Esempio di estrazione e quantificazione simultanea cromatografica di doxorubicina e mitomicina C successivi alla consegna combinazione farmaco in nanoparticelle topi del tumore-cuscinetto

L'obiettivo generale di questo protocollo analitico è quello di estrarre e quantificare simultaneamente i due farmaci antitumorali Doxorubicina e Mitomicina C, co-somministrati da nanoparticelle ibride polimero-lipidico, e il metabolita della Doxorubicina, Doxorubicinolo, in matrici biologiche utilizzando un metodo di cromatografia liquida ad alte prestazioni in fase inversa semplice e robusto. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della nanomedicina, come ad esempio come progettare un efficace sistema di nanotrasporto basato sulla nanofarmacocinetica delle combinazioni di farmaci. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente la quantificazione simultanea di tre composti farmacologici nella stessa matrice biologica, senza la necessità di modificare la fase mobile dell'HPLC.

Quindi, questo metodo può fornire informazioni sui comportamenti biologici della doxorubicina, della mitomicina C e del doxorubicinolo nei tumori primari della mammella. Può essere applicato anche ad altri tipi di cancro trattati con farmaci simili. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché le fasi di preparazione dei campioni efficienti sono difficili da imparare.

Per iniziare questa procedura, raccogliere e congelare il sangue intero, gli organi principali e il tumore al seno come indicato nel protocollo di testo. Pesare rapidamente i tessuti congelati e registrare il peso sul taccuino di laboratorio. Quindi, trasferiscili in un tubo conico a fondo tondo da 13 millilitri.

Quindi, aggiungere da uno a cinque millilitri di tampone Cell Lysis ghiacciato. Utilizzando un omogeneizzatore manuale elettrico, omogeneizzare il tessuto con un movimento di corsa su e giù sul ghiaccio a 18.000 giri/min. Successivamente, lavare la sonda del generatore a dente di sega da 10 millimetri dell'omogeneizzatore con acqua deionizzata distillata.

Lavare la sonda con etanolo al 70% e poi di nuovo con acqua distillata deionizzata. Trasferire 50 microlitri di omogeneizzato tissutale o di sangue intero in una provetta per microcentrifuga in polipropilene da 1,5 millilitri. Quindi, aggiungere cinque microlitri di un 4-metilumbelliferone standard interno da 2.000 nanogrammi per millilitro.

Aggiungere un solvente di estrazione a freddo ghiacciato contenente 150 microlitri di acetonitrile e 100 microlitri di acetato di ammonio da cinque millimolari. Agitare energicamente il composto per due minuti. Centrifugare a 3.000 g e quattro gradi centigradi per 10 minuti.

Successivamente, trasferire 200 microlitri di surnatante in una provetta da microcentrifuga fresca e pre-raffreddata. Utilizzare un flusso lento di azoto gassoso per far evaporare il surnatante a 60 gradi Celsius con protezione dalla luce. Successivamente, ricostituire il residuo essiccato con 100 microlitri di metanolo ghiacciato.

Vorticare energicamente per 30 secondi. Centrifugare a 3.000 g e quattro gradi centigradi per cinque minuti. Quindi, trasferire il surnatante in un foglietto per flaconcino HPLC.

Collocare le fiale del campione in un vassoio per autocampionatore per l'iniezione. Per iniziare, preparare la fase mobile HPLC come descritto nel protocollo di testo. Impostare le condizioni iniziali della composizione della fase mobile su 16,5% H2O e 83,5% acetonitrile.

Impostare la portata isocratica su 1,0 millilitri al minuto. Quindi, separare i farmaci utilizzando la condizione di fase mobile a gradiente come descritto nel protocollo di testo. Successivamente, impostare il rivelatore UV su due canali: uno a 310 nanometri per il 4-metilumbelliferone standard interno e l'altro a 360 nanometri per la mitomicina C. Successivamente, impostare il primo canale del rivelatore di florescenza su una lunghezza d'onda di eccitazione di 365 nanometri e una lunghezza d'onda di emissione di 445 nanometri per il 4-metilumbelliferone.

Impostare il secondo canale su una lunghezza d'onda di eccitazione di 480 nanometri e una lunghezza d'onda di emissione di 560 nanometri per Doxorubicina e Doxorubicinolo. Per iniziare, utilizzare l'autocampionatore per iniettare 15 microlitri di campione. La composizione della fase mobile a gradiente programmato cambia automaticamente aumentando la composizione dell'acetonitrile da zero a 18 minuti.

Dopo 18 minuti, la condizione di fase mobile viene ristabilita alla condizione iniziale e riequilibrata per l'iniezione successiva. Dopo l'analisi di ogni campione, annotare i picchi dei composti farmacologici e i loro tempi di ritenzione. Quindi, utilizzare il software HPLC per integrare l'area del picco sotto la curva per i composti farmacologici.

Calcolare la percentuale di recupero del farmaco e il rapporto tra l'area sotto la curva tra ciascun composto farmacologico e lo standard interno, come indicato nel protocollo di testo. In questa procedura, due farmaci antitumorali, la doxorubicina e la mitomicina C, insieme al metabolita della doxorubicina, il doxorubicinolo, vengono rilevati senza interferenze biologiche. L'analisi HPLC mostra che ogni farmaco è ben separato dagli altri.

Il metodo HPLC sviluppato mostra una variazione inferiore al 15% nella precisione e nell'accuratezza intra e intergiornaliera per ciascuno dei farmaci studiati, sia nel sangue intero che in varie matrici biologiche, indicando un'eccellente riproducibilità. Vengono quindi determinate la farmacocinetica e la biodistribuzione della co-somministrazione di doxorubicina e mitomicina C basata su nanoparticelle a lungo circolante o pegilate. Nel sangue, le concentrazioni di farmaco somministrate dalle nanoparticelle ibride polimero-lipidico nel tempo sono almeno sei volte superiori rispetto alle soluzioni farmacologiche libere equivalenti.

In un tumore mammario ortotopico, le nanoparticelle ibride polimero-lipide possono co-fornire doxorubicina e mitomicina C al loro rapporto farmacologico sinergico. Rispetto alla soluzione farmacologica libera, si è visto che le nanoparticelle hanno un aumento dell'accumulo tumorale. Ciò è dovuto alla circolazione sistematica prolungata, che consente alle nanoparticelle di sfruttare la maggiore permeabilità e gli effetti di ritenzione del tumore.

Un'ulteriore formazione quantitativa di doxorubicinolo nel tumore al seno nell'arco di 24 ore, insieme all'apoptosi tumorale potenziata, indica che la biodisponibilità del farmaco è fondamentale nella progettazione di un'efficace formulazione di nanoparticelle. Utilizzando questo metodo HPLC, è stato dimostrato con successo che le nanoparticelle ibride polimero-lipide possono fornire con precisione una combinazione sinergica di farmaci nelle cellule tumorali in vivo, portando a una migliore chemioterapia. Questa tecnica può essere eseguita in circa due ore se eseguita correttamente.

Per ridurre al minimo la potenziale depredazione del farmaco, è importante ricordare di evitare la luce solare diretta e di mantenere il campione sul ghiaccio durante il tentativo di questa procedura. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada al ricercatore nel campo della nanomedicina per esplorare la nanofarmacocinetica della combinazione di farmaci e per progettare meglio l'efficace formulazione di nanoparticelle per la terapia del cancro. Dopo aver visto questo video, dovresti capire come estrarre e rilevare simultaneamente la doxorubicina, la mitomicina C e il metabolita della doxorubicina, il doxorubicinolo, su un'ampia gamma di campioni biologici contenenti nanoparticelle caricate con la combinazione di farmaci.

Non dimenticare che lavorare con farmaci antitumorali e acidi può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questo protocollo dovrebbero essere sempre applicate precauzioni di sicurezza come indossare guanti, occhiali e camici da laboratorio.