Name: Esempio di estrazione e quantificazione simultanea cromatografica di doxorubicina e mitomicina C successivi alla consegna combinazione farmaco in nanoparticelle topi del tumore-cuscinetto (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Impara a estrarre e quantificare simultaneamente Doxorubicina, Mitomicina C e Doxorubicinolo in campioni biologici mediante cromatografia liquida ad alta prestazione in fase inversa. Questo metodo HPLC supporta la ricerca in nanomedicina per lo studio della nanofarmacocinetica di combinazioni farmacologiche.

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Gli autori riconoscono con gratitudine la concessione di attrezzature dalle scienze naturali e ingegneria Research (NSERC) Council of Canada per HPLC, la sovvenzione di funzionamento dalla Canadian Institute of Health Research (CIHR) e canadesi al seno cancro ricerca (CBCR) Alleanza di X.Y. Wu e la borsa di studio di Università di Toronto a chrysantha Zhang e T. Zhang.

tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dall'animale cura Comitato di salute rete universitaria presso l'Ontario Cancer Institute e svolte secondo il canadese Consiglio sugli orientamenti di cura degli animali.
 1. preparazione del campione biologico <ol><li>raccogliere il sangue intero, gli organi principali e tumore del seno a intervalli di tempo predeterminati dopo somministrazione endovenosa (i.v.) di droga-contenenti formulazioni (ad es., DMPLN, DOX liposomiale) <ol><li>iniettare un seno tumore-cuscinetto del mouse i.v. con una formulazione preparata contenenti droga.</li>
		<li>Anestetizzare il mouse a intervalli di tempo designati (ad es., 15 min) dando inalabile 2% isoflurane in una camera stagna.</li>
		<li>Appoggiare il mouse anestetizzato sul dorso e mettere il suo naso attraverso un nasello che fornisce costantemente 2% isoflurane. 
		Nota: Per garantire il mouse subisce l'anestesia profonda, pizzicare delicatamente arti anteriori del mouse e cercare qualsiasi movimento contrazioni.</li>
		<li>Pulire accuratamente le regioni di torace e addome con etanolo al 70% e quindi eseguire una routine terminale della puntura cardiaca sui topi anestetizzati profondi utilizzando una siringa eparinizzata 1 mL e un ago di 23 G.</li>
		<li>Raccogliere il sangue intero in un etichettato sodio eparina spruzzato tubo di plastica e agitare delicatamente la provetta per assicurare sangue intero prelevato viene a contatto con l'eparina rivestito della parete del tubo. Raccogliere un minimo di 50 µ l di sangue intero. Tenere sempre i campioni su ghiaccio</li>
		<li>Nastro tutte e quattro le membra del mouse per fissarlo e aprire la cavità addominale e toracica del mouse usando un paio di pinze e forbici. Spostare gli intestini al lato e spingere il fegato verso l'alto per esporre sufficientemente la vena portale. Tagliare la vena portale per il drenaggio di sangue.</li>
		<li>Irrorare il corpo intero del mouse con 50 mL di soluzione fisiologica 0,9% ghiacciata attraverso il cuore usando una siringa da 10 mL con un ago 25 G. 
		Nota: Piegare l'ago a 90° per guidare la siringa nella vena portale.</li>
		<li>Organi di accise nel seguente ordine: cuore, polmone, fegato, milza, reni. Quindi, separare il tumore al seno dai tessuti connettivi circostanti utilizzando un paio di forbici di incisione a cuscinetto grasso mammario di destra del mouse. Raccogliere tutti gli organi individualmente in provette di polipropilene 1,5 mL e congelare rapidamente in azoto liquido. 
		&#8203; Nota: separare la colecisti dal fegato.</li>
		<li>Conservare il sangue intero a 4 ° C e tessuti asportati nel congelatore-80 ° C fino alla successiva analisi HPLC.</li>
	</ol></li> <li>Estrarre DOX, MMC e DOXol da matrici biologiche.
	<ol><li>Pesare tutti i tessuti dissecati congelati rapidamente e trasferirli in una provetta conica da 13 mL fondo arrotondato. Per evitare il metabolismo dei farmaci possibili o degradazione, mantenere i campioni su ghiaccio</li>
		<li>Aggiungere 1-5 mL di tampone di lisi cellulare ghiacciata nella provetta. 
		Nota: Il volume del buffer da utilizzare dipende dal peso del tessuto sulla base del rapporto di tessuto-buffer di 1 g: 5 mL (w/v); per piccoli organi, quali cuore e milza, il rapporto è di 1 g: 2 mL.</li>
		<li>Utilizzare un movimento su-giù di colpo per omogeneizzare i campioni di tessuto sul ghiaccio ad una velocità di 18.000 giri/min utilizzando un omogeneizzatore elettrico mano. 
		Nota: Omogeneizzazione completa richiede circa 3-5 iterazioni di un processo di omogeneizzazione breve meno di 15 s, seguita da raffreddamento sopra ghiaccio tra ogni breve omogeneizzazione del tessuto.</li>
		<li>Lavare la sonda generatore a dente di sega 10mm dell'omogeneizzatore con acqua distillata deionizzata (DDI) H 2 O, etanolo al 70% e poi DDI H 2 O tra ogni campione di tessuto per evitare la contaminazione incrociata.</li>
		<li>Trasferire 50 µ l di omogenato di tessuto o di sangue intero in un 1,5 mL in polipropilene micro-provetta e spike con 5 µ l di un interno standard (I.S.) 4-methylumbelliferone (4-MU) (2000 ng/mL) nella provetta. 
		Nota: soluzione di 4-MU è stato preparato in metanolo qui.</li>
		<li>Aggiungere 250 µ l di un solvente da estrazione ghiacciata nella provetta contenente il sangue intero o tessuto omogeneato. 
		Nota: Il solvente di estrazione consiste di 60% acetonitrile (ACN) e 40% ammonio acetato (5 mM) con pH regolato a pH = 3.5 utilizzando acido formico 0.05%. Utilizzare un campione di 1:5 (v/v): solvente di estrazione in rapporto al volume.</li>
		<li>Vigorosamente vortice la miscela per 2 min, centrifugare a 3.000 x forza g a 4 o C per 10 min e dispensare 200 µ l di supernatante nel tubo micro-centrifuga pre-refrigerato un altro fresco.</li>
		<li>Volatilizzi supernatante a 60 ° C sotto una leggera corrente di azoto gassoso con protezione dalla luce.</li>
		<li>Ricostituire il residuo essiccato con 100 µ l di metanolo ghiacciato, vortice vigorosamente per 30 s e centrifugare a 3000 x g a 4 ° C per 5 min, un altro</li>
		<li>Trasferire il surnatante in un inserto del flaconcino HPLC e inserire fiale del campione in un vassoio di autocampionatore iniettabile.</li>
	</ol></li></ol> 2. Strumentazione HPLC e parametri di funzionamento <ol><li>fase mobile HPLC preparare con costante riproducibilità <ol><li>misurare 500ml di grado HPLC H 2 O utilizzando un cilindro graduato.</li>
		<li>Misura 500 mL di acetonitrile di grado HPLC (ACN) mediante un cilindro graduato separato.</li>
		<li>Attentamente aggiungere 0,5 mL di acido trifluoroacetico (TFA) (attenzione) in ciascuno dei 500 mL di H 2 O e ACN per ottenere la fase mobile di H 2 O e ACN contenente 0,1% TFA, rispettivamente. 
		Nota: TFA è corrosivo e tossico e deve essere gestito sotto una cappa di laboratorio. Tutte le miscele di solventi sono preparate a temperatura ambiente.</li>
		<li>Filtro mobile fasi attraverso un filtro a membrana in nylon con un 0,45 µm dimensione dei pori e trasferirlo in bottiglie di serbatoio pulite HPLC.</li>
	</ol></li> <li>Strumentazione HPLC di set-up per la rilevazione simultanea di DOX, MMC e DOXol e I.S. 4-MU.
	<ol><li>Accendere la pompa gradiente, de-gasser, auto-campionatore, rivelatore a serie di fotodiodi e multi rivelatore a fluorescenza λ.</li>
		<li>Ingresso le condizioni iniziali di composizione mobile-fase al 16,5% H 2 O (0,1% TFA) e 83,5% ACN (0,1% TFA) (v/v).</li>
		<li>Impostare il rilevatore UV su due canali, uno a 310 nm 4-MU (I.S.) e l'altro a 360 nm per MMC.</li>
		<li>Impostare il rivelatore a fluorescenza su due canali, uno alla λ ex / λ em = 365/445 nm per 4-MU e l'altro a λ ex / λ em = 480 nm/560 nm per DOX e DOXol, rispettivamente.</li>
		<li>Fissare un tasso di flusso di isocratic di 1,0 mL/min.</li>
		<li>Equilibrare una colonna di 18 preinstallato fase inversa C (4,6 mm x 250 mm, 5 µm) a temperatura ambiente per 10 min per l'istituzione della linea di base.</li>
	</ol></li> <li>Separare farmaci (DOX, MMC, DOXol e 4-MU) utilizzando gradienti mobile-fase condizione.
	<ol><li>Iniettare 15 µ l di campioni estratti e ri-concentrati usando l'autocampionatore.</li>
		<li>Modificare gradualmente la condizione di mobile-fase iniziale (fare riferimento al protocollo passaggio 2.2.2) al 100% ACN (0,1% TFA) oltre 18 min utilizzando la pompa gradiente automatizzata. 
		Nota: Durante il processo di separazione, quattro canali (due UV assorbente e due fluorescenti) appaiono simultaneamente con ogni canale visualizzati da un farmaco composto (vedere il passaggio di protocollo 2.2.3 e 2.2.4).</li>
		<li>Mantenere il 100% di ACN (0,1% TFA) per 1 min e poi tornare alla condizione iniziale fase mobile entro 1 min.</li>
		<li>Ri-condizionare la colonna con la fase mobile iniziale alla portata di 1,5 mL/min per 4 min per l'iniezione del campione successivo.</li>
	</ol></li></ol> 3. Convalida di HPLC <ol><li>preparare campioni di lavoro di DOX, MMC e DOXol e 4-MU (I.S.).
	<ol><li>Pesare separatamente 1 mg di polvere della droga DOX e MMC (attenzione) e 4-MU su una nuova pesatura piccola carta (3 x 3 pollici 2). 
		Nota che tutti i farmaci anticancro sono considerati un pericolo per la salute che possa causare la mutagenicità delle cellule germinali e tossicità acuta per inalazione o ingestione. Devono essere manipolati con attenzione con guanti e maschere.</li>
		<li>Trasferire la pesata DOX, MMC e 4-MU in un nuovo individuali 1,5 mL in polipropilene micro-provetta.</li>
		<li>Aggiungere 1 mL di methAnol e vortexare brevemente per ottenere la concentrazione di 1 mg/mL di DOX e MMC.</li>
		<li>Aggiungere 1 mL di metanolo in un flacone contenente pre-pesati 1 mg di DOXol (attenzione) e vortex brevemente per ottenere la concentrazione di 1 mg/mL di DOXol. 
		Nota: DOXol è un metabolita tossico cardio e dovrebbe essere maneggiato con cura.</li>
		<li>Pipetta 20 µ l di soluzioni preparate stock di DOX, MMC, DOXol e 4-MU in un nuovo separare 1,5 mL in polipropilene micro-provetta e 980 µ l di metanolo per ottenere uno standard di lavoro di 20 µ g/mL di ogni droga.</li>
		<li>Diluire 20 µ g/mL di DOX, MMC e DOXol usando il metanolo per ottenere gli standard di lavoro di 50 ng - 20 µ g/ml per DOX, MMC e DOXol e 2000 ng/mL per I.S. 4-MU.</li>
		<li>Sigillare il tappo della provetta di soluzioni di lavoro con un pezzo stretto del film di copertura di paraffina per evitare l'evaporazione del metanolo, avvolgere il tubo intero con carta stagnola per evitare l'esposizione a luce diretta e conservare a -20 ° C.</li>
	</ol></li> <li>Determinare la linearità, precisione e accuratezza di DOX, MMC e DOXol in matrici biologiche (cioè, sangue intero e tumore omogeneato).
	<ol><li>Contemporaneamente spike 5 µ l di standard lavorativi di DOX e DOXol (50 ng/mL - 20 µ g/mL), MMC (1.000 ng/mL - 16 µ g/mL) e 4-MU (2 µ g/mL) in 50 µ l di sangue intero in bianco o omogenato di tessuto in polipropilene tubi micro-centrifuga per ottenere la curva di concentrazione standard che vanno da 5-2000 ng/mL per i residui di droga e 200 ng/mL per 4-MU (I.S.).</li>
		<li>Eseguire il dosaggio di estrazione droga descritto nel protocollo 1.2.</li>
		<li>Utilizzare concentrazioni di basse, media ed alte di DOX e DOXol (50, 500 e 2.000 ng/mL) e MMC (100, 1000, 2.000 ng/mL) per accuratezza e precisione intra - e inter - giorno. 
		Nota: Preparare fresche concentrazioni standard il giorno dell'analisi.</li>
	</ol></li> <li>Analisi dei campioni <ol><li>iniettare 15 µ l del campione utilizzando l'autocampionatore.</li>
		<li>Modificare gradualmente la fase mobile in 0 e 18 minuti, aumentando la composizione di ACN nell'intervallo di tempo.</li>
		<li>Dopo 18 minuti, tenere la condizione di fase mobile per 1 min.</li>
		<li>Tornare alla condizione iniziale sopra il prossimo 2 min, poi ri-equilibrare per 4 min prima dell'iniezione successiva.</li>
		<li>Dopo ogni esecuzione dell'esempio, nota che i picchi di composti di droga con il loro tempo di ritenzione sono mostrati come segue: MMC, DOXol, 4-MU (I.S.) e DOX.</li>
		<li>Integrare l'area sotto la curva (AUC) di droga composti utilizzando software HPLC.</li>
		<li>Calcolare il rapporto AUC tra singolo farmaco composto e I.S. (equazione 1) e utilizzare le curve standard preparate secondo le medesime procedure di estrazione per determinare le concentrazioni di farmaco di DOX, MMC e DOXol nella formulazione DMPLN. 
		<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56159/56159eq1.jpg" /></li> <li>calcolare la percentuale di recupero di droga (equazione 2) confrontando le concentrazioni di farmaco ricostituite usando il metanolo da estratti di campioni biologici arricchiti a quello dello standard (&#34; ordinate &#34;) soluzione in metanolo della droga. 
		<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56159/56159eq2.jpg" /></li></ol></li></ol>

Gli autori non hanno concorrenti interessi finanziari e conflitti di interesse.

Rispetto ad altri metodi cromatografici che permettono la rilevazione di una singolo farmaco specie in un momento, il presente protocollo HPLC è in grado di quantificare contemporaneamente tre composti di droga (DOX, MMC e DOXol) nella stessa matrice biologica senza la necessità di cambiare la fase mobile. Questo metodo di preparazione e l'analisi è stato applicato correttamente per determinare la farmacocinetica e la bio-distribuzione di due sistemi di erogazione del farmaco a base di nanoparticelle (cioè, lipo...

La chemioterapia è una modalità di trattamento primario per molti cancri ma spesso è associato con gli effetti contrari severi ed efficacia limitata a causa della resistenza ai farmaci e altri fattori1,2,3. Per migliorare il risultato della chemioterapia, regimi di combinazione della droga sono stati applicati nella clinica sulla base di considerazioni come tossicità non sovrapposte, diversi meccanismi d'azione dei farmaci e non-Croce farmaco resistenza4,5 , 6. negli studi clinici, un migliore tasso di risposta del tumore è stato osservato spesso utilizzando simultaneamente amministrato combinazioni di farmaci rispetto a un regime di droga sequenziale consegna7,8. Tuttavia, a causa di sub-ottima bio-distribuzione delle forme di farmaco libero, iniezione simultanea di più farmaci può causare tossicità prominente tessuto normale che supera l'effetto terapeutico9,10,11. Consegna della droga basata su Nanocarrier è stato indicato per alterare la farmacocinetica e la bio-distribuzione di farmaci incapsulati, migliorare il targeting tumorale accumulo12,13,14. Come Recensito in nostri articoli recenti, nanoparticelle co-caricate con combinazioni di farmaci sinergici hanno dimostrato la capacità di attenuare i problemi incontrati da combinazioni di farmaco libero, a causa della loro co-consegna temporale e spaziale controllata di le droghe multiple al tessuto del tumore, consentendo effetti sinergici farmaco contro il cancro cellule4,15,16. Di conseguenza, la superiore efficacia terapeutica e bassa tossicità sono state dimostrate in entrambi gli studi pre-clinici e clinici4,17,18.
I nostri precedenti studi in vitro ha trovato che la combinazione di due farmaci anticancro, doxorubicina (DOX) e mitomicina C (MMC), ha prodotto un effetto sinergico contro parecchie linee di cellule di cancro al seno e, inoltre, co-caricamento DOX e MMC entro nanoparticelle di polimero-lipidiche ibrido (DMPLN) ha superato vari multi-farmaco resistente associato efflusso pompe (per esempio, P-glicoproteina e proteina resistente al cancro al seno)19,20,21. In vivo, DMPLN abilitato co-consegna spazio-temporale di DOX e MMC per siti tumorali e aumentata biodisponibilità di farmaci all'interno delle cellule di cancro, come indicato dalla moderazione della formazione del metabolita DOX doxorubicinolo (DOXol)22. Di conseguenza, il DMPLN enhanced apoptosi delle cellule del tumore, l'inibizione della crescita del tumore e sopravvivenza prolungata ospite rispetto alla libera combinazione di DOX e MMC o un liposomiale DOX formulazione22,23,24, 25.
Analizzando la quantità effettiva di farmaci co-consegnato da un nanocarrier è fondamentale per la progettazione di formulazioni efficaci delle nanoparticelle. Molti metodi sono stati sviluppati per analizzare il livello del plasma di dosi singole di DOX o MMC mediante cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC) da solo o in combinazione con spettrometria di massa (MS)26,27,28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34. Tuttavia, questi metodi sono spesso richiede molto tempo e poco pratico per la terapia di combinazione come un gran numero di campioni biologici deve essere preparati separatamente per l'analisi delle droghe multiple (a volte tra cui metaboliti della droga). Oltre il legame alle proteine plasmatiche forte di DOX e MMC, i globuli rossi hanno anche una grande capacità di legare e di concentrare molti farmaci antitumorali35,36. Così, l'analisi del plasma per DOX o MMC può offuscare le concentrazioni di farmaco di sangue reale. Il presente lavoro (Figura 1) descrive un semplice e robusto metodo di analisi di droga multiplo mediante HPLC in fase inversa per estrarre contemporaneamente e quantificare DOX, MMC e la DOX metabolita doxorubicinolo (DOXol) da sangue intero e di vari tessuti ( ad esempio, i tumori). È stato applicato con successo per determinare la farmacocinetica e la bio-distribuzione di DOX e MMC nonché la formazione di DOXol dopo somministrazione di farmaci tramite soluzioni gratuite o forme di nanoparticelle (cioè, DMPLN e DOX liposomiale) in un orthotopically impiantato il modello murino di tumore mammario murino dopo somministrazione endovenosa (i.v.) iniezione22.

<table><tbody><tr><td>Doxorubicina&nbsp;</td><td>Polymed Theraeutics</td><td>111023</td><td>Farmaco antitumorale</td></tr><tr><td>Mitomicina C</td><td>Polymed Theraeutics</td><td>060814</td><td>Farmaco antitumorale</td></tr><tr><td>Doxorubicinolo (DOXol)</td><td>Toronto Research Chemicals</td><td>D558020</td><td>Metabolita del sale sodico DOX</td></tr><tr><td>4-Methylumbelliferone&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1508</td><td>Standard interno</td></tr><tr><td>Acido miristico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>544-63-8&nbsp; &nbsp;</td><td>Materiali per nanoparticelle ibride polilipidiche</td></tr><tr><td>Poliossietilene (100) Spettro stearato</td><td></td><td>M1402</td><td>Materiali per nanoparticelle ibride polilipidiche</td></tr><tr><td>Poliossietilene (40) Stearato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3440</td><td>Materiali per nanoparticelle ibride polilipidiche</td></tr><tr><td>Pluronic F68 (PF68)</td><td>BASF Corp.</td><td>9003-11-6</td><td>Materiali per nanoparticelle ibride polilipidiche</td></tr><tr><td>Ultrasonicazione (UP100H)</td><td>Hielscher, Tecnologia ad ultrasuoni</td><td>NA</td><td>Preparazione di nanoparticelle</td></tr><tr><td>Bagno d'acqua (ISOTEMP 3016HS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>NA</td><td>Preparazione di nanoparticelle</td></tr><tr><td>Doxorubicina liposomiale&nbsp; (Caelyx)</td><td>Janssen</td><td>Acquistato dalla farmacia Princess Margaret Hospital</td><td>Formulazione di nanoparticelle clinicamente approvata&nbsp;</td></tr><tr><td>Metanolo classificato HPLC</td><td>Caledon Chemicals</td><td>6701-7-40</td><td>Composizione della fase mobile HPLC</td></tr> H<tr><td>2O</td><td>Caledon Chemicals</td><td>8801-7-40</td><td>Composizione della fase mobile HPLC</td></tr><tr><td>Acetonitrile classificato HPLC&nbsp;</td><td>Caledon Chemicals</td><td>1401-7-40</td><td>Composizione della fase mobile HPLC</td></tr><tr><td>Acido trifluoroacetico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>302031</td><td>Composizione della fase mobile HPLC</td></tr><tr><td>0,45 &mu; m Carta da filtro a membrana in nylon</td><td>Whatman</td><td>WHA7404004</td><td>HPLC preparazione della fase mobile</td></tr><tr><td>Siringhe di plastica da 1 cc</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>2606-309659</td><td>Iniezione di trattamento</td></tr><tr><td>Siringhe di plastica da 5 cc</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>2608-309646</td><td>Raccolte di tessuti</td></tr><tr><td>30G 1/2 aghi</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>305106</td><td>Iniezione di trattamento</td></tr><tr><td>25G 5/8 Aghi</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>305122</td><td>Collezioni di tessuti</td></tr><tr><td>Sterile 0,9% Soluzione salina</td><td>Università di Toronto House Brand</td><td>1011</td><td>Perfusione tissutale</td></tr><tr><td>13 ml Tubo conico a fondo arrotondato&nbsp;</td><td>SARSTEDT</td><td>62.515.006</td><td>Proliprolene, omogeneizzazione tissutale</td></tr><tr><td>Alpha Minimum Essential Medium (MEM)&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>12571063</td><td>Terreno cellulare</td></tr><tr><td>1 x tampone fosfato Soluzione salina</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td>Omogeneizzazione tissutale</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-100 ML</td><td>Omogeneizzazione tissutale</td></tr><tr><td>Acido formico</td><td>Caledon Sostanze chimiche</td><td>1/5/3840</td><td>Regolare il pH per l'estrazione solvente</td></tr><tr><td>Tubi di plastica spruzzati con eparina di sodio</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>367878</td> Bilancia analitica <td>per raccolta del sangue</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Sartorius&nbsp;</td><td>CPA225D</td><td>misuratori</td></tr> di <tr><td>pH NA&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-637-671</td><td>accumet BASIC</td></tr><tr><td>Vortex Mixter</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-215-365</td><td>Vortex di campioni alla velocità desiderata</td></tr><tr><td>1,5 ml&nbsp; Provetta per microcentrifuga</td><td>Fisherbrand</td><td>2043-05408129</td><td>Omogeneizzatore Prolyprolene</td></tr><tr><td>Model 1000</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-451-672</td><td>Centrifuga per omogeneizzazione tissutale</td></tr><tr><td>5702R</td><td>Eppendorf</td><td>5702R</td><td>Preparazione per l'estrazione</td></tr><tr><td>Sistema di evaporazione riscaldato</td><td>Glas-Col</td><td>NA</td><td>Ricostituzione del campione</td></tr><tr><td>Fiale con filettatura a vite HPLC</td><td>DIKMA</td><td>5320</td><td>Iniezione di campioni HPLC</td></tr><tr><td>Tappi a vite HPLC con setti in silicone bianco PTFE</td><td>DIKMA</td><td>5325</td><td>Iniezione di campioni HPLC</td></tr><tr><td>Inserto in polipropilene HPLC&nbsp; &nbsp;</td><td>Agilent Technologies</td><td>5182-0549</td><td>Volume massimo 250 &mu; l, Iniezione di campioni HPLC</td></tr><tr><td>Xbridge C18 Column</td><td>Waters Corporation</td><td>186003117</td><td>Analisi dei farmaci</td></tr><tr><td>Pompa a gradiente&nbsp;</td><td>Waters Corporation</td><td>W600</td><td>Analisi dei farmaci</td></tr><tr><td>Autocampionatore</td><td>Waters Corporation</td><td>W2707</td><td>Analisi dei farmaci Rivelatore</td></tr><tr><td>a matrice di fotodiodi&nbsp;</td><td>Waters Corporation</td><td>W2998</td><td>Analisi dei farmaci</td></tr><tr><td>Multi & lambda; rivelatore di fluorescenza&nbsp;</td><td>Waters Corporation</td><td>W2475</td><td>Analisi dei farmaci</td></tr><tr><td>EMPOWER 2</td><td>Waters Corporation</td><td>NA</td><td>Software di analisi dei dati</td></tr><tr><td>Scienziato</td><td>Micromath</td><td>NA</td><td>Analisi farmacocinetica</td></tr><tr><td>Femmine Balb/c Topi</td> Jackson <td>Laboratory</td><td>001026</td><td>Cellule</td></tr> di <tr><td>cancro al seno EMT6/WT</td> in vivo <td>Fornito dal Dr. Ian Tannock; Ontario Cancer Institute</td><td>NA</td><td>In vivo</td></tr></tbody></table>

esempio di estrazione e quantificazione simultanea cromatografica di doxorubicina e mitomicina c successivi alla consegna combinazione farmaco in nanoparticelle topi del tumore-cuscinetto

Sample Extraction and Simultaneous Chromatographic Quantitation of Doxorubicin and Mitomycin C Following Drug Combination Delivery in Nanoparticles to Tumor-bearing Mice

La chemioterapia di combinazione è usata frequentemente nella clinica per il trattamento del cancro; Tuttavia, gli effetti negativi associati al tessuto normale possono limitare il suo beneficio terapeutico. Combinazione della droga basata su nanoparticelle è stata indicata per attenuare i problemi incontrati dalla terapia di combinazione di farmaco libero. Nostri studi precedenti hanno dimostrato che la combinazione di due farmaci anticancro, doxorubicina (DOX) e mitomicina C (MMC), ha prodotto un effetto sinergico contro entrambi murino e cellule di cancro al seno umano in vitro. DOX e MMC co-caricato polimero-lipidico ibrido nanoparticelle (DMPLN) bypassato varie pompe del trasportatore di efflusso che conferiscono la resistenza del multidrug e migliorato l'efficacia dimostrata in modelli di tumore al seno. Rispetto alle forme di soluzione convenzionale, tale efficacia superiore del DMPLN è stata attribuita alla farmacocinetica sincronizzata di DOX e MMC e droga intracellulare aumentata biodisponibilità all'interno delle cellule del tumore abilitato di nanocarrier PLN.
Per valutare la farmacocinetica e la bio-distribuzione di co-somministrato DOX e MMC sia soluzione gratuita e forme delle nanoparticelle, un metodo di analisi della multi-droga semplice ed efficiente utilizzando inverso-fase ad alte prestazioni cromatografia liquida (HPLC) è stato sviluppato. Contrariamente ai metodi precedentemente segnalati che analizzate DOX o MMC singolarmente nel plasma, questo nuovo metodo HPLC è in grado di quantificare contemporaneamente DOX, MMC e un metabolita tossico cardio DOX, doxorubicinolo (DOXol), in varie matrici biologiche ( ad esempio, sangue intero, il tumore al seno e cuore). Una doppia sonda fluorescente e ultravioletti assorbente 4-methylumbelliferone (4-MU) è stato utilizzato come standard interno (I.S.) per il rilevamento di uno stadio di analisi multipla di droga con lunghezze d'onda differenti di rilevazione. Questo metodo è stato applicato con successo per determinare le concentrazioni di DOX e MMC consegnato da approcci di nanoparticelle e la soluzione nel sangue intero e vari tessuti in un modello murino ortotopico seno tumore. Il metodo analitico presentato è un utile strumento per l'analisi pre-clinica di recapito basata su nanoparticelle di combinazioni di farmaci.

Due farmaci anticancro, DOX e MMC, come pure il metabolita DOX, DOXol, sono stato rilevato contemporaneamente senza alcuna interferenza biologica nella stessa circostanza HPLC gradiente applicato utilizzando 4-MU come I.S. per rivelatori UV sia la fluorescenza. DOX, MMC, DOXol e 4-MU erano ben separati gli uni dagli altri con tempi di ritenzione di 5,7 min per MMC, 10,4 min per DOXol, 10,9 min 4-MU e 11,1 min per DOX (Figura 2). Ogni droga nel sangue intero e...

Questo protocollo descrive un processo analitico efficiente e conveniente di estrazione del campione e determinazione simultanea di più farmaci, doxorubicina (DOX), mitomicina C (MMC) e un metabolita DOX cardio-tossici, doxorubicinolo (DOXol), nel biologico campioni da un modello di tumore al seno preclinici trattati con nanoparticelle formulazioni della combinazione sinergica di farmaci.

Esempio di estrazione e quantificazione simultanea cromatografica di doxorubicina e mitomicina C successivi alla consegna combinazione farmaco in nanoparticelle topi del tumore-cuscinetto

Combination chemotherapy is frequently used in the clinic for cancer treatment; however, associated adverse effects to normal tissue may limit its ...

L'obiettivo generale di questo protocollo analitico è quello di estrarre e quantificare simultaneamente i due farmaci antitumorali Doxorubicina e Mitomicina C, co-somministrati da nanoparticelle ibride polimero-lipidico, e il metabolita della Doxorubicina, Doxorubicinolo, in matrici biologiche utilizzando un metodo di cromatografia liquida ad alte prestazioni in fase inversa semplice e robusto. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della nanomedicina, come ad esempio come progettare un efficace sistema di nanotrasporto basato sulla nanofarmacocinetica delle combinazioni di farmaci. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente la quantificazione simultanea di tre composti farmacologici nella stessa matrice biologica, senza la necessità di modificare la fase mobile dell'HPLC.Quindi, questo metodo può fornire informazioni sui comportamenti biologici della doxorubicina, della mitomicina C e del doxorubicinolo nei tumori primari della mammella. Può essere applicato anche ad altri tipi di cancro trattati con farmaci simili. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché le fasi di preparazione dei campioni efficienti sono difficili

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Insonazione di microbolle è una strategia promettente per l'ablazione del tumore al ridotto potere acustico medie nel tempo, così come per la somministrazione mirata di terapie. Lo scopo del presente studio è quello di sviluppare strategie di ultrasuoni a bassa dovere ciclo pulsante e nanovettori per massimizzare non ablazione termica microvascolare e la consegna a carico sottocutaneo C6 gliomi.

Mezzo di contrasto ecografico mirato trattamento dei gliomi nei topi tramite Drug-Bearing consegna delle nanoparticelle e ablazione microvascolari

Si descrive un metodo per l'imaging di risposta...

Vivo Imaging di risposte droga nel microambiente tumorale in modelli murini di cancro al seno

Questo articolo descrive le procedure per l'analisi di immagini ottiche delle nanoparticelle tumore-mirato, Herdox. In particolare, l'uso dettagliato del dispositivo di imaging multimodale per la rilevazione del tumore orientare e valutare la penetrazione del tumore è descritta qui.

Analisi delle Targeted proteina virale nanoparticelle distribuito HER2 + Tumori

Un esempio di un farmaco a base di acido nano polymalic è presentato verso la progettazione razionale di medicina personale che è applicabile al cancro. Esso descrive la sintesi di un farmaco nano per trattare il cancro al seno umano HER2-positivo in un topo nudo.

A base di acido Polymalic Nano biopolimeri per il targeting di più marcatori tumorali: un&#39;opportunità per la medicina personalizzata?

Descriviamo qui il metodo di imaging basato sulla microscopia fluorescente confocale a fibre (FCFM), che fornisce una modalità innovativa per comprendere i fenomeni fisiologici a livello cellulare e subcellulare in soggetti animali.

Chemioterapia-indotta vascolare Tossicità - in tempo reale<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging di Vessel Impairment

L'accumulo eterogeneo intra-tumorale di liposomi è stato collegato a un microambiente tumorale anormale. Qui vengono presentati i metodi per misurare la microcircolazione tumorale mediante imaging di perfusione e pressione elevata del fluido interstiziale (IFP) utilizzando un sistema robotico guidato da immagini. Le misurazioni sono confrontate con l'accumulo intratumorale di liposomi, determinato utilizzando l'imaging micro-CT volumetrico.

Le misurazioni spaziali di perfusione, interstiziale pressione del fluido e liposomi accumulo nei tumori solidi

Un protocollo per la preparazione e caratterizzazione di lipofila doxorubicina pro-farmaco caricata 1,2-distearoyl- SN -glycero-3-phosphoethanolamine- N - [amino (polietilene glicole) -2000] (DSPE-PEG) micelle è descritto.

Preparazione e caratterizzazione di lipofila doxorubicina micelle pro-farmaco

Le nanoparticelle stanno emergendo sistemi di drug delivery come promettenti per una vasta gamma di indicazioni. Qui, descriviamo un metodo semplice ma potente per la produzione di nanoparticelle di seta con reverse engineering di seta Bombyx mori. Queste nanoparticelle di seta possono essere facilmente caricati con un carico utile terapeutica e successivamente esplorato per le applicazioni di consegna della droga.

Fabbricazione e consegna della droga Applicazioni di seta nanoparticelle

La scarsa comprensione delle prestazioni in vivo delle nanomedicine ostacola la loro traduzione clinica. Qui sono descritte le procedure per valutare il comportamento in vivo dei nanofarmaci antitumorali a livello sistemico, tissutale, di singola cellula e subcellulare in topi immunocompetenti portatori di tumore. Questo approccio può aiutare i ricercatori a identificare promettenti nanofarmaci antitumorali per la traduzione clinica.

Una procedura completa per valutare il<em&gt; In Vivo</em&gt; Prestazioni del Cancro nanomedicina

In questo protocollo, le nanoparticelle d'oro modificate AS1411-g-PEI-g-PEG caricate con doxorubicina vengono sintetizzati tramite reazioni di ammide in tre step. Quindi, la doxorubicina viene caricata e consegnata alle cellule tumorali bersaglio per la terapia del cancro.

Sintesi di Nanoparticelle d'oro modificate Aptamer-PEI-g-PEG Caricate con doxorubicina per la consegna mirata di farmaci

Qui, descriviamo il protocollo per la somministrazione in vivo di nanoparticelle magnetiche di ossido di ferro che trasportano oligomeri di RNA al carcinoma mammario metastatico in modelli animali, fornendo un approccio clinicamente valido per il silenziamento terapeutico di acidi nucleici oncogenici.

Monitoraggio dell'accumulo di nanofarmaci nelle metastasi del carcinoma mammario murino

Impara a estrarre e quantificare simultaneamente Doxorubicina, Mitomicina C e Doxorubicinolo in campioni biologici mediante cromatografia liquida ad alta prestazione in fase inversa. Questo metodo HPLC supporta la ricerca in nanomedicina per lo studio della nanofarmacocinetica di combinazioni farmacologiche.

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Esempio di estrazione e quantificazione simultanea cromatografica di doxorubicina e mitomicina C successivi alla consegna combinazione farmaco in nanoparticelle topi del tumore-cuscinetto

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