Quantificazione simultanea di kynurenine selezionate analizzate dalla cromatografia liquida-spettrometria di massa in mezzo raccolto da colture cellulari tumorali

Le chinurenine sono associate alla regolazione della risposta immunitaria in diverse malattie, tra cui il cancro. Metodi affidabili e convalidati per l'identificazione di più chinurenine aiutano nello sviluppo di terapie più efficaci. Il nostro protocollo utilizza la cromatografia liquida accoppiata alla spettrometria di massa per identificare i diversi metaboliti del triptofano generati dalla via della chinurenina nel terreno raccolto da colture cellulari tumorali.

Gli utenti inesperti possono avere qualche difficoltà durante la preparazione del campione o le fasi di acquisizione e interpretazione dei dati. Seguendo il nostro protocollo e le nostre raccomandazioni, è possibile evitare errori e ottenere dati affidabili. Per preparare le soluzioni madre dei reagenti, pesare 0,3 milligrammi di ciascun reagente in una fiala con la massima precisione e sciogliere ciascun reagente in 300 microlitri del solvente appropriato per ottenere un grammo per litro di soluzioni madre di ciascun reagente.

Per preparare il terreno di coltura trattato con carbone, pesare 280 milligrammi di carbone attivo in una provetta conica e aggiungere cinque millilitri del terreno liquido preparato per la coltura delle cellule di interesse. Agitare il tubo con il substrato e il carbone su un bilanciere a bilanciere per due ore a temperatura ambiente e 50 oscillazioni al minuto. Al termine dell'incubazione, sedimentare il carbone mediante centrifugazione e raccogliere accuratamente il surnatante senza disturbare il carbone, quindi filtrare il mezzo utilizzando un filtro a siringa da 0,45 micrometri.

Per preparare la soluzione di calibrazione, aggiungere al terreno di coltura trattato con carbone con 0,75 microlitri di soluzione 3NT da 0,1 grammi per litro e aggiungere chinurenina 3-H, chinurenina 3-HAA e acido xanturenico ad almeno sei diverse concentrazioni per coprire tutti gli intervalli di calibrazione fino a un volume finale di 150 microlitri per campione. Dopo il vortex, aggiungere 150 microlitri di metanolo freddo a meno 20 gradi Celsius integrato con acido formico all'1% a ciascuna provetta per la deproteinizzazione del campione e tappare ermeticamente e agitare nuovamente le provette. Dopo un'incubazione di 40 minuti a meno 20 gradi Celsius, centrifugare i campioni e utilizzare una pipetta automatica per trasferire 270 microlitri di ciascun surnatante in singole fiale di vetro a fondo piatto.

Posizionare le fiale in un evaporatore e utilizzare il programma appropriato per le frazioni di metanolo d'acqua per far evaporare delicatamente i componenti volatili per circa 30 minuti. Quando le provette sono asciutte, ricostituire ogni campione in 60 microlitri di acido formico allo 0,1% in acqua e agitare i campioni prima di trasferire ogni soluzione in singole provette da 1,5 millilitri per la centrifugazione. Senza disturbare il sedimento, trasferire i surnatanti in fiale cromatografiche con inserti conici in vetro e posizionare le fiale in un autocampionatore LC-MS.

Prima di eseguire i campioni, spurgare il sistema LC con la fase mobile per rimuovere le bolle e adescare tutti i canali del solvente. Successivamente, lavare la protezione e la colonna analitica con acetonitrile al 100% per circa 30 minuti prima di lavare il sistema con solvente A al 100% fino a quando non si osserva una pressione stabile nella colonna, quindi impostare i parametri LC appropriati nel software di acquisizione dati e creare una lista di lavoro per l'esecuzione dei campioni sul sistema LC. Per costruire la curva di calibrazione, nel software di acquisizione dati, aggiungere gli standard di calibrazione alla lista di lavoro ed eseguire gli standard in triplicati, quindi integrare e misurare l'area del picco corrispondente a 3-idrossichinurenina, chinurenina, acido 3-idrossiantranilico, 3-nitrotirosina e acido xanturenico al tempo di ritenzione di circa 4,4, 10, 16, 21 e 30 minuti rispettivamente.

Per raccogliere campioni di surnatante da una coltura cellulare in vitro, dopo 48 ore di coltura cellulare standard delle cellule di interesse, trasferire 500 microlitri di surnatante da ciascun pozzetto in singole provette da 1,5 millilitri e rimuovere i detriti cellulari mediante centrifugazione, quindi trasferire i surnatanti medi in nuove provette per la conservazione a meno 80 gradi Celsius fino all'analisi e mantenere i pellet cellulari a meno 20 gradi Celsius fino all'analisi della stima delle proteine. Per preparare i campioni per l'analisi LC-MS, trasferire 149,25 microlitri di ciascun campione di terreno di coltura scongelato in una nuova provetta da 1,5 microlitri e aggiungere 0,75 microlitri di soluzione 3NT da 0,1 grammi per litro a ciascuna provetta. Dopo aver preparato i campioni come dimostrato, aggiungere 150 microlitri di metanolo a meno 20 gradi Celsius integrato con acido formico all'1% in ciascuna provetta e preparare il campione per l'analisi LC-MS come dimostrato.

Una volta completata l'elenco di lavoro, misurare l'area del picco di ciascun analita e utilizzare un'equazione di calibrazione lineare individuale dedicata per ciascun analita per calcolare le concentrazioni degli analiti presenti all'interno di ciascun campione sperimentale. Per valutare il contenuto proteico cellulare corrispondente al campione di terreno di coltura, risospendere ogni pellet cellulare in 100 microlitri di PBS e congelare i campioni a meno 20 gradi Celsius per un'ora prima di scongelarli con ghiaccio. Dopo aver congelato e scongelato i campioni tre volte, raccogliere i lisati cellulari mediante centrifugazione e trasferire i surnatanti in nuove provette senza disturbare i pellet.

Diluire il campione 10 volte con PBS fresco e aggiungere i volumi appropriati di soluzione standard di albumina sierica bovina in duplicato ai pozzetti appropriati di una piastra a 96 pozzetti. Caricare da 10 a 15 microlitri di ciascun surnatante del campione di lisato cellulare nei pozzetti appropriati della piastra a 96 pozzetti e riempire sia il pozzetto standard che il pozzetto del campione fino a un volume finale di 50 microlitri di PBS per pozzetto. Successivamente, aggiungere 200 microlitri di un reagente Bradford diluito cinque volte con acqua ultra pura a ciascun pozzetto e incubare la piastra per almeno cinque minuti a temperatura ambiente.

Al termine dell'incubazione, caricare la piastra su un lettore di micropiastre e misurare l'assorbanza a 595 nanometri, quindi costruire una curva di calibrazione per consentire il calcolo della quantità di proteine in ciascun campione e dividere la concentrazione di ciascuna chinurenina per il contenuto proteico totale per normalizzare la quantità di chinurenina in ciascun campione per un microgrammo di proteine. Ecco i risultati della spettrometria di massa a quadrupolo singolo ottenuti durante l'analisi di un terreno contenente 4,5 grammi per litro di D-glucosio e il 10% di siero fetale bovino. Si noti il piccolo picco che indica la presenza di chinurenina all'interno del campione.

Eseguire un campione di controllo qualità prima di richiedere i dati effettivi del campione per confermare i tempi di ritenzione appropriati degli analiti, poiché è possibile osservare uno spostamento dei segnali LC o discrepanze. I componenti della matrice a co-eluizione possono generare ioni con il rapporto di carica master selezionato per gli analiti target. Ad esempio, in questa analisi, il picco del composto sconosciuto è apparso nel periodo di scansione durante il quale è stato monitorato lo ione del rapporto di carica master 206.

A causa dell'incompatibilità del tempo di ritenzione, il segnale non corrispondeva all'analita. Sebbene l'isotopo del triptofano condividesse lo stesso ione del rapporto di carica master 206, l'analisi cromatografica ha rivelato che il segnale del triptofano era ben separato dal segnale dell'acido xantorenico, indicando che il livello di triptofano presente nel terreno delle cellule tumorali testato non ha influenzato la quantificazione dell'acido xantorenico. Questa analisi del terreno di coltura di due tipi di linee cellulari tumorali dimostra che le cellule di carcinoma mammario epiteliale umano valutate hanno rilasciato quantità diverse di metaboliti del triptofano, mentre le cellule di carcinoma ovarico umano testate hanno prodotto livelli significativamente più elevati di chinurenina.

L'utilizzo di uno standard interno durante la preparazione del campione aiuta con un'acquisizione affidabile dei dati. La normalizzazione dei dati al contenuto proteico corregge la variabilità del numero di cellule all'interno dei singoli pozzetti. Il nostro protocollo può essere ulteriormente ampliato per determinare ulteriori analiti, ma può accumularsi nel terreno di coltura in diverse condizioni sperimentali.