Name: Misurare le interazioni transcellulari attraverso laggregazione proteica in un sistema di cellule eterologi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-22T14:45:00.000+00:00
Duration: 4 min 47 s
Description: Scopri un protocollo ottimizzato per misurare rapidamente le interazioni ligando-recettore in trans mediante microscopia a fluorescenza in cellule HEK-293T. Questo metodo permette di quantificare le interazioni di adesione proteica rilevanti per la neurobiologia.

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Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni del National Institute of Mental Health (R00MH103531 e R01MH116901 a J.A.), una borsa di formazione pre-dottorato del National Institute of General Medicine (da T32GM007635 a S.R.) e una Lyda Hill Gilliam Fellowship for Advanced Study (GT11021 to S.R.). Ringraziamo il Dr. Kevin Woolfrey per l'aiuto al microscopio, il Dr. K Ulrich Bayer per l'uso del suo microscopio epifluorescente e Thomas Südhof (Stanford University) per il plasmide LRRTM2.

1. Coltura cellulare e trasfezione
<ol><li>Rendere i supporti cellulari HEK con DMEM, 1x (Modifica del mezzo dell'aquila di Dulbecco) integrati con 4,5 g/L di glucosio, L-glutammina e piruvato di sodio e FBS al 10%. Filtro sterile.</li>
	<li>Predeterminare ligandi e recettori adatti per il test di aggregazione. NOTA: Neurexin3α SS4+/- e uno dei suoi ligandi noti, LRRTM2, sono stati utilizzati in questo studio. Ligandi e recettori di interesse sono stati espressi da cDNA in pcDNA3.1. Un assieme Gibson è stato utilizzato per inserire Neurexin3α in pcDNA3.112. Neurexin3α F/R: TTTAAACTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCGCCATGAGCTTTACCCTCCACTC/ GAGCGGCCGCCACTGTGCTGGATATCTGCAGAATTCTTACACATAATACTCCTTGTCCTT.</li>
	<li>Preparare le celle HEK293T.<ol>
<li>Far crescere le cellule HEK293T fino alla confluenza in un pallone T-75.</li>
		<li>Una volta confluente, utilizzare 2 mL di tripina e posizionare in un incubatore a 37 °C per 2 minuti. Aggiungere 6 ml di supporti HEK al pallone per rimospendare le celle e trasferire tutti gli 8 ml in un tubo conico da 15 ml.</li>
		<li>Pellet a 500 x g per 5 min e resuspend in supporti cellulari HEK per un totale di 8 mL.</li>
		<li>Contare le cellule e aggiungere 735.000 celle in ogni pozzo di una piastra a 6 po'. Regolare il volume finale a 2 mL per ogni pozzo utilizzando il supporto cellulare HEK.</li>
		<li>Mettere in incubatrice a 37 °C e lasciare che le cellule crescano durante la notte o fino a raggiungere il 50-60% di confluenza.</li>
	</ol></li>
	<li>Trasfetto cellule HEK293T utilizzando il metodo del fosfatodi calcio 13.<ol>
<li>Trasfetto bene-1 con 3 μg della proteina di interesse e co-trasfettura con 1 μg di proteina fluorescente (3 μg di pcDNA3.1-Neurexin3αWT SS4- e 1 μg di mCherry).</li>
		<li>Trasfetto bene-2 come nel passaggio 1.4.1. ma con la proteina mutata di interesse (pcDNA3.1-Neurexin3αA687T SS4-).</li>
		<li>Trasfetto bene-3 con 3 μg del ligando di interesse e co-trasfetto con 1 μg di un'altra proteina fluorescente (3 μg di pcDNA3.1 LRRTM2 e 1 μg di GFP).</li>
		<li>Trasfetto bene-4 e ben 5 per servire come controlli negativi: ben-4 con 1 μg di GFP e ben-5 con 1 μg di mCherry.</li>
		<li>Preparare un'altra piastra (come nel passaggio 1.4.1-1.4.4) se si richiedono condizioni o controlli aggiuntivi (Neurexin3αWT/A687T SS4+). NOTA: L'efficienza della trasfezione viene analizzata 24 ore dopo la trasfezione al microscopio a epifluorescenza e quantificata come il numero di cellule che esprimono la proteina fluorescente con cui sono state trasfette. Un approccio più snello includerebbe la trasfezione delle cellule HEK con una codifica vettoriale bicistronica per una proteina fluorescente e il ligando di interesse ed è altamente raccomandato sopra la co-trasfezione. Nel caso di questo studio, le neuressine alfa sono ~ 4,3 kb e la bassa intensità di fluorescenza è stata osservata usando un sistema bicistronico che richiede la co-trasfezione.</li>
	</ol></li>
	<li>48 ore dopo la trasfezione, cellule di raccolta per l'aggregazione.<ol>
<li>Lavare ogni bene due volte con PBS.</li>
		<li>Aggiungere 1 mL di EDTA da 10 mM in PBS in ogni pozzo per dissociare delicatamente le interazioni da cellula a cellula e incubare la piastra a 37 °C per 5 min. NOTA: La tripsidena non è raccomandata per il passaggio 1.5.2 a causa della potenziale scissione proteolitica delle molecole di adesione in studio. Inoltre, dopo l'aggiunta di EDTA, il protocollo potrebbe non essere interrotto fino al completamento poiché le celle saranno ora esposte a condizioni ambientali.</li>
		<li>Toccare delicatamente la piastra per staccare le celle e raccoglierla in tubi conici separati da 15 ml.</li>
		<li>Centrifuga tubi conici a 500 x g e temperatura ambiente per 5 min.</li>
	</ol></li>
	<li>Mentre le cellule sono in pellettizzazione, preparare 6 tubi di incubazione etichettando la parte superiore di ogni tubo di microcentrifugo ad ogni condizione. NOTA: Ogni permutazione delle condizioni GFP e mCherry deve essere utilizzata per comprendere tutte le condizioni sperimentali e i controlli adeguati. Ad esempio: 1. GFP/mCherry, 2. mCherry/LRRTM2-GFP 3. GFP/Neurexin3αWT SS4--mCherry, 4. GFP/Neurexin3αA687T SS4- –mCherry, 5. Neurexin3αWT SS4-—mCherry/LRRTM2—GFP, 6. Neurexin3αA687T SS4- –mCherry/LRRTM2-GFP. Crea tubi aggiuntivi per adattarsi a ulteriori condizioni e controlli.</li>
	<li>Rimuovere le cellule supernatanti e resuspend in 500 μL di mezzi HEK con CaCl2 da 10 mM e MgCl2 da 10 mM riscaldati a 37 °C. NOTA: L'aggiunta di CaCl2 e MgCl2 consente alle molecole di adesione di ristabilire il legame ed è necessaria solo se i partner di interazione transcellulare in questione richiedono formazioni divalenti per l'adesione.</li>
	<li>Contare le cellule in ogni tubo conico da 15 ml utilizzando un emocitometro e aliquote 200.000 celle di ciascuna condizione in un tubo appropriato dal passo 1.6.1 per una miscela 1:1 in un volume totale di 500 μL. NOTA: Per contare e aliquota devono essere previsti solo 5 minuti per condizione.</li>
	<li>Incubare i tubi a temperatura ambiente in un rotatore a tubo lento.</li>
</ol>2. Acquisizione di immagini
<ol><li>Ottimizzare i parametri di acquisizione del microscopio per campioni specifici. In questo esempio, le immagini sono state scattate su un microscopio a campo largo. Utilizzare un obiettivo 5x air (NA: 0.15; WD: 20000 μm) per ottenere un campo abbastanza grande per l'analisi.</li>
	<li>Valutare l'aggregazione di base immediatamente dopo aver mescolato le due condizioni delle celle HEK nel passaggio 1.8. Queste sono ora le immagini 'time zero'.<ol>
<li>Pipetta 40 μL di ogni miscela di campioni su un vetrino del microscopio caricato e immagine sotto fluorescenza sia nei canali 488 che 561.</li>
		<li>Acquisire tre diversi campi di visualizzazione con un piano di messa a fuoco per goccia di esempio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Acquisisci le immagini finali a 60 minuti come immagine "tempo 60".<ol>
<li>Per ottenere l'immagine "tempo 60" della miscela dopo un'incubazione di 60 minuti, prendere un altro campione di 40 μL di ciascuna condizione da tubi rotanti e pipettare ogni campione su uno scivolo carico. Immagine come nel passaggio 2.2.2. NOTA: l'aggregazione cellulare deve essere controllata ogni 15 minuti fino a quando non si verifica la saturazione. La tempistica dell'aggregazione dipenderà dalle proteine testate.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Analisi ImageJ/Fiji
<ol><li>Per quantificare l'estensione dell'aggregazione utilizzando Fiji/ImageJ, salvare i file di analisi.<ol>
<li>Salvare i file di codifica supplementari forniti nella cartella imageJ macros del computer.</li>
		<li>Installare la macro di aggregazione fornita (Plugin, Macro, Installa e selezionare il file "AggregationAssay.txt").</li>
	</ol>
</li>
	<li>Determinare le soglie.<ol>
<li>Caricare un 'time zero' .tif file in imageJ e dividere i canali (Image | Colore | Canali divisi). NOTA: l'immagine 'time zero' viene utilizzata per determinare la soglia e la dimensione minima del puncta per l'intero esperimento.</li>
		<li>Maschera ogni canale(plugin | Macro | AggregationAssay_MakeMask). Verrà visualizzata la finestra Crea maschera da immagine. Accanto a Determine Threshold for Image e Determine Cluster Params from Histogram e fare clic su OK.</li>
		<li>Determinare la soglia dell'immagine utilizzando la barra delle diapositive, registrare il numero a destra della barra della diapositiva e fare clic su OK.</li>
		<li>Verrà visualizzato un istogramma delle dimensioni del cluster. Selezionare una dimensione del cluster dall'istogramma adatto all'esperimento, digitare questo numero nella casella Dimensioni cluster minimo: e fare clic su OK. I cluster al di sotto di questa dimensione non verranno analizzati.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eseguire l'analisi.<ol>
<li>Aprire l'immagine "tempo 60" della condizione 1 in imageJ e dividere i canali come nel passaggio 3.2.1.</li>
		<li>Maschera ogni canale (plugin, macro, AggregationAssay_MakeMask). Utilizzare la stessa soglia e dimensione determinata nel passaggio 3.2.3 e nel passaggio 3.2.4. Deselezionare le caselle accanto a Determina soglia per immagine e Determinare i parametri cluster dall'istogramma e digitare manualmente le dimensioni e le soglie nei campi appropriati, quindi fare clic su OK.</li>
		<li>Calcolare l'indice di aggregazione (Plugins | Macro | AggregationAssay_CalculateOverlap). Selezionare i canali mascherati da confrontare e la directory in cui verranno salvate i file risultanti.</li>
		<li>Ripetere i passaggi da 3.3.1 a 3.3.3 per ogni immagine "tempo 60" in ogni condizione. NOTA: L'indice di aggregazione è definito come l'area di sovrapposizione totale divisa per la somma delle due aree di canale meno l'area di sovrapposizione moltiplicata per 100 (indice di aggregazione = area di sovrapposizione/[area del canale 1 + area del canale 2 – area di sovrapposizione] x 100). Questa normalizzazione è un'operazione 'OR' tra i due canali mascherati che rappresentano i pixel totali in entrambe le maschere.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Südhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroligins+and+neurexins+link+synaptic+function+to+cognitive+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neuroligins and neurexins link synaptic function to cognitive disease.</a> Nature. 455 (7215), 903-911 (2008).</li>
<li>Lakey, J. H., Raggett, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Measuring protein-protein interactions.</a> Current Opinion in Structural Biology. 8 (1), 119-123 (1998).</li>
<li>Aoto, J., Martinelli, D. C., Malenka, R. C., Tabuchi, K., Südhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+neurexin-3+alternative+splicing+trans-synaptically+controls+postsynaptic+AMPA+receptor+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Presynaptic neurexin-3 alternative splicing trans-synaptically controls postsynaptic AMPA receptor trafficking.</a> Cell. 154 (1), 75-88 (2013).</li>
<li>Aoto, J., Földy, C., Ilcus, S. M. C., Tabuchi, K., Südhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+circuit-dependent+functions+of+presynaptic+neurexin-3+at+GABAergic+and+glutamatergic+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Distinct circuit-dependent functions of presynaptic neurexin-3 at GABAergic and glutamatergic synapses.</a> Nature Neuroscience. 18 (7), 997-1007 (2015).</li>
<li>Südhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+Neurexin+Complexes%3A+A+Molecular+Code+for+the+Logic+of+Neural+Circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Synaptic Neurexin Complexes: A Molecular Code for the Logic of Neural Circuits.</a> Cell. 171 (4), 745-769 (2017).</li>
<li>Dai, J., Aoto, J., Südhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+Splicing+of+Presynaptic+Neurexins+Differentially+Controls+Postsynaptic+NMDA+and+AMPA+Receptor+Responses%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Alternative Splicing of Presynaptic Neurexins Differentially Controls Postsynaptic NMDA and AMPA Receptor Responses.</a> Neuron. 102 (5), 993-1008 (2019).</li>
<li>Restrepo, S., Langer, N. J., Nelson, K. A., Aoto, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+a+Neurexin-3%CE%B1+Human+Mutation+in+Mouse+Neurons+Identifies+a+Novel+Role+in+the+Regulation+of+Transsynaptic+Signaling+and+Neurotransmitter+Release+at+Excitatory+Synapses%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Modeling a Neurexin-3α Human Mutation in Mouse Neurons Identifies a Novel Role in the Regulation of Transsynaptic Signaling and Neurotransmitter Release at Excitatory Synapses.</a> The Journal of Neuroscience. 39 (46), 9065-9082 (2019).</li>
<li>Ko, J., Fuccillo, M. V., Malenka, R. C., Südhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRRTM2+Functions+as+a+Neurexin+Ligand+in+Promoting+Excitatory+Synapse+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">LRRTM2 Functions as a Neurexin Ligand in Promoting Excitatory Synapse Formation.</a> Neuron. 64 (6), 791-798 (2009).</li>
<li>de Wit, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRRTM2+Interacts+with+Neurexin1+and+Regulates+Excitatory+Synapse+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">LRRTM2 Interacts with Neurexin1 and Regulates Excitatory Synapse Formation.</a> Neuron. 64 (6), 799-806 (2009).</li>
<li>Linhoff, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Unbiased+Expression+Screen+for+Synaptogenic+Proteins+Identifies+the+LRRTM+Protein+Family+as+Synaptic+Organizers%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">An Unbiased Expression Screen for Synaptogenic Proteins Identifies the LRRTM Protein Family as Synaptic Organizers.</a> Neuron. 61 (5), 734-749 (2009).</li>
<li>Siddiqui, T. J., Pancaroglu, R., Kang, Y., Rooyakkers, A., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRRTMs+and+Neuroligins+Bind+Neurexins+with+a+Differential+Code+to+Cooperate+in+Glutamate+Synapse+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">LRRTMs and Neuroligins Bind Neurexins with a Differential Code to Cooperate in Glutamate Synapse Development.</a> Journal of Neuroscience. 30 (22), 7495-7506 (2010).</li>
<li>Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. -Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li>
<li>Bacchetti, S., Graham, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+of+the+gene+for+thymidine+kinase+to+thymidine+kinase-deficient+human+cells+by+purified+herpes+simplex+viral+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Transfer of the gene for thymidine kinase to thymidine kinase-deficient human cells by purified herpes simplex viral DNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (4), 1590-1594 (1977).</li>
<li>Cerchiari, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+strategy+for+tissue+self-organization+that+is+robust+to+cellular+heterogeneity+and+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A strategy for tissue self-organization that is robust to cellular heterogeneity and plasticity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (7), 2287-2292 (2015).</li>
<li>Burdick, M. M., McCarty, O. J. T., Jadhav, S., Konstantopoulos, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-cell+interactions+in+inflammation+and+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Engineering+in+Medicine+and+Biology+Magazine%22%5BJournal%5D)">Cell-cell interactions in inflammation and cancer metastasis.</a> IEEE Engineering in Medicine and Biology Magazine. 20 (3), 86-91 (2001).</li>
<li>Fox, D. A., Gizinski, A., Morgan, R., Lundy, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-cell+interactions+in+rheumatoid+arthritis+synovium%5BTitle%5D)+AND+%22Rheumatic+Diseases+Clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">Cell-cell interactions in rheumatoid arthritis synovium.</a> Rheumatic Diseases Clinics of North America. 36 (2), 311-323 (2010).</li>
<li>Yamagata, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+modulation+and+selectivity+of+transsynaptic+neurexin-LRRTM+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Structural insights into modulation and selectivity of transsynaptic neurexin-LRRTM interaction.</a> Nature Communications. 9 (1), 3964(2018).</li>
<li>Nguyen, T., Südhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+properties+of+neuroligin+1+and+neurexin+1beta+reveal+function+as+heterophilic+cell+adhesion+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Binding properties of neuroligin 1 and neurexin 1beta reveal function as heterophilic cell adhesion molecules.</a> The Journal of Biological Chemistry. 272 (41), 26032-26039 (1997).</li>
<li>Boucard, A. A., Ko, J., Südhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Affinity+Neurexin+Binding+to+Cell+Adhesion+G-protein-coupled+Receptor+CIRL1%2FLatrophilin-1+Produces+an+Intercellular+Adhesion+Complex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">High Affinity Neurexin Binding to Cell Adhesion G-protein-coupled Receptor CIRL1/Latrophilin-1 Produces an Intercellular Adhesion Complex.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (12), 9399-9413 (2012).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Sezionare le interazioni proteina-proteina che si verificano in trans durante l'adesione cellulare può portare a una migliore comprensione dei meccanismi molecolari alla base dei processi cellulari di base tra cui la formazione, la funzione e il mantenimento delle sinapsi durante la maturazione e il rimodellamento. Le implicazioni delle interazioni cellula-cellula si espandono oltre la neurobiologia e hanno ruoli più ampi nella trasduzione del segnale, nella migrazione cellulare e nello sviluppo deitess...

Le interazioni sinaptiche facilitate dalle molecole di adesione sinaptica sono fondamentali per lo sviluppo, l'organizzazione, le specifiche, il mantenimento e la funzione delle sinapsi e la generazione di reti neurali. L'identificazione di queste molecole di adesione delle cellule transsinaptiche è in rapido aumento; pertanto, è fondamentale identificare partner vincolanti e capire come queste nuove molecole di adesione interagiscono tra loro. Inoltre, il sequenziamento del genoma ha identificato mutazioni in molte di queste molecole di adesione che sono comunemente collegate a una moltitudine di disturbi del neurosviluppo, neuropsichiatrici e della dipendenza1. Mutazioni nei geni che codificano per molecole sinaptiche di adesione cellulare possono alterare negativamente le interazioni trasmissibili e possono contribuire ad alterazioni fisiopatiche nella formazione e o nel mantenimento della sinapsi.
Esistono più saggi per valutare quantitativamente le interazioni proteina-proteina come la calorimetria isotermica, il dicroismo circolare, la risonanza plasmonicasuperficiale 2 e, sebbene di natura quantitativa, hanno diversi limiti. In primo luogo, richiedono proteine ricombinanti, a volte richiedendo lunghi e noiosi passaggi di purificazione. In secondo luogo, richiedono sofisticate attrezzature specializzate e competenze tecniche. In terzo luogo, possono sopravvalutare l'estensione del legame in quanto consentono sia interazioni cis che trans tra proteine che sono naturalmente legate a una membrana in vivo. Qui proponiamo un saggio semplice e relativamente rapido che testa esclusivamente le interazioni trans.
Per aggirare molte delle complicazioni associate ai test proteici purificati, abbiamo ottimizzato un saggio di interazione proteica a base cellulare che riassume le interazioni trans in un sistema di cellule eterologhe ridotto. Questo saggio è stato precedentemente utilizzato in varie forme per studiare le interazioni transcellulari. In questo approccio, le molecole di adesione delle cellule candidate vengono trasfette in cellule HEK293T. In condizioni fisiologiche, le cellule HEK293T non mostrano auto-aggregazione, rendendole modelli esemplari per questo saggio. Tuttavia, quando vengono combinate singole popolazioni di cellule HEK che esprimono recettore e ligando, il legame del recettore e del ligando forza l'aggregazione delle cellule HEK. Questa aggregazione è mediata esclusivamente da interazioni trans ed è solitamente osservabile in decine di minuti. Non sono necessari passaggi di purificazione delle proteine in questo metodo, e l'efficienza del metodo si basa sul paradigma che le popolazioni di cellule HEK che esprimono molecole di adesione affini vengono combinate e quindi immaginiate solo decine di minuti dopo. Inoltre, questo metodo è relativamente economico, in quanto non sono necessari né anticorpi né attrezzature costose. L'unica apparecchiatura necessaria per l'acquisizione dei dati è un microscopio fluorescente standard. Un ulteriore vantaggio di questo saggio basato sulle cellule è la capacità di migliorare rapidamente l'effetto delle mutazioni puntili rilevanti della malattia sulle interazioni trans. Questo può essere eseguito trasfettando le cellule HEK con cDNA delle varianti mutanti della proteina di interesse.
In questo protocollo, presentiamo un esempio in cui studiamo se una mutazione missense in Neurexin3α (Neurexin3αA687T), identificata in un paziente a cui è stata diagnosticata una profonda disabilità intellettiva ed epilessia, altera le interazioni in trans con la proteina transmembrana ripetuta ricca di leucina 2 (LRRTM2). Neurexin3α è un membro della famiglia evolutivamente conservata di molecole di adesione cellulare presinaptica e mentre recenti lavori hanno identificato molteplici ruoli alla sinapsi3,4, 5,6,7, la nostra comprensione sinaptica di questa molecola e di tutti i membri della famiglia delle neuressine rimane incompleta. LRRTM2 è una proteina di adesione a cellule postsinaptiche eccitatorie che partecipa alla formazione e al mantenimento della sinapsi8,9,10. È importante sottolineare che LRRTM2 interagisce esclusivamente con le isoforme di neurexina che mancano dell'esone alternativo del sito di giunzione 4 (SS4-) ma non con isoforme di neuresina contenenti l'esone alternativo del sito di giunzione 4 (SS4+). La mutazione del missense umano (A687T) identificata in Neurexin3α si trova in una regione extracellulare non studiato che è conservata evolutivamente e viene conservata tra tutte le neuressine alfa7. Poiché l'interazione tra queste due molecoleè stata stabilita 8,9,11, abbiamo posto la domanda: la capacità di legame di Neurexin3α SS4- a LRRTM2 è alterata da una mutazione puntile A687T? Questo saggio ha rivelato che la mutazione del punto A687T ha inaspettatamente migliorato l'aggregazione di Neurexin3α a LRRTM2 suggerendo che la regione extracellulare in cui si trova la mutazione puntile, gioca un ruolo nella mediazione delle interazioni transsinattiche.

<table><tbody><tr><td>Microprovette monouso da 1,5 mL con tappi a scatto VWR</td><td></td><td>89000-028</td><td>Incubazione di una popolazione mista di cellule HEK</td></tr><tr><td>1000 mL Rapid&mdash; Unità di filtraggio del flusso, membrana aPES da 0,2 um</td><td>Thermo Fisher</td><td>567-0020</td><td>Sterilizzazione di terreni HEK</td></tr><tr><td>Provette per centrifuga SpectraTube da 15 mL</td><td>Ward' s Science</td><td>470224-998</td><td>Raccolta di cellule HEK</td></tr><tr><td>Piastre di coltura tissutale sterili a 6 pozzetti</td><td>VWR</td><td>100062-892</td><td>Coltura di cellule HEK</td></tr><tr><td>Cloruro di calcio</td><td>Sigma</td><td>223506-500G</td><td>Trasfezione di fosfato di calcio, risospensione cellulare HEK</td></tr><tr><td>Centrifuga - Sorvall Legend RT</td><td>Kendro Laboratory Products</td><td>75004377</td><td>Raccolta di cellule HEK</td></tr><tr><td>Incubatore</td> <td>di cellule CO2Thermo Scientific</td><td>HERACELL 150i</td><td>Incubazione di cellule HEK durante la crescita</td></tr><tr><td>DMEM, 1x (Dulbecco's Modification of Eagle's Medium) con 4,5 g/L di glucosio, L-glutammina e piruvato di sodio</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td>HEK cell maintenance</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Soluzione salina tamponata con fosfato PBS (1X)</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>Passaging/raccolta di cellule HEK</td></tr><tr><td>Acido etilendiamminotetraacetico</td><td>Sigma</td><td>ED-500G</td><td>Raccolta di cellule HEK</td></tr><tr><td>Falcon Fiasche di coltura ventilate, area di crescita di 75cm2</td><td>Corning</td><td>9381M26</td><td>Coltura di cellule HEK</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Sigma</td><td>17L184</td><td>Mantenimento</td></tr> <tr>delle cellule HEK<td>HEK293T cellule</td><td>ATCC</td><td></td><td>Sistema modello</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>V: 2.0.0-rc-69/1.52p</td><td>Analisi delle immagini</td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio esaidrato</td><td>Sigma</td><td>M9272-500G</td><td>Risospensione cellulare HEK</td></tr><tr><td>Fosfato di sodio bibasico anidro</td> Fisher <td>BioReagents</td><td>BP332-500</td><td>Trasfezione del fosfato di calcio</td></tr><tr><td>Tripsina 0,25% (1X) Soluzione</td><td>GE Healthcare Life Scienze</td><td>SH30042.01</td><td>Cellule HEK passanti</td></tr><tr><td>Rotatore</td><td></td><td></td><td>del tubo Incubazione di una popolazione mista di cellule HEK</td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio UltraClear. Bianco Smerigliato, Carica Positiva</td><td>Denville Scientific Inc.</td><td>M1021</td><td>Acquisizione immagini</td></tr><tr><td>Microscopio a campo largo</td><td>Zeiss</td><td>Axio Vert 200M</td><td>Acquisizione immagini</td></tr></tbody></table>

misurare le interazioni transcellulari attraverso l'aggregazione proteica in un sistema di cellule eterologi

Measuring Transcellular Interactions through Protein Aggregation in a Heterologous Cell System

Le interazioni proteiche alle interfacce cellulari impongono una moltitudine di risultati biologici che vanno dallo sviluppo dei tessuti e dalla progressione del cancro alla formazione e al mantenimento della sinapsi. Molte di queste interazioni fondamentali si verificano in trans e sono tipicamente indotte da interazioni eterofile o omofile tra cellule che esprimono coppie di legame ancorate a membrana. Chiarire come le mutazioni rilevanti della malattia interrompano queste interazioni proteiche fondamentali può fornire informazioni su una miriade di campi della biologia cellulare. Molti test di interazione proteina-proteina in genere non disambiguano tra cis e interazioni trans, il che potenzialmente porta a una sopravvalutazione dell'estensione di legame che si sta verificando in vivo e comporta una purificazione intensiva del lavoro delle proteine e / o apparecchiature di monitoraggio specializzate. Qui presentiamo un semplice protocollo ottimizzato che consente l'osservazione e la quantificazione di solo interazioni trans senza la necessità di lunghe purificazione proteica o attrezzature specializzate. Il saggio di aggregazione cellulare HEK prevede la miscelazione di due popolazioni indipendenti di cellule HEK, ognuna delle quali esprime ligandi affini legati alla membrana. Dopo un breve periodo di incubazione, i campioni vengono immagine e gli aggregati risultanti vengono quantificati.

La mutazione A687T aumenta Neurexin3α SS4- legando a LRRTM27 Per indagare come le interazioni intercellulari di due proteine sinaptiche note siano influenzate dall'introduzione di una mutazione puntile riscontrata in un paziente con disabilità intellettiva ed epilessia, abbiamo usato il suddetto saggio di aggregazione cellulare HEK (Figura 1). Le cellule sono state trasfette secondo la sezione 1 e preparate per l'imaging secondo le sezioni 1 e 2 del protocollo....

Qui presentiamo un protocollo ottimizzato per misurare rapidamente e semiquantitativamente le interazioni ligando-recettore in trans in un sistema cellulare eterologo utilizzando la microscopia a fluorescenza.

Misurare le interazioni transcellulari attraverso l'aggregazione proteica in un sistema di cellule eterologi

Protein interactions at cellular interfaces dictate a multitude of biological outcomes ranging from tissue development and cancer progression to synapse ...

Il test basato su cellule consente l'osservazione e la quantificazione delle interazioni di transadesione senza la necessità di lunghe purificazioni proteiche o di attrezzature specializzate. Sebbene le interazioni proteiche qui testate siano rilevanti per la neurobiologia, questo metodo può essere applicato a qualsiasi area di ricerca in cui l'adesione proteica si verifica a livello intercellulare. 48 ore dopo la trasfezione delle cellule HEK-293T, raccogliere le cellule dalla piastra a sei pozzetti per l'aggregazione.Per prima cosa, lava ogni pozzetto due volte con PBS. Successivamente, per dissociare delicatamente le cellule, aggiungere un millilitro di EDTA da 10 millimolari a ciascun pozzetto, quindi incubare la piastra a 37 gradi Celsius. Dopo cinque minuti di incubazione, picchiettare delicatamente la piastra per staccare le cellule e raccoglierle in una provetta conica separata da 15 millilitri.Centrifugare le provette a 500 x g a temperatura ambiente per cinque minuti. Mentre le cellule vengono pellettate, preparare sei provette di incubazione etichettando la parte superiore delle provette per microcentrifuga con le condizioni sperimentali. Deve essere utilizzata ogni permutazione di GFP e mCherry.Rimuovere il surnatante dalle provette coniche da 15 millilitri e risospendere le cellule in 500 microlitri di terreno. Utilizzando un emocitometro, contare le cellule in ciascuna provetta conica. Quindi aliquotare 200.000 cellule di ciascuna condizione nella provetta di incubazione appropriata per una miscela uno a uno in un volume totale di 500 microlitri.Dopo aver valutato l'aggregazione basale descritta nella sezione successiva, posizionare le provette di incubazione in un rotatore lento di provette a temperatura ambiente. Per valutare l'aggregazione, al basale e di nuovo dopo 60 minuti, pipettare 40 microlitri dalla provetta di incubazione su un vetrino da microscopio carico. L'acquisizione di base deve essere effettuata il più rapidamente possibile dopo l'aggiunta delle cellule alla provetta per microcentrifuga.Visualizzare il vetrino sotto fluorescenza in entrambi i canali verde e rosso. Per ogni diapositiva, acquisisci immagini di tre diversi campi visivi su un piano focale. Le cellule HEK-293T sono state trasfettate con una proteina di interesse, una proteina mutata di interesse o un ligando di interesse e co-trasfettate con una proteina fluorescente.Le popolazioni cellulari che esprimono la proteina di interesse sono state mescolate con le popolazioni cellulari che esprimono il ligando di interesse e valutate per l'aggregazione dopo 60 minuti. Nelle sovrapposizioni di immagini acquisite nei canali verde e rosso, l'aggregazione viene visualizzata come punti gialli. Le condizioni in cui le cellule non esprimevano alcun ligando sinaptico hanno mostrato un'aggregazione minima.Inoltre, l'aggregazione minima è stata mostrata quando solo una delle due popolazioni esprimeva ligandi sinaptici. Non è stata mostrata alcuna aggregazione quando le due popolazioni di cellule esprimevano molecole di adesione incompatibili. Le condizioni con molecole di adesione compatibili hanno mostrato un'aggregazione significativa dopo un'incubazione di 60 minuti.Sorprendentemente, la proteina mutata di interesse ha mostrato un'aggregazione significativamente maggiore rispetto alla sua controparte wild-type, suggerendo che la mutazione puntiforme migliora le capacità di legame delle proteine. Le mutazioni in molte molecole di adesione sono comunemente collegate a disturbi dello sviluppo neurologico, neuropsichiatrico e delle dipendenze. Con questa tecnica, è possibile esaminare gli effetti delle mutazioni puntiformi rilevanti per la malattia sulle interazioni trans.

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In questo video, dimostriamo un saggio di aggregazione proteica basato su cellule utilizzando inibitori del proteasoma, che bloccano l'attività del proteasoma, impedendo alle proteine mutanti mal ripiegate, fuse in un'etichetta fluorescente, di subire la degradazione del proteasoma ubiquitina-dipendente, portando al loro accumulo all'interno del citoplasma cellulare. Gli aggregati proteici vengono quindi visualizzati e quantificati mediante microscopia a fluorescenza.

Saggio di formazione di aggregati proteici: un metodo per rilevare e quantificare l'aggregazione proteica in cellule coltivate dopo induzione da parte dell'inibitore del proteasoma

In questo video, dimostriamo la tecnica per misurare le interazioni transcellulari tra le molecole di adesione delle cellule sinaptiche attraverso il saggio di aggregazione cellulare HEK. In questo saggio, un numero uguale di cellule HEK che esprimono una molecola di adesione cellulare presinaptica desiderata e una proteina fluorescente vengono mescolate con cellule HEK che esprimono una molecola di adesione cellulare post-sinaptica e un'altra proteina fluorescente. L'interazione tra le...

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L'oligomerizzazione del recettore della rianodina, un canale ionico omo-tetramerico che media il rilascio di Ca2+ dai depositi intracellulari, è fondamentale per la contrazione del muscolo scheletrico e cardiaco. Qui, presentiamo metodi complementari in vivo e in vitro per rilevare l'autoassociazione proteica e determinare la stechiometria omo-oligomera.

Approcci genetici e biochimici per<em&gt; In Vivo</em&gt; e<em&gt; In Vitro</em&gt; La valutazione di proteine ​​Oligomerizzazione: Il rianodina Receptor Case Study

Questo protocollo descrive un approccio di basato su spettroscopia di fluorescenza fluttuazione per indagare le interazioni tra proteine che mediano interazioni cellula-cellula, cioè proteine localizzate nelle giunzioni delle cellule, direttamente nelle cellule viventi. Forniamo le linee guida dettagliate sulla calibrazione dello strumento, acquisizione dati e analisi, comprese le correzioni al fonti possibili manufatto.

Un'analisi di spettroscopia di fluorescenza fluttuazione delle interazioni proteina-proteina a contatti cellula-cellula

Le proteine Cognate J-domain cooperano con l'accompagnatore Hsp70 per assistere in una miriade di processi biologici che vanno dal ripiegamento proteico alla degradazione. Qui, descriviamo un analisi di legatura di prossimità in situ, che consente il monitoraggio di questi macchinari chaperone tradotti transitoriamente in cellule batteriche, lieviti e umane.

Monitoraggio in Situ di gruppi di chaperone molecolari formati in farmaci, lieviti e cellule umane

Qui, viene presentato un metodo per l'analisi della cinetica di aggregazione proteica nel nematode Caenorhabditis elegans. Gli animali di una popolazione sincronizzata con l'età vengono ripresi in diversi punti temporali, seguiti dal conteggio dell'inclusione semiautomatica in CellProfiler e dall'adattamento a un modello matematico in AmyloFit.

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Qui, descriviamo un metodo per la co-espressione batterica di proteine marcate differenzialmente utilizzando un insieme di vettori compatibili, seguito dalle tecniche convenzionali di pulldown per studiare complessi proteici che non possono assemblarsi in vitro.

Saggio di pulldown accoppiato con co-espressione in cellule batteriche come strumento efficiente in termini di tempo per testare interazioni proteina-proteina impegnative

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Misura a singola molecola delle dinamiche di interazione proteica all'interno di condensati biomolecolari

Scopri un protocollo ottimizzato per misurare rapidamente le interazioni ligando-recettore in trans mediante microscopia a fluorescenza in cellule HEK-293T. Questo metodo permette di quantificare le interazioni di adesione proteica rilevanti per la neurobiologia.

Misurare le interazioni transcellulari attraverso l'aggregazione proteica in un sistema di cellule eterologi

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