ol>6. Costruire la curva di calibrazione
<ol><li>Nel software di acquisizione dati aggiungere standard di calibrazione nell'elenco di lavoro ed eseguire gli standard nei triplicati.</li>
	<li>Integrare e misurare l'area di picco corrispondente a 3HKyn, Kyn, 3HAA, 3NT e XA al tempo di ritenzione di circa 4,4 min, 10 min, 16 min, 21 min e 30 min, rispettivamente.</li>
	<li>Costruisci curve di calibrazione individuali per ogni metabolita utilizzando un programma di fogli di calcolo.<ol>
<li>Per creare il grafico di calibrazione, tracciare il valore per un rapporto tra l'area di picco dell'aalita sull'area di picco 3NT e la concentrazione dell'a analitico.</li>
		<li>Analizzare il campione vuoto (mezzo di coltura pretrattato a carbone puntato solo con 3NT) per assicurarsi che non vi sia traccia degli aliti studiati nel mezzo. In caso contrario, sottrarre il valore ottenuto da ogni punto di calibrazione.</li>
		<li>Controllare la linearità di ogni curva di calibrazione.<ol>
<li>Individualmente, per ogni a analitico, creare un'equazione lineare di intercetta di pendenza (y = ax +b), dove y corrisponde al rapporto tra l'area di picco dell'a analitico e l'area di picco 3NT, a è la pendenza, x è la concentrazione di a analitici (μmol/L), e b si riferisce all'intercetta della curva. Tracciando il grafico 'y' contro 'x' verrà generato la curva di calibrazione.</li>
			<li>Aggiungere una linea di tendenza lineare al grafico, visualizzare l'equazione della curva di calibrazione e il coefficiente di regressione nel grafico. Assicurarsi che il coefficiente di regressione sia > 0,990. In caso di standard di calibrazione non corrispondenti, prepararli e/o analizzarli ancora una volta. Facoltativamente, modificare l'intervallo di concentrazione della curva di calibrazione.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Analizzare i campioni qc per verificare le prestazioni del sistema prima di analizzare i campioni sperimentali. In caso di incompatibilità (± 20% dal valore di riferimento), preparare le nuove curve di calibrazione.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. Coltura cellulare in vitro e raccolta di campioni per l'analisi
<ol><li>Placcare le cellule tumorali studiate (MDA-MB-231 o SK-OV-3) in DMEM (Medium dell'Aquila Modificata di Dulbecco) contenenti 4,5 g/L di ᴅ-glucosio, 10% (v/v) siero bovino fetale (FBS), 2 mmol/L ʟ-glutammina e 1 U penicillina/streptomicina e coltura a 37 °C in un'atmosfera umidificata del 5% di CO2 per espanderli per l'esperimento. Passare le cellule all'80% della confluenza.</li>
	<li>Staccare le cellule dal piatto di coltura usando tripina, seme per l'esperimento su piastre a 12 po 'ad una densità di 0,3 × 106 cellule per pozzo e posto in un'incubatrice durante la notte.</li>
	<li>Il giorno dopo, aspirare il mezzo di coltura e aggiungere DMEM fresco con o senza l'aggiunta dei composti studiati, a seconda del design sperimentale.</li>
	<li>Dopo 48 ore, raccogliere il mezzo dall'alto delle cellule (circa 500 μL) in un tubo da 1,5 ml. Centrifuga a 14.000 x g per 5 minuti per rimuovere eventuali detriti cellulari. Raccogliere il supernatante e conservare a -80 °C fino all'analisi.</li>
	<li>Salvare il pellet cellulare dal passaggio 7.4 per la stima delle proteine. Congelare i campioni a -20 °C. NOTA: I risultati ottenuti per un mezzo da pozzi diversi devono essere normalizzati al contenuto proteico totale per tenere conto della variabilità del numero di cellule nei singoli pozzi. La concentrazione proteica può essere valutata come descritto nella fase 9.</li>
</ol>8. Preparare campioni per l'analisi LC-MS
<ol><li>Scongelare il campione congelato a temperatura ambiente e mescolare bene. Trasferire 149,25 μL del mezzo di coltura in un tubo di centrifugazione (1,5 ml).</li>
	<li>Aggiungere 0,75 μL di 0,1 g/L di soluzione 3NT (standard interno). Chiudere bene i tubi e il vortice.</li>
	<li>Aggiungere 150 μL di metanolo refrigerato a -20 °C contenente 1% (v/v) FA per la deproteinizzazione del campione. Chiudere bene i tubi e il vortice.</li>
	<li>Continuare con la preparazione del campione come descritto nella sezione 3 (passaggi 3.3-3.11). NOTA: Alcune cellule tumorali come SK-OV-3 secernono grandi quantità di Kyn in un mezzo di coltura. Per inserire i dati in un intervallo lineare della curva di calibrazione, è necessaria una diluizione di circa 100 volte del campione. In questo caso, diluire una porzione del campione con 0,1% (v/v) FA in acqua e analizzare oltre al campione non diluito. I campioni di riferimento delle norme per la curva di taratura devono essere preparati in un terreno di coltura completo diluito 100 volte. In alternativa, aggiungere più punti nella curva di calibrazione (se si ottengono una corretta solubilità e linearità) per adattarlo al livello di concentrazione di Kyn nel campione sperimentale.</li>
	<li>Analizzare i campioni per LC-MS come descritto nella sezione 5. Costruire un elenco di lavoro ed eseguire ogni esempio in triplice copia.</li>
	<li>Una volta completato l'elenco di lavoro, misurare l'area di picco dell'alita.</li>
	<li>Generare un foglio di calcolo utilizzando il software disponibile e ottenere dati numerici.</li>
	<li>In una colonna del foglio di calcolo calcolare il rapporto dell'area di picco dell'alyte sull'area di picco 3NT.</li>
	<li>Utilizzare una singola equazione di calibrazione lineare dedicata per ogni alita (dal passaggio 6.3.) per calcolare le concentrazioni di aliti presenti nei campioni sperimentali.</li>
</ol>9. Valutazione del contenuto proteico e normalizzazione dei dati
<ol><li>Resopendare il pellet cellulare dal passaggio 7.5 con 100 μL di salina tamponata da fosfati (PBS) in tubo da 1,5 ml. NOTA: Preparare la soluzione di PBS sciogliendo 8 g di cloruro di sodio, 0,2 g di cloruro di potassio, 1,44 g di dibasico di fosfato di sodio, fosfato di diidrogeno di potassio in 950 mL di acqua ultrapura. Mescolare bene. Regolare il pH a 7,4 con acido cloridrico (dropwise). Regolare il volume fino a 1 L con acqua ultrapura. Mescolare bene fino a omogeneo. ATTENZIONE: L'acido cloridrico è altamente corrosivo e deve essere maneggiato con adeguate precauzioni di sicurezza. Il contatto con la pelle umana può causare arrossamento, dolore, ustioni cutanee. Lavorare sotto la cappa dei fumi; indossare guanti protettivi e cappotto.</li>
	<li>Congelare i campioni a -20 °C e poi scongelarsi sul ghiaccio. Ripetere questo passaggio 3x.</li>
	<li>Centrifugare i campioni a 14.000 x g per 15 min a 4 °C. Raccogli i supernatanti nei nuovi tubi. Non disturbare il pellet.</li>
	<li>Diluire i supernatanti 10x con PBS.</li>
	<li>Costruire una curva di calibrazione da 0 a 2 μg della proteina per intervallo di pozzi.<ol>
<li>Preparare la soluzione standard di albumina di siero bovino (BSA) per la calibrazione. Sciogliere 1,23 μg di BSA in 1 mL di acqua ultrapura e pozzo vortice.</li>
		<li>Su una piastra da 96 pozza, caricare diverse quantità di soluzione standard BSA (1,23 μg/mL): 0 μL, 2 μL, 4 μL, 5 μL, 7 μL, 10 μL, 15 μL, 20 μL.</li>
		<li>Riempire il pozzo con PBS al volume finale di 50 μL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Caricare 10 - 15 μL di lire cellulare dal passo 9.4 sulla stessa piastra da 96 pozzi. Riempire i pozzi con PBS per raggiungere il volume finale di 50 μL. NOTA: Se necessario, regolare il volume dell'aliquota di lysate della cella in ogni pozzo per adattarlo all'intervallo lineare della curva di calibrazione. Mantenere il volume finale a 50 μL del campione per pozzo.</li>
	<li>Aggiungere 200 μL di un reagente di Bradford (diluito 5 volte con acqua ultrapura) ad ogni pozzo.</li>
	<li>Incubare il patè da 96 pozzi per almeno 5 minuti a temperatura ambiente. Inserire la piastra in un lettore di micropiastrine. Misurare l'assorbanza a λ = 595 nm.</li>
	<li>Costruire una curva di calibrazione utilizzando un programma di foglio di calcolo. Tracciare la quantità di BSA (μg) rispetto all'assorbanza. Aggiungere una linea di tendenza lineare, visualizzare l'equazione della curva di calibrazione e il coefficiente di regressione nel grafico.</li>
	<li>Usa l'equazione lineare (y = ax +b, dove y corrisponde all'assorbanza a λ = 595 nm, a è la pendenza, x è un contenuto proteico (μg), e b si riferisce all'intercetta della curva) per calcolare la quantità proteica nel campione. NOTA: si consideri un fattore di diluizione del campione nei calcoli.</li>
	<li>Utilizzare il contenuto proteico stimato per normalizzare la quantità di cinurenina nel campione per 1 mg di proteine. Per fare questo, dividere la concentrazione di cinurenine determinata nella fase 8.9 con il contenuto proteico totale dal passo 9.10.</li>
</ol>

<ol><li>Li, F., Zhang, R., Li, S., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IDO1%3A+an+import+ant+immunotherapy+target+in+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22International+Immunopharmacology%22%5BJournal%5D)">IDO1: an import ant immunotherapy target in cancer treatment.</a> International Immunopharmacology. 47, 70-77 (2017).</li>
<li>Heng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+role+of+the+kynurenine+pathway+in+human+breast+cancer+immunobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Understanding the role of the kynurenine pathway in human breast cancer immunobiology.</a> Oncotarget. 7 (6), 6506-6520 (2015).</li>
<li>Badawy, A. A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kynurenine+pathway+and+human+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Gerontology%22%5BJournal%5D)">Kynurenine pathway and human systems.</a> Experimental Gerontology. 129, (2020).</li>
<li>Chen, Y., Guillemin, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kynurenine+pathway+metabolites+in+humans%3A+Disease+and+healthy+states%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Tryptophan+Research%22%5BJournal%5D)">Kynurenine pathway metabolites in humans: Disease and healthy states.</a> International Journal of Tryptophan Research. 2 (1), 1-19 (2009).</li>
<li>Sathyasaikumar, K. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xanthurenic+Acid+Formation+from+3-Hydroxykynurenine+in+the+Mammalian+Brain%3A+Neurochemical+Characterization+and+Physiological+Effects%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Xanthurenic Acid Formation from 3-Hydroxykynurenine in the Mammalian Brain: Neurochemical Characterization and Physiological Effects.</a> Neuroscience. 367, 85-97 (2017).</li>
<li>Malina, H., Richter, C., Frueh, B., Hess, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lens+epithelial+cell+apoptosis+and+intracellular+Ca2%2B+increasein+the+presence+of+xanthurenic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Lens epithelial cell apoptosis and intracellular Ca2+ increasein the presence of xanthurenic acid.</a> BMC Ophthalmology. 2, 1-7 (2002).</li>
<li>Colín-González, A. L., Maldonado, P. D., Santamaría, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-Hydroxykynurenine%3A+an+intriguing+molecule+exerting+dual+actions+in+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicology%22%5BJournal%5D)">3-Hydroxykynurenine: an intriguing molecule exerting dual actions in the central nervous system.</a> Neurotoxicology. 34, 189-204 (2013).</li>
<li>Xue, P., Fu, J., Zhou, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+aryl+hydrocarbon+receptor+and+tumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">The aryl hydrocarbon receptor and tumor immunity.</a> Frontiers in Immunology. 9 (286), 00286(2018).</li>
<li>Tan, V. X., Guillemin, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kynurenine+pathway+metabolites+as+biomarkers+for+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Kynurenine pathway metabolites as biomarkers for amyotrophic lateral sclerosis.</a> Frontiers in Microbiology. 13 (1013), 1-11 (2019).</li>
<li>Wilding, J. L., Bodmer, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+cell+lines+for+drug+discovery+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Cancer cell lines for drug discovery and development.</a> Cancer Research. 14 (40), 2377-2384 (2015).</li>
<li>Takikawa, O., Kuroiwa, T., Yamazaki, F., Kido, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+interferon-gamma+action.+Characterization+of+indoleamine+2%2C3-dioxygenase+in+cultured+human+cells+induced+by+interferon-gamma+and+evaluation+of+the+enzyme-mediated+tryptophan+degradation+in+its+anticellular+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mechanism of interferon-gamma action. Characterization of indoleamine 2,3-dioxygenase in cultured human cells induced by interferon-gamma and evaluation of the enzyme-mediated tryptophan degradation in its anticellular activity.</a> Journal of Biological Chemistry. 263 (4), 2041-2048 (1988).</li>
<li>Park, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indoleamine-2%2C3-dioxygenase+in+thyroid+cancer+cells+suppresses+natural+killer+cell+function+by+inhibiting+NKG2D+and+NKp46+expression+via+STAT+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Medicine%22%5BJournal%5D)">Indoleamine-2,3-dioxygenase in thyroid cancer cells suppresses natural killer cell function by inhibiting NKG2D and NKp46 expression via STAT signaling pathways.</a> Journal of Clinical Medicine. 8 (6), 842-859 (2019).</li>
<li>Sadok, I., Gamian, A., Staniszewska, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatographic+analysis+of+tryptophan+metabolites%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Separation+Science%22%5BJournal%5D)">Chromatographic analysis of tryptophan metabolites.</a> Journal of Separation Science. 40 (15), 3020-3045 (2017).</li>
<li>Fuertig, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LC-MS%2FMS-based+quantification+of+kynurenine+metabolites%2C+tryptophan%2C+monoamines+and+neopterin+in+plasma%2C+cerebrospinal+fluid+and+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Bioanalysis%22%5BJournal%5D)">LC-MS/MS-based quantification of kynurenine metabolites, tryptophan, monoamines and neopterin in plasma, cerebrospinal fluid and brain.</a> Bioanalysis. 8 (18), 1903-1917 (2016).</li>
<li>Marcos, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+tryptophan+and+tyrosine+metabolism+by+liquid+chromatography+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+A%22%5BJournal%5D)">Targeting tryptophan and tyrosine metabolism by liquid chromatography tandem mass spectrometry.</a> Journal of Chromatography A. 1434, 91-101 (2016).</li>
<li>Möller, M., Du Preez, J., Harvey, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+validation+of+a+single+analytical+method+for+the+determination+of+tryptophan%2C+and+its+kynurenine+metabolites+in+rat+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+B%3A+Analytical+Technologies+in+Biomedical+Life+Science%22%5BJournal%5D)">Development and validation of a single analytical method for the determination of tryptophan, and its kynurenine metabolites in rat plasma.</a> Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in Biomedical Life Science. 898, 121-129 (2012).</li>
<li>Lesniak, W. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concurrent+quantification+of+tryptophan+and+its+major+metabolites%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Concurrent quantification of tryptophan and its major metabolites.</a> Analytical Biochemistry. 443 (2), 222-231 (2013).</li>
<li>Badawy, A. A. B., Morgan, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+isocratic+liquid+chromatographic+separation+and+quantification+of+tryptophan+and+six+kynurenine+metabolites+in+biological+samples+with+ultraviolet+and+fluorimetric+detection%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Tryptophan+Research%22%5BJournal%5D)">Rapid isocratic liquid chromatographic separation and quantification of tryptophan and six kynurenine metabolites in biological samples with ultraviolet and fluorimetric detection.</a> International Journal of Tryptophan Research. 3, 175-186 (2010).</li>
<li>Vignau, J., Jacquemont, M. C., Lefort, A., Imbenotte, M., Lhermitte, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+determination+of+tryptophan+and+kynurenine+in+serum+by+HPLC+with+UV+and+fluorescence+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Chromatography%22%5BJournal%5D)">Simultaneous determination of tryptophan and kynurenine in serum by HPLC with UV and fluorescence detection.</a> Biomedical Chromatography. 18 (10), 872-874 (2004).</li>
<li>Zhang, A., Rijal, K., Ng, S. K., Ravid, K., Chitalia, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mass+spectrometric+method+for+quantification+of+tryptophan-derived+uremic+solutes+in+human+serum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Methods%22%5BJournal%5D)">A mass spectrometric method for quantification of tryptophan-derived uremic solutes in human serum.</a> Journal of Biological Methods. 4 (3), 75(2017).</li>
<li>Arnhard, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+validated+liquid+chromatography-high+resolution-tandem+mass+spectrometry+method+for+the+simultaneous+quantitation+of+tryptophan%2C+kynurenine%2C+kynurenic+acid%2C+and+quinolinic+acid+in+human+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">A validated liquid chromatography-high resolution-tandem mass spectrometry method for the simultaneous quantitation of tryptophan, kynurenine, kynurenic acid, and quinolinic acid in human plasma.</a> Electrophoresis. 39 (9-10), 1171-1180 (2018).</li>
<li>Oh, J. S., Seo, H. S., Kim, K. H., Pyo, H., Chung, B. C., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urinary+profiling+of+tryptophan+and+its+related+metabolites+in+patients+with+metabolic+syndrome+by+liquid+chromatography-electrospray+ionization%2Fmass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Urinary profiling of tryptophan and its related metabolites in patients with metabolic syndrome by liquid chromatography-electrospray ionization/mass spectrometry.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (23), 5501-5512 (2017).</li>
<li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+LC-MS%2FMS+method+for+determination+of+kynurenine+and+tryptophan+concentrations+in+human+plasma+from+HIV-infected+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Bioanalysis%22%5BJournal%5D)">A simple LC-MS/MS method for determination of kynurenine and tryptophan concentrations in human plasma from HIV-infected patients.</a> Bioanalysis. 5 (11), 1397-1407 (2013).</li>
<li>Yamada, K., Miyazzaki, T., Shibata, T., Hara, N., Tsuchiya, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+measurement+of+tryptophan+and+related+compounds+by+liquid+chromatography%2Felectrospray+ionization+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+B%3A+Analytical+Technologies+in+Biomedical+and+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Simultaneous measurement of tryptophan and related compounds by liquid chromatography/electrospray ionization tandem mass spectrometry.</a> Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in Biomedical and Life Sciences. 867 (1), 57-61 (2008).</li>
<li>Zhu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+profiling+of+tryptophan+metabolites+in+serum%2C+urine%2C+and+cell+culture+supernatants+by+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Quantitative profiling of tryptophan metabolites in serum, urine, and cell culture supernatants by liquid chromatography-tandem mass spectrometry.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 401, 3249-3261 (2011).</li>
<li>Hashioka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomics+analysis+implies+noninvolvement+of+the+kynurenine+pathway+neurotoxins+in+the+interferon-gamma-+induced+neurotoxicity+of+adult+human+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychiatry%22%5BJournal%5D)">Metabolomics analysis implies noninvolvement of the kynurenine pathway neurotoxins in the interferon-gamma- induced neurotoxicity of adult human astrocytes.</a> Neuropsychiatry. 7 (2), (2017).</li>
<li>Sadok, I., Rachwał, K., Staniszewska, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+the+optimized+and+validated+LC-MS+method+for+simultaneous+quantification+of+tryptophan+metabolites+in+culture+medium+from+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+and+Biomedical+Analysis%22%5BJournal%5D)">Application of the optimized and validated LC-MS method for simultaneous quantification of tryptophan metabolites in culture medium from cancer cells.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 176, 112805-112815 (2019).</li>
<li>Annesley, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+suppression+in+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Ion suppression in mass spectrometry.</a> Clinical Chemistry. 49 (7), 1041-1044 (2003).</li>
<li>Houée-Lévin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+oxidative+modifications+of+tyrosine%3A+An+update+on+mechanisms+of+formation%2C+advances+in+analysis+and+biological+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Research%22%5BJournal%5D)">Exploring oxidative modifications of tyrosine: An update on mechanisms of formation, advances in analysis and biological consequences.</a> Free Radical Research. 49 (4), 347-373 (2015).</li>
<li>Wei, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+Expression+of+Indoleamine+2%2C+3-Dioxygenase+in+Human+Recurrent+Miscarriage%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+Sciences%22%5BJournal%5D)">Abnormal Expression of Indoleamine 2, 3-Dioxygenase in Human Recurrent Miscarriage.</a> Reproductive Sciences. , e1933719119833788 (2019).</li>
<li>Liu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+indoleamine+2%2C3-dioxygenase+in+nasopharyngeal+carcinoma+impairs+the+cytolytic+function+of+peripheral+blood+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Expression of indoleamine 2,3-dioxygenase in nasopharyngeal carcinoma impairs the cytolytic function of peripheral blood lymphocytes.</a> BMC Cancer. 9, 416(2009).</li>
<li>Mailankot, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indoleamine+2%2C3-dioxygenase+overexpression+causes+kynurenine-modification+of+proteins%2C+fiber+cell+apoptosis+and+cataract+formation+in+the+mouse+lens%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%3A+A+Journal+of+Technical+Methods+and+Pathology%22%5BJournal%5D)">Indoleamine 2,3-dioxygenase overexpression causes kynurenine-modification of proteins, fiber cell apoptosis and cataract formation in the mouse lens.</a> Laboratory Investigation: A Journal of Technical Methods and Pathology. 89 (5), 498-512 (2009).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo documento presenta un protocollo dettagliato LC-SQ per la quantificazione simultanea di quattro principali metaboliti Trp (3HKyn, Kyn, 3HAA, XA) che vengono misurati in un mezzo da cellule tumorali umane coltivate in vitro. Particolare attenzione è rivolta alla preparazione del campione, alla procedura cromatografica/spettrometrica di massa e all'interpretazione dei dati, i punti più importanti all'interno dell'analisi.
In generale, l'analisi LC-MS, a causa dell'elevata sensibi...

La via della kynurenina (KP) è la principale via del catabolismo triptofano (Trp) nelle cellule umane. L'indoloammina-2,3-diossigenasi (IDO-1) nelle cellule extraepatiche è il primo e limitante enzima di KP e converte il Trp in N-formilchinurenina1. Ulteriori passaggi all'interno di KP generano altri metaboliti secondari, vale a dire le cinurenine che mostrano varie proprietà biologiche. La cinurenina (Kyn) è il primo catabolita Trp stabile che mostra proprietà tossiche e regola gli eventi cellulari dopo il legame con il recettore degli idrocarburi arilici (AhR)2. Successivamente, Kyn viene trasformato in diverse molecole spontaneamente o nei processi mediati dall'enzima, generando tali metaboliti come 3-idrossichinurenina (3HKyn), acido antranilico (AA), acido 3-idrossiantranilico (3-HAA), acido cinurenico (Kyna) e acido xanturenico (XA). Un altro metabolita a valle, 2-ammino-3-acido carbossimuconico-6-semialdeide (ACMS), subisce ciclizzazione non enzimatica in acido čolinico (QA) o acido picolinico (PA)1. Infine, il QA viene ulteriormente trasformato in nicotinammide-adenina dinucleotide (NAD+)3, il metabolita del punto finale KP che è un importante cofattore enzimatico. Alcune kynurenine hanno proprietà neuroprotettive come Kyna e PA, mentre le altre, cioè 3HAA e 3HKyn, sono tossiche4. L'acido xantinonico, che si forma da 3HKyn, presenta proprietà antiossidanti e vasorelaxation5. XA si accumula nelle lenti che invecchiano e porta all'apoptosi delle cellule epiteliali6. KP, descritto a metà del XX secolo, haguadagnato maggiore attenzione quando è stato dimostrato il suo coinvolgimento in vari disturbi. L'aumento dell'attività di questa via metabolica e l'accumulo di alcune cinurenine modulano la risposta immunitaria e sono associate a diverse condizioni patologiche come depressione, schizofrenia, encefalopatia, HIV, demenza, sclerosi laterale amiotrofica, malaria, Alzheimer, malattia di Huntington e cancro4,7. Alcuni cambiamenti nel metabolismo Trp si osservano nei microambientati tumorali e nellecellule tumorali 2,8. Inoltre, le cinurenine sono considerate marcatori di malattia promettenti9. Nella ricerca sul cancro, i modelli di coltura cellulare in vitro sono ben consolidati e ampiamente utilizzati per la valutazione preclinica delle risposte ai farmaci anticancro10. I metaboliti Trp sono secreti dalle cellule nel mezzo di coltura e possono essere misurati per valutare lo stato della via della cinurenina. Pertanto, è necessario sviluppare metodi appropriati per il rilevamento simultaneo del maggior numero possibile di metaboliti KP in una varietà di campioni biologici con un protocollo facile, flessibile e affidabile.
In questo articolo, descriviamo un protocollo per la determinazione simultanea di quattro metaboliti della via della cinurenina: Kyn, 3HKyn, 3HAA e XA da LC-SQ in un mezzo post-coltura raccolto dalle cellule tumorali. In un moderno approccio analitico, la cromatografialiquida 13,14,15,16 è preferita per il rilevamento simultaneo e la quantificazione dei singoli cataboliti di triptofano, a differenza dei saggi biochimici non specifici che utilizzano il reagente di Ehrlich11,12. Attualmente, ci sono molti metodi disponibili per la determinazione delle cinurenine in campioni umani, principalmente basati sulla cromatografia liquida con rivelatori ultravioletti o a fluorescenza13,17,18,19. La cromatografia liquida accoppiata con un rivelatore di spettrometria di massa (LC-MS) sembra più adatta per questo tipo di analisi, a causa della loro maggiore sensibilità (limiti inferiori di rilevamento), selettività e ripetibilità.
I metaboliti Trp sono già stati determinati nel siero umano, plasma e urina13,20,21,22,23, tuttavia, sono desiderati anche i metodi per altri campioni biologici, come il mezzo di coltura cellulare. In precedenza, l'LC-MS era usato per composti derivati dal Trp in un mezzo raccolto dopo la coltura di cellule di glioma umano, monociti, cellule dendritiche o astrociti trattati con gamma di interferone (IFN-γ)24,25,26. Attualmente, sono necessari nuovi protocolli convalidati che possono consentire una valutazione di diversi metaboliti in diversi mezzi di coltura, cellule e trattamenti utilizzati nei modelli di cancro.
Lo scopo del metodo sviluppato è quello di quantificare (all'interno di una serie analitica) quattro principali cinurenine che possono indicare anomalie in KP. Ecco le fasi critiche del nostro protocollo recentemente pubblicato per l'analisi quantitativa LC-SQ di alcune cinurenine significative selezionate utilizzando uno standard interno (3-nitrotirosina, 3NT) nel mezzo raccolto da cellule tumorali umane coltivate in vitro 27. Per quanto ne siamo a conoscenza, è il primo protocollo LC-SQ per la quantificazione simultanea di 3HKyn, 3HAA, Kyn e XA in un mezzo di coltura ottenuto dalle cellule coltivate in vitro. Dopo alcune modifiche, il metodo potrebbe essere ulteriormente applicato per studiare i cambiamenti nel metabolismo Trp in una gamma più ampia di modelli di coltura cellulare.

<table><tbody><tr><td>3-idrossi-DL-kynurenina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1771</td><td></td></tr><tr><td>acido 3-idrossiantranrilico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>148776</td><td>97%</td></tr><tr><td>3-nitro-L-tirosina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N7389</td><td></td></tr><tr><td>acetonitrile</td><td>Supelco</td><td>1.00029</td><td>ipergrado per LC-MS LiChrosolv</td></tr><tr><td>Carbone attivo</td><td>Supelco</td><td>05105</td><td>polvere</td></tr><tr><td>Bilancia analitica</td><td>Ohaus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Colonna analitica</td><td>Agilent Technologies</td><td>959764-902</td><td>Zorbax Eclipse Plus C18 a risoluzione rapida HT (2,1 x 100 mm, 1,8 &; m)</td></tr><tr><td>Formiato di ammonio</td><td>Supelco</td><td>7022</td><td>additivo eluente per LC-MS, LiChropur, &ge; 99,0%</td></tr> <tr><td>Siero bovino Albumina</td><td>Sigma</td><td>1001887398</td><td></td></tr><tr><td>Tappi per fiale cromatografiche</td><td>Agilent Technologies</td><td>5185-5820</td><td>tappi a vite blu, PTFE/sil sepa rosso</td></tr><tr><td>Piatto per colture cellulari</td><td>Nido</td><td>704004</td><td>polistirene, non pirogeno, sterile</td></tr><tr><td>Piastra per colture cellulari</td><td>Biologix</td><td>07-6012</td><td>12 pozzetti, non pirogeno, non citotossico, sterille</td></tr><tr><td>Incubatore cellulare</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>HERAcell 150i Cu</td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>modello 5415R</td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>modello 5428</td></tr><tr><td>Provette da centrifuga</td><td>Bionovo</td><td>B-2278</td><td>Tipo Eppendorf, 1,5 mL</td></tr><tr><td>Provette da centrifuga</td><td>Bionovo</td><td>B-3693</td><td>Tipo Falcon, 50 mL, PP</td></tr><tr><td>Dati cromatografici software di acquisizione e analisi</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td>LC/MSD ChemStation (B.04.03-S92)</td></tr><tr><td>Fiale con inserto cromatografico</td><td>Agilent Technologies</td><td>9301-1387</td><td>100 &; </td></tr><tr><td>L Fiale cromatografiche</td><td>Agilent Technologies</td><td>5182-0714</td><td>2 mL, vetro trasparente</td></tr><tr><td>Dimetil solfossido</td><td>Supelco</td><td>1.02950</td><td>Uvasol</td></tr><tr><td>Dubelcco' s Aquila modificata' s Medium (DMEM)</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-41450</td><td></td></tr><tr><td>Doppio misuratore di pH/conducibilità</td><td>Mettler Toledo</td><td></td><td>SevenMulti</td></tr><tr><td>Evaporator</td><td>Genevac</td><td></td><td>modello EZ-2.3 Elite</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9665</td><td></td></tr><tr><td>Acido formico</td><td>Supelco</td><td>5.33002</td><td>per LC-MS LiChropur</td></tr><tr><td>Flacone di vetro per la conservazione dei</td> <td>reagentiBionovo</td><td>S-2070</td><td>50 mL, vetro trasparente</td></tr><tr><td>Colonna di protezione</td><td>Agilent Technologies</td><td>959757-902</td><td>Zorbax Eclipse Plus-C18 Colonna di protezione a foro stretto (2,1 x 12,5 mm, 5 &; m)</td></tr><tr><td>Acido cloridrico</td><td>Merck</td><td>1.00317.1000</td><td></td></tr><tr><td>L-chinurenina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K8625</td><td>&ge; 98% (HPLC)</td></tr><tr><td>Agitatore magnetico</td><td>Wigo</td><td></td><td>ES 21 H</td></tr><tr><td>Microbilancia</td><td>Mettler Toledo</td><td></td><td>modello XP6</td></tr><tr><td>Sistema Milli-Q</td><td>Millipore</td><td>ZRQSVPO30</td><td>Direct-Q 3 UV con pompa</td></tr><tr><td>Spettrometro di massa a quadrupolo</td><td>Agilent Technologies</td><td>G1948B</td><td>modello 6120</td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td>Sigma-Adrich</td><td>048M4874V</td><td></td></tr><tr><td>Lettore di piastre</td><td>Bio Tek</td><td></td><td>Synergy 2 gestito da Gen5</td></tr><tr><td>Cloruro di potassio</td><td>Merck</td><td>1.04936.1000</td><td></td></tr><tr><td>Diidrogeno fosfato di potassio</td><td>Merck</td><td>1.05108.0500</td><td></td></tr><tr><td>Dosaggio delle proteine Concentrato di colorante</td><td>BioRad</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>Bilanciere altalenante</td><td>Stuart</td><td>SSL4</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta sierologica</td><td>Nest</td><td>326001</td><td>5 mL, polistirene, apirogeno, sterile</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di sodio bibasico</td><td>Merck</td><td>1.06346.1000</td><td></td></tr><tr><td>Filtro di ingresso solvente</td><td>Agilent Technologies</td><td>5041-2168</td><td>filtro in vetro, 20 &; m dimensione dei pori</td></tr><tr><td>Serbatoio del solvente (per LC-MS)</td><td>Agilent Technologies</td><td>9301-6524</td><td>1 L, vetro trasparente</td></tr><tr><td>Serbatoio del solvente (per LC-MS)</td><td>Agilent Technologies</td><td>9301-6526</td><td>1 L, vetro ambrato</td></tr><tr><td>Programma per fogli di calcolo</td><td>Microsoft Office</td><td></td><td>Microsoft Office Excel</td></tr><tr><td>Agitatore</td><td>Bionovo</td><td>6-2003</td><td>rivestito in teflon</td></tr><tr><td>Filtri per siringhe per coltura media filtrazione</td><td>Bionovo</td><td>7-8803</td><td>cellulosa rigenerata, &Oslash; 30 mm, 0,45&micro; m</td></tr><tr><td>Filtri per siringhe per la filtrazione di componenti in fase mobile</td><td>Bionovo</td><td>6-0018</td><td>nylon, &Oslash; 30 mm, 0,22 &; m</td></tr><tr><td>Piastre per coltura tissutale</td><td>VWR</td><td>10062-900</td><td>96 pozzetti, soluzione sterille</td></tr><tr><td>di tripsina-EDTA</td><td>Sigma-Aldrih</td><td>T4049-100 mL</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di cromatografia liquida ad altissime prestazioni</td><td>Agilent Technologies</td><td>G1367D, G1379B, G1312B, G1316C</td><td>Il sistema 1200 Infinity era composto da autocampionatore (G1367D), degasatore (G1379B), pompa binaria (G1312B), termostato a colonna (G1316C)</td></tr><tr><td>Bagno ad ultrasuoni</td><td>Polsonic</td><td>104533</td><td>modello 6D</td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Biosan</td><td></td><td>modello V-1 più</td></tr><tr><td>acido xanturenico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D120804</td><td>96%</td></tr></tbody></table>

quantificazione simultanea di kynurenine selezionate analizzate dalla cromatografia liquida-spettrometria di massa in mezzo raccolto da colture cellulari tumorali

Simultaneous Quantification of Selected Kynurenines Analyzed by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry in Medium Collected from Cancer Cell Cultures

La via della cinurenina e i cataboliti di triptofano chiamati kynurenine hanno ricevuto una maggiore attenzione per il loro coinvolgimento nella regolazione immunitaria e nella biologia del cancro. Un saggio di coltura cellulare in vitro viene spesso utilizzato per conoscere il contributo di diversi cataboliti di triptofano in un meccanismo di malattia e per testare strategie terapeutiche. Il mezzo di coltura cellulare ricco di metaboliti secreti e molecole di segnalazione riflette lo stato del metabolismo del triptofano e di altri eventi cellulari. Si desidera nuovi protocolli per la quantificazione affidabile di più cinurenine nel mezzo di coltura cellulare complesso per consentire un'analisi affidabile e rapida di più campioni. Questo può essere realizzato con cromatografia liquida accoppiata con spettrometria di massa. Questa potente tecnica è utilizzata in molti laboratori clinici e di ricerca per la quantificazione dei metaboliti e può essere utilizzata per misurare le cinurenine.
Qui è presentato l'uso della cromatografia liquida accoppiata con una singola spettrometria di massa quadrupolo (LC-SQ) per la determinazione simultanea di quattro cinurenine, cioè cinurenina, 3-idrossichinurenina, acido 3-idrossiantranilico e xantiurenico nel mezzo raccolto da cellule tumorali coltivate in vitro. Il rilevatore SQ è semplice da usare e meno costoso rispetto ad altri spettrometri di massa. Nell'analisi SQ-MS, più ioni del campione vengono generati e separati in base al loro specifico rapporto massa-carica (m/z), seguito dal rilevamento utilizzando una modalità SIM (Single Ion Monitoring).
Questo documento richiama l'attenzione sui vantaggi del metodo riportato e indica alcuni punti deboli. Si concentra su elementi critici dell'analisi LC-SQ, inclusa la preparazione del campione insieme alla cromatografia e all'analisi della spettrometria di massa. Vengono inoltre discussi il controllo di qualità, le condizioni di calibrazione del metodo e i problemi relativi agli effetti della matrice. Abbiamo descritto una semplice applicazione della 3-nitrotirosina come uno standard analogico per tutti gli aaliti bersaglio. Come confermato da esperimenti con ovaie umane e cellule tumorali del seno, il metodo LC-SQ proposto genera risultati affidabili e può essere ulteriormente applicato ad altri modelli cellulari in vitro.

LC-MS presenta indiscutibili vantaggi nella quantificazione di molecole biologicamente attive, anche se alcuni componenti di campioni complessi causano i cosiddetti effetti matriciali e compromettono la ionizzazione degli aaliti. Porta alla soppressione degli ioni o al miglioramento degli ioni, diminuendo fortemente l'accuratezza e influenzando un limite di rivelazione /quantificazione della LC-MS, che è considerato un punto "debole" del metodo. Nel nostro protocollo, gli ioni sono generati dalla ionizzazione elettrospra...

Qui descritto è un protocollo per la determinazione di quattro diversi metaboliti del triptofano generati nella via della cinurenina (cinurenina, 3-idrossichinurenina, acido xanturenico, acido 3-idrossiantranilico) nel mezzo raccolto dalle colture cellulari tumorali analizzate dalla cromatografia liquida accoppiata con una singola spettrometria di massa quadrupolo.

Quantificazione simultanea di kynurenine selezionate analizzate dalla cromatografia liquida-spettrometria di massa in mezzo raccolto da colture cellulari tumorali

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and ...

Le chinurenine sono associate alla regolazione della risposta immunitaria in diverse malattie, tra cui il cancro. Metodi affidabili e convalidati per l'identificazione di più chinurenine aiutano nello sviluppo di terapie più efficaci. Il nostro protocollo utilizza la cromatografia liquida accoppiata alla spettrometria di massa per identificare i diversi metaboliti del triptofano generati dalla via della chinurenina nel terreno raccolto da colture cellulari tumorali.Gli utenti inesperti possono avere qualche difficoltà durante la preparazione del campione o le fasi di acquisizione e interpretazione dei dati. Seguendo il nostro protocollo e le nostre raccomandazioni, è possibile evitare errori e ottenere dati affidabili. Per preparare le soluzioni madre dei reagenti, pesare 0,3 milligrammi di ciascun reagente in una fiala con la massima precisione e sciogliere ciascun reagente in 300 microlitri del solvente appropriato per ottenere un grammo per litro di soluzioni madre di ciascun reagente.Per preparare il terreno di coltura trattato con carbone, pesare 280 milligrammi di carbone attivo in una provetta conica e aggiungere cinque millilitri del terreno liquido preparato per la coltura delle cellule di interesse. Agitare il tubo con il substrato e il carbone su un bilanciere a bilanciere per due ore a temperatura ambiente e 50 oscillazioni al minuto. Al termine dell'incubazione, sedimentare il carbone mediante centrifugazione e raccogliere accuratamente il surnatante senza disturbare il carbone, quindi filtrare il mezzo utilizzando un filtro a siringa da 0,45 micrometri.Per preparare la soluzione di calibrazione, aggiungere al terreno di coltura trattato con carbone con 0,75 microlitri di soluzione 3NT da 0,1 grammi per litro e aggiungere chinurenina 3-H, chinurenina 3-HAA e acido xanturenico ad almeno sei diverse concentrazioni per coprire tutti gli intervalli di calibrazione fino a un volume finale di 150 microlitri per campione. Dopo il vortex, aggiungere 150 microlitri di metanolo freddo a meno 20 gradi Celsius integrato con acido formico all'1% a ciascuna provetta per la deproteinizzazione del campione e tappare ermeticamente e agitare nuovamente le provette. Dopo un'incubazione di 40 minuti a meno 20 gradi Celsius, centrifugare i campioni e utilizzare una pipetta automatica per trasferire 270 microlitri di ciascun surnatante in singole fiale di vetro a fondo piatto.Posizionare le fiale in un evaporatore e utilizzare il programma appropriato per le frazioni di metanolo d'acqua per far evaporare delicatamente i componenti volatili per circa 30 minuti. Quando le provette sono asciutte, ricostituire ogni campione in 60 microlitri di acido formico allo 0,1% in acqua e agitare i campioni prima di trasferire ogni soluzione in singole provette da 1,5 millilitri per la centrifugazione. Senza disturbare il sedimento, trasferire i surnatanti in fiale cromatografiche con inserti conici in vetro e posizionare le fiale in un autocampionatore LC-MS.Prima di eseguire i campioni, spurgare il sistema LC con la fase mobile per rimuovere le bolle e adescare tutti i canali del solvente. Successivamente, lavare la protezione e la colonna analitica con acetonitrile al 100% per circa 30 minuti prima di lavare il sistema con solvente A al 100% fino a quando non si osserva una pressione stabile nella colonna, quindi impostare i parametri LC appropriati nel software di acquisizione dati e creare una lista di lavoro per l'esecuzione dei campioni sul sistema LC. Per costruire la curva di calibrazione, nel software di acquisizione dati, aggiungere gli standard di calibrazione alla lista di lavoro ed eseguire gli standard in triplicati, quindi integrare e misurare l'area del picco corrispondente a 3-idrossichinurenina, chinurenina, acido 3-idrossiantranilico, 3-nitrotirosina e acido xanturenico al tempo di ritenzione di circa 4,4, 10, 16, 21 e 30 minuti rispettivamente.Per raccogliere campioni di surnatante da una coltura cellulare in vitro, dopo 48 ore di coltura cellulare standard delle cellule di interesse, trasferire 500 microlitri di surnatante da ciascun pozzetto in singole provette da 1,5 millilitri e rimuovere i detriti cellulari mediante centrifugazione, quindi trasferire i surnatanti medi in nuove provette per la conservazione a meno 80 gradi Celsius fino all'analisi e mantenere i pellet cellulari a meno 20 gradi Celsius fino all'analisi della stima delle proteine. Per preparare i campioni per l'analisi LC-MS, trasferire 149,25 microlitri di ciascun campione di terreno di coltura scongelato in una nuova provetta da 1,5 microlitri e aggiungere 0,75 microlitri di soluzione 3NT da 0,1 grammi per litro a ciascuna provetta. Dopo aver preparato i campioni come dimostrato, aggiungere 150 microlitri di metanolo a meno 20 gradi Celsius integrato con acido formico all'1% in ciascuna provetta e preparare il campione per l'analisi LC-MS come dimostrato.Una volta completata l'elenco di lavoro, misurare l'area del picco di ciascun analita e utilizzare un'equazione di calibrazione lineare individuale dedicata per ciascun analita per calcolare le concentrazioni degli analiti presenti all'interno di ciascun campione sperimentale. Per valutare il contenuto proteico cellulare corrispondente al campione di terreno di coltura, risospendere ogni pellet cellulare in 100 microlitri di PBS e congelare i campioni a meno 20 gradi Celsius per un'ora prima di scongelarli con ghiaccio. Dopo aver congelato e scongelato i campioni tre volte, raccogliere i lisati cellulari mediante centrifugazione e trasferire i surnatanti in nuove provette senza disturbare i pellet.Diluire il campione 10 volte con PBS fresco e aggiungere i volumi appropriati di soluzione standard di albumina sierica bovina in duplicato ai pozzetti appropriati di una piastra a 96 pozzetti. Caricare da 10 a 15 microlitri di ciascun surnatante del campione di lisato cellulare nei pozzetti appropriati della piastra a 96 pozzetti e riempire sia il pozzetto standard che il pozzetto del campione fino a un volume finale di 50 microlitri di PBS per pozzetto. Successivamente, aggiungere 200 microlitri di un reagente Bradford diluito cinque volte con acqua ultra pura a ciascun pozzetto e incubare la piastra per almeno cinque minuti a temperatura ambiente.Al termine dell'incubazione, caricare la piastra su un lettore di micropiastre e misurare l'assorbanza a 595 nanometri, quindi costruire una curva di calibrazione per consentire il calcolo della quantità di proteine in ciascun campione e dividere la concentrazione di ciascuna chinurenina per il contenuto proteico totale per normalizzare la quantità di chinurenina in ciascun campione per un microgrammo di proteine. Ecco i risultati della spettrometria di massa a quadrupolo singolo ottenuti durante l'analisi di un terreno contenente 4,5 grammi per litro di D-glucosio e il 10% di siero fetale bovino. Si noti il piccolo picco che indica la presenza di chinurenina all'interno del campione.Eseguire un campione di controllo qualità prima di richiedere i dati effettivi del campione per confermare i tempi di ritenzione appropriati degli analiti, poiché è possibile osservare uno spostamento dei segnali LC o discrepanze. I componenti della matrice a co-eluizione possono generare ioni con il rapporto di carica master selezionato per gli analiti target. Ad esempio, in questa analisi, il picco del composto sconosciuto è apparso nel periodo di scansione durante il quale è stato monitorato lo ione del rapporto di carica master 206.A causa dell'incompatibilità del tempo di ritenzione, il segnale non corrispondeva all'analita. Sebbene l'isotopo del triptofano condividesse lo stesso ione del rapporto di carica master 206, l'analisi cromatografica ha rivelato che il segnale del triptofano era ben separato dal segnale dell'acido xantorenico, indicando che il livello di triptofano presente nel terreno delle cellule tumorali testato non ha influenzato la quantificazione dell'acido xantorenico. Questa analisi del terreno di coltura di due tipi di linee cellulari tumorali dimostra che le cellule di carcinoma mammario epiteliale umano valutate hanno rilasciato quantità diverse di metaboliti del triptofano, mentre le cellule di carcinoma ovarico umano testate hanno prodotto livelli significativamente più elevati di chinurenina.L'utilizzo di uno standard interno durante la preparazione del campione aiuta con un'acquisizione affidabile dei dati. La normalizzazione dei dati al contenuto proteico corregge la variabilità del numero di cellule all'interno dei singoli pozzetti. Il nostro protocollo può essere ulteriormente ampliato per determinare ulteriori analiti, ma può accumularsi nel terreno di coltura in diverse condizioni sperimentali.

simultaneous-quantification-selected-kynurenines-analyzed-liquid

Research

Ricerca

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingegneria

Questo video spiega un metodo di cromatografia liquida quantitativa ad alte prestazioni in fase inversa (RP-HPLC) per misurare il metabolismo dell'adenosina e delle purine associate generato dal consumo di AMP nell'ambiente extracellulare delle cellule tumorali leucemiche. Il protocollo descrive un test RP-HPLC sensibile, specifico, affidabile e riproducibile, sviluppato e convalidato per la quantificazione di nucleotidi purinici extracellulari e nucleosidi prodotti da cellule di leucemia...

Metabolismo extracellulare delle purine: un test basato sull'HPLC per misurare la generazione e il metabolismo dell'adenosina nelle cellule leucemiche

Analisi approfondite dei proteomi delle cellule tumorali facilitano l'identificazione di nuovi bersagli farmacologici e biomarcatori diagnostici. Descriviamo un flusso di lavoro sperimentale per l'analisi quantitativa di (fosfo-)proteomi in sottopopolazioni di cellule tumorali derivate da tumori liquidi e solidi. Ciò si ottiene combinando le strategie di arricchimento cellulare con la spettrometria di massa quantitativa basata su Super-SILAC.

Mass quantitativa spettrometrica Profiling di proteomi cancro-cellulari derivate da liquido e tumori solidi

Il protocollo qui descritto rappresenta un metodo semplice e riproducibile che impiega la cromatografia liquida ad alte prestazioni in fase inversa (RP-HPLC) per misurare il metabolismo delle purine su cellule di leucemia linfatica cronica (LLC) coltivate in diverse condizioni.

HPLC-based test per monitorare extracellulare Nucleotide / nucleosidici metabolismo in cronica cellule umane leucemia linfocitica

Competenza metabolica dei sistemi in vitro è un requisito fondamentale per la biotrasformazione e la disposizione di farmaci e sostanze tossiche. In questo protocollo, si descrive l'applicazione di sonde metabolici riferimento per valutare fase del metabolismo in colture cellulari.

Spettrometria di Massa e approcci Luminogenic a base di caratterizzare la fase I metabolica competenza di<em&gt; In Vitro</em&gt; colture cellulari

Questo protocollo descrive un processo analitico efficiente e conveniente di estrazione del campione e determinazione simultanea di più farmaci, doxorubicina (DOX), mitomicina C (MMC) e un metabolita DOX cardio-tossici, doxorubicinolo (DOXol), nel biologico campioni da un modello di tumore al seno preclinici trattati con nanoparticelle formulazioni della combinazione sinergica di farmaci.

Esempio di estrazione e quantificazione simultanea cromatografica di doxorubicina e mitomicina C successivi alla consegna combinazione farmaco in nanoparticelle topi del tumore-cuscinetto

Alterazioni in metaboliti neuroattivi kynurenine pathway (KP) sono implicate nelle malattie psichiatriche. Indagando i risultati funzionali di un alterato kynurenine pathway metabolismo in vivo nei roditori può contribuire a delucidare approcci terapeutici innovativi. L'attuale protocollo combina approcci biochimici e comportamentali per studiare l'impatto di una sfida di chinurenina acuta nei ratti.

Una misura di cromatografia liquida ad alte prestazioni della chinurenina e acido chinurenico: materia biochimica di cognizione e di sonno in ratti

Lo scopo di questo articolo è quello di descrivere un protocollo per l'estrazione di metaboliti acquosi da cellule aderenti coltivate per l'analisi metabolomica, in particolare, elettroforesi capillare-spettrometria di massa.

Estrazione di metaboliti acquosi da cellule aderenti coltivate per l'analisi metabolomica mediante elettroforesi capillare-spettrometria di massa

Una piattaforma di manipolazione cellulare integrata è sviluppata per l'uso in combinazione con una configurazione di spettrometria di massa a singola sonda per l'analisi on-line delle singole cellule delle sospensioni in condizioni ambientali.

Piattaforma di manipolazione cellulare integrata accoppiata con la sonda singola per l'analisi della spettrometria di massa di farmaci e metaboliti in singole cellule di sospensione

Qui, presentiamo un protocollo robusto per quantificare 40 composti coinvolti nel metabolismo centrale del carbonio e dell'energia nelle reazioni di sintesi proteica priva di cellule. La miscela di sintesi senza cellule viene derivata con un'anilina per una separazione efficace utilizzando la cromatografia liquida a fase invertita e quindi quantificata dalla spettrometria di massa utilizzando standard interni etichettati isotopicamente.

Quantificazione assoluta del metabolismo della sintesi proteica senza cellule da demografia-cromometria di massa a fase reverse

I protocolli descrivono metodi di cromatografia liquida ad alte prestazioni accoppiati all'indice di rifrazione o al rilevamento spettrometrico di massa per lo studio delle reazioni metaboliche in complessi sistemi privi di cellule a base di lisato.

Cromatografia liquida accoppiata all'indice di rifrazione o al rilevamento spettrometrico di massa per la profilazione dei metaboliti in sistemi privi di cellule a base di lisato

Qui presentiamo un metodo basato sulla citometria a flusso per la visualizzazione e la quantificazione di più marcatori associati alla senescenza in singole cellule.

Imaging simultaneo e rilevamento basato sulla citometria a flusso di marcatori di senescenza fluorescenti multipli in cellule tumorali senescenti indotte dalla terapia

Scopri come quantificare i metaboliti del triptofano nella via del chinurenina usando la cromatografia liquida-spettrometria di massa su colture cellulari tumorali. Questo protocollo validato garantisce dati affidabili per la ricerca oncologica.

Quantificazione simultanea di kynurenine selezionate analizzate dalla cromatografia liquida-spettrometria di massa in mezzo raccolto da colture cellulari tumorali (Video) | JoVE Journal

Quantificazione simultanea di kynurenine selezionate analizzate dalla cromatografia liquida-spettrometria di massa in mezzo raccolto da colture cellulari tumorali

Esplora altri video