Integrazione genica mirata mediata da TALEN: utilizzo di nucleasi specifiche per sequenza ingegnerizzate per l'inserimento preciso del gene della proteina fluorescente nelle hiPSC

Iniziare con cellule staminali pluripotenti indotte umane o sospensione di hiPSC in terreno. Aggiungere una coppia di nucleasi effettrici simili ad attivatori di trascrizione o plasmidi codificanti TALEN. Integrare con un plasmide donatore portatore di un gene proteico fluorescente, accoppiato a un gene di resistenza agli antibiotici, con bracci di omologia adiacenti per un allineamento specifico ai loci bersaglio.

Elettroporare la miscela per generare pori transitori nelle membrane cellulari, consentendo l'internalizzazione del plasmide. Una volta all'interno delle cellule, i plasmidi codificanti TALEN vengono elaborati, producendo TALEN, proteine chimeriche composte da un dominio di legame al DNA TALE sito-specifico fuso con un dominio di scissione dell'endonucleasi di restrizione FokI non specifico.

Ogni monomero TALEN attraverso il suo dominio di legame al DNA - che comprende moduli di ripetizione di amminoacidi tandem - riconosce e si lega ai loci bersaglio, un modulo per nucleotide, su ciascun filamento di DNA in orientamenti opposti, separati da una sequenza spaziatrice. I domini FokI quindi dimerizzano e fendono il DNA all'interno della sequenza spaziatrice, creando rotture a doppio filamento con sporgenze.

In presenza di plasmidi donatori contenenti bracci di omologia complementari alle regioni che fiancheggiano il sito scisso, la riparazione diretta dall'omologia avviene utilizzando la sequenza omologa come modello per la sintesi della riparazione del DNA per colmare le rotture del doppio filamento. Dopo la legatura dei nick, la proteina fluorescente e i geni di resistenza agli antibiotici vengono integrati nel genoma ospite.

Trattare le hiPSC, seminate su uno strato di cellule di alimentazione per supportare la crescita, con terreni contenenti antibiotici. Il gene della resistenza agli antibiotici senza promotore, guidato da un promotore endogeno a monte, facilita la selezione delle cellule modificate con TALEN.

Iniziare lavando le colture iPSC una volta ciascuna con PBS, quindi aggiungere 1 millilitro di reagente di dissociazione cellulare delicato a 37 gradi Celsius in ciascun pozzetto e incubare le cellule a 37 gradi Celsius per circa 5 minuti. Quando più del 50% delle cellule si è dissociato dal recipiente di coltura, utilizzare una pipetta P1000 per interrompere meccanicamente eventuali grumi di cellule rimanenti o cellule attaccate. Quindi, aggiungere 2 millilitri di terreno E8 a ciascun pozzetto e utilizzare una pipetta da 10 millilitri per disaggregare ulteriormente le colture in sospensioni a cellula singola.

Ora, versa le cellule raccolte in un tubo conico da 15 millilitri e girale verso il basso. Risospendere il pellet in una quantità minima di terreno E8 per il conteggio. Quindi, dopo aver confermato la vitalità delle colture mediante esclusione del blu di tripano e la loro sufficiente dissociazione, trasferire 3 milioni di cellule in ciascuna delle due provette coniche da 15 millilitri.

Durante la centrifugazione delle cellule, impostare il sistema di elettroporazione sul programma specifico per il tipo di cellula per la linea di cellule staminali embrionali umane, H9. Quindi, aggiungere 10 microgrammi del solo donatore di ricombinazione omologa a 1 pellet per il campione di controllo e 10 microgrammi del plasmide donatore di ricombinazione omologa insieme a 5 microgrammi di ciascun plasmide TALEN per il campione sperimentale.

Quindi, aggiungere 100 microlitri di soluzione completa di trasfezione di cellule primarie P3 a temperatura ambiente a ciascuno dei pellet di controllo e sperimentali e risospendere le cellule. Trasferire i campioni in singole cuvette e quindi elettroporare i campioni. Immediatamente dopo la trasfezione, aggiungere 500 microlitri di terreno E8 a temperatura ambiente a ciascuna cuvetta, quindi trasferire i campioni di iPSC sezionati goccia a goccia in piastre individuali da 10 centimetri contenenti fibroblasti embrionali di topo DR4.