Misurare le interazioni transcellulari attraverso l'aggregazione proteica in un sistema di cellule eterologi

Il test basato su cellule consente l'osservazione e la quantificazione delle interazioni di transadesione senza la necessità di lunghe purificazioni proteiche o di attrezzature specializzate. Sebbene le interazioni proteiche qui testate siano rilevanti per la neurobiologia, questo metodo può essere applicato a qualsiasi area di ricerca in cui l'adesione proteica si verifica a livello intercellulare. 48 ore dopo la trasfezione delle cellule HEK-293T, raccogliere le cellule dalla piastra a sei pozzetti per l'aggregazione.

Per prima cosa, lava ogni pozzetto due volte con PBS. Successivamente, per dissociare delicatamente le cellule, aggiungere un millilitro di EDTA da 10 millimolari a ciascun pozzetto, quindi incubare la piastra a 37 gradi Celsius. Dopo cinque minuti di incubazione, picchiettare delicatamente la piastra per staccare le cellule e raccoglierle in una provetta conica separata da 15 millilitri.

Centrifugare le provette a 500 x g a temperatura ambiente per cinque minuti. Mentre le cellule vengono pellettate, preparare sei provette di incubazione etichettando la parte superiore delle provette per microcentrifuga con le condizioni sperimentali. Deve essere utilizzata ogni permutazione di GFP e mCherry.

Rimuovere il surnatante dalle provette coniche da 15 millilitri e risospendere le cellule in 500 microlitri di terreno. Utilizzando un emocitometro, contare le cellule in ciascuna provetta conica. Quindi aliquotare 200.000 cellule di ciascuna condizione nella provetta di incubazione appropriata per una miscela uno a uno in un volume totale di 500 microlitri.

Dopo aver valutato l'aggregazione basale descritta nella sezione successiva, posizionare le provette di incubazione in un rotatore lento di provette a temperatura ambiente. Per valutare l'aggregazione, al basale e di nuovo dopo 60 minuti, pipettare 40 microlitri dalla provetta di incubazione su un vetrino da microscopio carico. L'acquisizione di base deve essere effettuata il più rapidamente possibile dopo l'aggiunta delle cellule alla provetta per microcentrifuga.

Visualizzare il vetrino sotto fluorescenza in entrambi i canali verde e rosso. Per ogni diapositiva, acquisisci immagini di tre diversi campi visivi su un piano focale. Le cellule HEK-293T sono state trasfettate con una proteina di interesse, una proteina mutata di interesse o un ligando di interesse e co-trasfettate con una proteina fluorescente.

Le popolazioni cellulari che esprimono la proteina di interesse sono state mescolate con le popolazioni cellulari che esprimono il ligando di interesse e valutate per l'aggregazione dopo 60 minuti. Nelle sovrapposizioni di immagini acquisite nei canali verde e rosso, l'aggregazione viene visualizzata come punti gialli. Le condizioni in cui le cellule non esprimevano alcun ligando sinaptico hanno mostrato un'aggregazione minima.

Inoltre, l'aggregazione minima è stata mostrata quando solo una delle due popolazioni esprimeva ligandi sinaptici. Non è stata mostrata alcuna aggregazione quando le due popolazioni di cellule esprimevano molecole di adesione incompatibili. Le condizioni con molecole di adesione compatibili hanno mostrato un'aggregazione significativa dopo un'incubazione di 60 minuti.

Sorprendentemente, la proteina mutata di interesse ha mostrato un'aggregazione significativamente maggiore rispetto alla sua controparte wild-type, suggerendo che la mutazione puntiforme migliora le capacità di legame delle proteine. Le mutazioni in molte molecole di adesione sono comunemente collegate a disturbi dello sviluppo neurologico, neuropsichiatrico e delle dipendenze. Con questa tecnica, è possibile esaminare gli effetti delle mutazioni puntiformi rilevanti per la malattia sulle interazioni trans.