Introduzione di mutazioni puntiformi nelle cellule staminali pluripotenti umane utilizzando l'editing del genoma senza soluzione di continuità

L'editing dei geni nelle cellule staminali pluripotenti umane è impegnativo. Questo protocollo fornisce la procedura dettagliata per l'editing del genoma in queste cellule utilizzando il caso Cas-90 accoppiato combinato con il vettore di puntamento. È affidabile e facile da seguire.

Il vantaggio principale di questo protocollo è che si tratta di un editing genomico senza soluzione di continuità. La selezione in due fasi aiuta ad aumentare le cellule bersaglio e ha reso più efficiente lo screening della genotipizzazione. Mantenere le cellule staminali pluripotenti umane su superfici codificate ricombinanti di laminina 21 in terreno mTeSR1.

Le cellule dovrebbero raggiungere il 70-85% di confluenza, 72 ore dopo un rapporto di divisione da uno a tre. Il giorno della trasfezione, rivestire un numero sufficiente di pozzetti di una piastra a 24 pozzetti con 300 microlitri della soluzione di laminina 521 e incubare la piastra a 37 gradi Celsius per almeno due ore. Dopo l'incubazione, rimuovere delicatamente la soluzione di rivestimento e aggiungere immediatamente 300 microlitri di terreno mTeSR1 fresco, integrato con 10 inibitori micromolari di ROCK in ciascun pozzetto.

Quindi rimetti la piastra nell'incubatrice. Estrarre le cellule staminali pluripotenti umane dall'incubatrice. Rimuovere il terreno esaurito e lavare le cellule una volta con un millilitro di DPBS sterile.

Quindi aggiungere un millilitro di reagente di dissociazione cellulare delicato a ciascun pozzetto e incubarlo a 37 gradi Celsius per sei-otto minuti per dissociare le cellule. Picchiettare delicatamente la piastra per assicurarsi che le cellule possano staccarsi facilmente. Quindi utilizzare un puntale P1000 per sollevare le cellule pipettando su e giù.

Aggiungere due millilitri di terreno mTeSR1 con l'inibitore ROCK per terminare la dissociazione. Mescolare bene la sospensione e trasferirla in un tubo da 50 millilitri. Centrifugare le celle a 200 G per tre minuti.

Quindi rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in due millilitri di terreno mTeSR1 con inibitore ROCK. Contare le cellule utilizzando un emocitometro e il blu di tripano. Trasferire da 800.000 a 1 milione di cellule in una provetta da 1,5 millilitri per ogni reazione di nucleofecazione e centrifugarle a 200 G per tre minuti.

Quindi aspirare con cura il surnatante. Mescolare tre microgrammi dei plasmidi di espressione dell'RNA guida singola Cas-9n accoppiati e cinque microgrammi di plasmide vettore bersaglio in 100 microlitri di soluzione di nucleofeczione mista dal kit di nucleofecazione delle cellule staminali umane. Preparare anche una miscela di plasmidi di controllo GFP.

Risospendere le cellule con la miscela di DNA e trasferirle in una cuvetta di elettroporazione, facendo attenzione a evitare bolle d'aria. Elettroporare le cellule con il dispositivo di nucleofecazione utilizzando la condizione ottimizzata per le cellule staminali pluripotenti umane. Aggiungere immediatamente 500 microlitri di terreno mTeSR1 fresco e caldo integrato con 10 inibitori micromolari di ROCK alle cellule elettroporate.

Quindi trasferire la miscela in due pozzetti della piastra a 24 pozzetti precedentemente preparata. Metti la piastra in un incubatore a 37 gradi Celsius fornito con il 5% di anidride carbonica per consentire alle cellule di riprendersi. Sostituire il terreno di mantenimento cellulare dopo 12-16 ore, ritirando l'inibitore ROCK se le cellule stabiliscono un contatto cellula-cellula.

Dopo 24-48 ore, controllare l'efficienza della nucleofezione esaminando l'espressione di GFP nelle cellule di controllo. Iniziare a selezionare le cellule integrando il terreno mTeSR1 con un microgrammo per millilitro di puromicina, 48 ore dopo la nucleofezione. Dopo 72 ore integrare il terreno con 0,5 microgrammi per millilitro di puromicina.

Se la confluenza cellulare è inferiore al 30%, integrare anche il terreno con 10 inibitori micromolari di ROCK. Da quattro a sei giorni dopo il passaggio della nucleofectione le cellule resistenti alla puromicina in piastre da 10 a 15 96 pozzetti alla concentrazione di 0,8 cellule per pozzetto. Assicurati di integrare il terreno con l'inibitore ROCK e la puromicina.

Mantenere le cellule a 37 gradi Celsius e al 10% di anidride carbonica per 10-12 giorni per formare colonie derivate da singole cellule. Rabboccare il terreno sette giorni dopo la semina. Contrassegnare i pozzetti contenenti una singola colonia e sostituire il terreno con terreno mTeSR1 fresco, contenente 0,5 microgrammi per millilitro di puromicina, ma nessun inibitore ROCK.

Fai crescere le cellule per altri due giorni a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica. Quindi cambiare terreno per pozzetti contenenti colonie indifferenziate. Raschiare delicatamente le colonie e trasferire la sospensione cellulare da una colonia in due nuovi pozzetti su piastre separate da 96 pozzetti.

Uno per la genotipizzazione e uno per il mantenimento. Una volta che la confluenza delle cellule di genotipizzazione raggiunge il 50% o più, scaricare il terreno esaurito e lavare le cellule una volta con DPBS. Lisare le cellule con il tampone di lisi Bradley e isolare il DNA genomico da ciascun pozzetto.

Dopo aver eseguito tre PCR con giunzione primer e sequenziato i prodotti, conservare le colonie con il genotipo corretto e scartare il resto. Espandere le colonie corrette sotto selezione continua di puromicina e congelarle il prima possibile. Questo protocollo è stato utilizzato per introdurre due mutazioni puntiformi nell'esone 8 del gene alfa del fattore nucleare quattro degli epatociti.

È stato utilizzato un metodo di PCR basato su tre primer per lo screening delle cellule correttamente mirate ed è stato eseguito il sequenziamento Sanger per confermare i risultati della PCR. Dopo la rimozione della cassetta di selezione, la regione modificata è stata nuovamente sequenziata per confermare la corretta introduzione delle mutazioni puntiformi desiderate. Sono state selezionate colonie con il genotipo corretto e le cellule sono state caratterizzate prima di ulteriori analisi.

Le cellule modificate possiedono la stessa morfologia delle cellule parentali ed esprimono marcatori rappresentativi di cellule staminali pluripotenti umane, tra cui i fattori di trascrizione Nanog e Oct4, nonché marcatori di superficie cellulare, SSEA-4 e TRA-160. Quando si tenta questa procedura, è importante ricordarsi di controllare la confluenza cellulare dopo la selezione della puromicina durante le prime 24 ore. È essenziale integrare la mediana con l'inibitore ROCK.

Se la confluenza cellulare è inferiore al 30%per mantenere le cellule in funzione. Una volta che le linee di cellule staminali pluripotenti modificate con il genoma sono state stabilite, possono essere utilizzate per studiare la funzione genica o la differenziazione diretta. Questa tecnica apre la strada ai ricercatori per studiare diverse questioni, come la funzione specifica dei geni o la correzione genica mirata per le malattie genetiche.