Misurare le interazioni transcellulari attraverso l'aggregazione proteica in un sistema di cellule eterologi
22 maggio 2020
Qui presentiamo un protocollo ottimizzato per misurare rapidamente e semiquantitativamente le interazioni ligando-recettore in trans in un sistema cellulare eterologo utilizzando la microscopia a fluorescenza.
Il test basato su cellule consente l'osservazione e la quantificazione delle interazioni di transadesione senza la necessità di lunghe purificazioni proteiche o di attrezzature specializzate. Sebbene le interazioni proteiche qui testate siano rilevanti per la neurobiologia, questo metodo può essere applicato a qualsiasi area di ricerca in cui l'adesione proteica si verifica a livello intercellulare. 48 ore dopo la trasfezione delle cellule HEK-293T, raccogliere le cellule dalla piastra a sei pozzetti per l'aggregazione.
Per prima cosa, lava ogni pozzetto due volte con PBS. Successivamente, per dissociare delicatamente le cellule, aggiungere un millilitro di EDTA da 10 millimolari a ciascun pozzetto, quindi incubare la piastra a 37 gradi Celsius. Dopo cinque minuti di incubazione, picchiettare delicatamente la piastra per staccare le cellule e raccoglierle in una provetta conica separata da 15 millilitri.
Centrifugare le provette a 500 x g a temperatura ambiente per cinque minuti. Mentre le cellule vengono pellettate, preparare sei provette di incubazione etichettando la parte superiore delle provette per microcentrifuga con le condizioni sperimentali. Deve essere utilizzata ogni permutazione di GFP e mCherry.
Rimuovere il surnatante dalle provette coniche da 15 millilitri e risospendere le cellule in 500 microlitri di terreno. Utilizzando un emocitometro, contare le cellule in ciascuna provetta conica. Quindi aliquotare 200.000 cellule di ciascuna condizione nella provetta di incubazione appropriata per una miscela uno a uno in un volume totale di 500 microlitri.
Dopo aver valutato l'aggregazione basale descritta nella sezione successiva, posizionare le provette di incubazione in un rotatore lento di provette a temperatura ambiente. Per valutare l'aggregazione, al basale e di nuovo dopo 60 minuti, pipettare 40 microlitri dalla provetta di incubazione su un vetrino da microscopio carico. L'acquisizione di base deve essere effettuata il più rapidamente possibile dopo l'aggiunta delle cellule alla provetta per microcentrifuga.
Visualizzare il vetrino sotto fluorescenza in entrambi i canali verde e rosso. Per ogni diapositiva, acquisisci immagini di tre diversi campi visivi su un piano focale. Le cellule HEK-293T sono state trasfettate con una proteina di interesse, una proteina mutata di interesse o un ligando di interesse e co-trasfettate con una proteina fluorescente.
Le popolazioni cellulari che esprimono la proteina di interesse sono state mescolate con le popolazioni cellulari che esprimono il ligando di interesse e valutate per l'aggregazione dopo 60 minuti. Nelle sovrapposizioni di immagini acquisite nei canali verde e rosso, l'aggregazione viene visualizzata come punti gialli. Le condizioni in cui le cellule non esprimevano alcun ligando sinaptico hanno mostrato un'aggregazione minima.
Inoltre, l'aggregazione minima è stata mostrata quando solo una delle due popolazioni esprimeva ligandi sinaptici. Non è stata mostrata alcuna aggregazione quando le due popolazioni di cellule esprimevano molecole di adesione incompatibili. Le condizioni con molecole di adesione compatibili hanno mostrato un'aggregazione significativa dopo un'incubazione di 60 minuti.
Sorprendentemente, la proteina mutata di interesse ha mostrato un'aggregazione significativamente maggiore rispetto alla sua controparte wild-type, suggerendo che la mutazione puntiforme migliora le capacità di legame delle proteine. Le mutazioni in molte molecole di adesione sono comunemente collegate a disturbi dello sviluppo neurologico, neuropsichiatrico e delle dipendenze. Con questa tecnica, è possibile esaminare gli effetti delle mutazioni puntiformi rilevanti per la malattia sulle interazioni trans.
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Panoramica
Questo studio presenta un protocollo ottimizzato per misurare rapidamente e semiquantitativamente le interazioni ligando-recettore in trans, utilizzando un approccio di microscopia a fluorescenza in cellule HEK-293T. Il metodo consente la quantificazione delle interazioni di adesione proteica rilevanti per la neurobiologia e potenzialmente altre aree di ricerca.
Componenti chiave dello studio
Area di scienza
- Neurobiologia
- Adesione cellulare
- Interazioni proteiche
Sfondo
- Le interazioni ligando-recettore sono critiche per la comunicazione cellulare.
- Comprendere queste interazioni aiuta a chiarire i meccanismi dei disturbi neurosviluppali e neuropsichiatrici.
- I metodi tradizionali possono richiedere un'estesa purificazione delle proteine o attrezzature specializzate.
- Questo studio propone un approccio più efficiente utilizzando la microscopia a fluorescenza.
Obiettivo dello studio
- Sviluppare un protocollo rapido ed efficace per studiare l'adesione proteica in un saggio basato su cellule.
- Valutare come le mutazioni puntiformi nelle proteine influenzano le interazioni in trans.
- Applicare questo metodo ampiamente negli studi di adesione proteica al di fuori della neurobiologia.
Metodi utilizzati
- La microscopia a fluorescenza è stata impiegata per l'imaging delle interazioni cellulari.
- Le cellule HEK-293T sono state utilizzate come modello biologico, concentrandosi sulle proteine trasfettate e sui ligandi.
- La tempistica sperimentale ha coinvolto la valutazione dell'aggregazione cellulare dopo 60 minuti dalla trasfezione.
- Il conteggio delle cellule è stato eseguito utilizzando un ematometro, seguito dalla ri-sospensione cellulare e miscelazione per l'imaging.
Principali risultati
- L'aggregazione delle cellule che esprimono molecole di adesione compatibili è stata significativamente migliorata dopo 60 minuti.
- Le proteine mutanti hanno mostrato una maggiore aggregazione rispetto alle controparti di tipo selvatico, indicando capacità di legame migliorate.
- Si è osservata un'aggregazione minima quando nessuna o solo una popolazione esprimeva ligandi sinaptici.
Conclusioni
- Questo studio dimostra un metodo semplificato per valutare le interazioni adesive intercellulari.
- I risultati evidenziano il potenziale di questa tecnica nell'esplorare gli effetti delle mutazioni sulle interazioni proteiche.
- Le intuizioni di questo metodo sono preziose per comprendere i meccanismi alla base di vari disturbi neurosviluppali e psicologici.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
This assay enables direct measurement of trans protein-protein interactions in a cellular context, addressing a key limitation of biochemical assays that cannot distinguish cis from trans binding. By quantifying only physiologically relevant intercellular adhesion, the method improves target validation confidence and reduces false positives in early discovery. It supports mechanistic de-risking of adhesion targets implicated in neurodevelopmental and neuropsychiatric disorders.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by measuring functional trans adhesion between ligand and receptor pairs expressed on separate cells.
- Operational Value: Eliminates need for protein purification, enabling rapid screening of mutants or variants directly in a cellular system.
- Predictive Value: Enhanced aggregation with a disease-linked mutation demonstrates how the assay can identify gain-of-function variants for prioritization.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Uses fluorescently tagged HEK cells to generate quantifiable imaging readouts (e.g., yellow puncta in overlays) for high-content screening adaptation.
- Reproducibility: Standardized cell mixing and incubation conditions allow consistent aggregation measurements across experiments.
- Scalability: Protocol supports testing multiple conditions (e.g., wild-type vs. mutant, ligand combinations) in parallel using simple mixing and imaging steps.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Directly tests how point mutations in adhesion molecules—common in neurodevelopmental, neuropsychiatric, and addiction disorders—affect trans interactions.
- Translational Continuity: Bridges in vitro binding assays to cellular phenotypes, supporting go/no-go decisions based on functional adhesion data.
- Mechanistic De-risking: Identifies whether mutations enhance or disrupt intercellular binding, informing target mechanism and safety profiling.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits between target engagement screening and functional validation, providing adhesion-specific data to inform lead optimization and preclinical candidate selection.
- Discovery Biology: Tests whether genetic variants alter intercellular adhesion, supporting pathway clarification and target hypothesis validation.
- Analytics: Generates quantitative imaging-based readouts (aggregate formation over time) to compare conditions and assess interaction strength.
- Translational Research: Links molecular changes to cellular phenotypes relevant to synapse formation and neuronal connectivity.
- Enterprise Reuse: Adaptable to any intercellular protein adhesion system, making it a reusable platform across therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Measures only trans interactions, reducing overestimation of binding seen in lysate-based assays and improving target specificity.
- Operational Value: Uses standard cell culture and fluorescence microscopy, requiring no specialized equipment or complex reagents.
- Strategic Value: Enables rapid assessment of mutation effects on target function, supporting better go/no-go decisions in lead identification.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying variants with altered adhesion that may influence efficacy or toxicity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mammalian cell transfection, fluorescent protein tagging, and flow cytometry or hemocytometer-based cell counting.
- Dependent on fluorescence microscopy with dual-channel imaging capability (e.g., GFP and mCherry) and image analysis tools for aggregate quantification.
- Needs standardization of cell expression levels and mixing ratios to ensure reproducible aggregation readouts across teams.
- Adaptation to non-HEK systems may require optimization of transfection efficiency and adhesion molecule surface expression.
- Limited to assessing adhesion; does not report on downstream signaling or internalization events following binding.
