Name: Saggio di pulldown accoppiato con co-espressione in cellule batteriche come strumento efficiente in termini di tempo per testare interazioni proteina-proteina impegnative (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Scopri il saggio di pulldown accoppiato con co-espressione in Escherichia coli per studiare interazioni proteina-proteina impegnative. Questo metodo efficiente permette di analizzare complessi proteici che richiedono co-espressione per l'assemblaggio.

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Questo lavoro è stato sostenuto dai progetti della Russian Science Foundation 19-74-30026 (sviluppo e convalida del metodo) e 19-74-10099 (saggi di interazione proteina-proteina); e dal Ministero della Scienza e dell'Istruzione Superiore della Federazione Russa-grant 075-15-2019-1661 (analisi delle interazioni rappresentative proteina-proteina).

La rappresentazione schematica del flusso di lavoro del metodo è illustrata nella Figura 1.
1. Co-trasformazione di E. coli
<ol><li>Preparare vettori di espressione per proteine bersaglio utilizzando metodi di clonazione standard. NOTA: Tipicamente, un buon punto di partenza è quello di utilizzare vettori pGEX/pMAL convenzionali che portano un gene di resistenza all'ampicillina e l'origine ColE1 per l'espressione di proteine marcate con GST / MBP e un vettore compatibile con origine p15A o RSF e resistenza alla kanamicina per esprimere proteine marcate con 6xHis, in alcuni casi combinate con tioredossina o SUMO-tag per aumentare la solubilità. Di solito, diverse combinazioni di tag devono essere testate prima dell'esperimento. Il metodo descritto è conveniente per testare in batch le condizioni di espressione delle proteine bersaglio. È importante notare che la maggior parte dei ceppi di Rosetta contiene già il plasmide con origine p15A per esprimere i tRNA per il codone raro, quindi se l'uso di tali ceppi è una possibile opzione, i plasmidi p15A dovrebbero essere evitati. Vedere la tabella dei materiali per i dettagli.<ol><li>Coltivare batteri di un ceppo appropriato in mezzi di Luria-Bertani (LB) a 37 °C fino a una densità ottica (OD) di 0,1-0,2. Il ceppo BL21 (DE3) è stato utilizzato come esempio in questo studio. NOTA: Si raccomanda di utilizzare cellule competenti appena preparate per ottenere una co-trasformazione efficiente con due vettori. Se più di due vettori devono essere co-trasformati, è meglio trasformarli sequenzialmente per ottenere una buona efficienza di trasformazione. L'elettroporazione è una buona alternativa.</li>
		<li>Centrifugare 1,0 mL della sospensione batterica per 1 minuto a 9.000 x g a 4 °C ed eliminare il surnatante.</li>
		<li>Aggiungere 0,5 mL di tampone di trasformazione del tampone ghiacciato (TB) (10 mM MOPS [pH 6,7], 250 mM KCl, 55 mM MnCl 2 e 15 mM CaCl2) e incubare per 10 minuti su ghiaccio.</li>
		<li>Centrifugare per 30 s a 8.000 x g a 4 °C ed eliminare il surnatante.</li>
		<li>Aggiungere 100 μL di tampone TB, aggiungere 100 ng di ciascun vettore e incubare per 30 minuti su ghiaccio. Trasformare separatamente singoli vettori per studiare il comportamento delle proteine senza co-espressione. Inoltre, co-trasformare i vettori di espressione in coppie con vettori di co-espressione vuoti per controlli di associazione non specifici. NOTA: Negli esempi forniti in questo studio, i vettori pGEX/pMAL con corrispondenti cDNA fusi a cDNA GST/MBP sono stati utilizzati in combinazione con vettori derivati da pACYC compatibili recanti domini proteici partner codificanti cDNA fusi con cDNA tioredossina.</li>
		<li>Riscaldare a 42 °C per 150 s, quindi raffreddare per 1 minuto su ghiaccio.</li>
		<li>Aggiungere 1 mL di liquido LB senza antibiotici e incubare a 37 °C per 90 minuti. Piastra su piastre di agar LB contenenti 0,5% di glucosio e corrispondenti antibiotici (le concentrazioni comuni sono: 50 mg/L di ampicillina; 20 mg/L di kanamicina; 50 mg/L di streptomicina; 35 mg/L di cloramfenicolo). Incubare le piastre per una notte a 37 °C.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Espressione
<ol><li>Lavare le cellule dalla piastra con 2 ml di media LB liquido in 50 ml di media LB con antibiotici corrispondenti (concentrazioni comuni sono: 50 mg / L di ampicillina; 20 mg / L di kanamicina; 50 mg / L di streptomicina; 35 mg / L di cloramfenicolo). Aggiungere ioni metallici o altri cofattori noti (negli esempi forniti in questo studio, 0,2 mM ZnCl2 è stato aggiunto al supporto). Conservare un'aliquota con glicerolo al 20% a -70 °C per una successiva ripetizione dell'esperimento. NOTA: Si raccomanda di lavare diverse colonie direttamente dalla piastra per escludere la possibilità di cattiva espressione in un singolo clone isolato a causa di eventi occasionali di ricombinazione tra due plasmidi.</li>
	<li>Far crescere le cellule con una rotazione costante di 220 rpm a 37 °C a un OD di 0,5-0,7, raffreddare a temperatura ambiente (RT) e aggiungere isopropil β-D-1-tiogalattopyranoside (IPTG) a 1 mM. Conservare un'aliquota di 20 μL di sospensione cellulare come controllo del campione non indotto.</li>
	<li>Incubare le cellule con una rotazione costante di 220 rpm a 18 °C durante la notte. NOTA: Il tempo e la temperatura ottimali di incubazione possono variare; 18 °C durante la notte funziona meglio per la maggior parte delle proteine e si consiglia di provare di default. Ridurre il tempo di incubazione a 2-3 ore se si osserva un forte legame non specifico.</li>
	<li>Dividere la sospensione batterica in due parti (o più se sono stati utilizzati più di due tag diversi) e conservare un'aliquota di 20 μL della sospensione cellulare per confermare l'espressione proteica. Centrifugare a 4.000 x g per 15 min. NOTA: Punto di pausa: i pellet batterici possono essere conservati a -70 °C per almeno 6 mesi.</li>
</ol>3. Saggio di pulldown
NOTA: Le procedure dettagliate sono descritte per le proteine marcate con 6xHis o MBP/GST. Tutte le procedure vengono eseguite a 4°C.
<ol><li>Risospendere i pellet batterici in 1 mL di tampone di lisi ghiacciato con inibitori della proteasi e agenti riducenti (vedi sotto) aggiunti immediatamente prima dell'esperimento. Evitare il ditiotreitolo (DTT) quando si utilizzano resine chelanti dei metalli poiché elimina gli ioni metallici. Regolare la composizione del tampone per le proteine testate. Le ricette comuni di tamponi di lisi trovati adatti per la maggior parte delle proteine sono:<ol><li>6xHis-pulldown: Miscelare 30 mM HEPES (pH 7,5), 400 mM NaCl, 10 mM Imidazolo, 0,1% NP40, 10% [p/p] glicerolo, 5 mM beta-mercaptoetanolo, 1 mM fenilmetilsfulfonilfluoruro (PMSF) e una diluizione 1:1.000 del cocktail inibitore della proteasi (vedere Tabella dei materiali).</li>
		<li>GST o MBP-pulldown: miscelare 20 mM Tris (pH 7,5 a 25 °C), 150 mM NaCl, 10 mM KCl, 10 mM MgCl 2, 0,1 mM ZnCl2, 0,1% NP40, 10% [p/p] glicerolo, 5 mM DTT, 1 mM PMSF e una diluizione 1:1.000 del cocktail inibitore della proteasi (vedere Tabella dei materiali).</li>
	</ol></li>
	<li>Interrompere le cellule con la sonicazione sul ghiaccio. Conservare un'aliquota di 20 μl per l'elettroforesi. NOTA: In genere, sono necessari 20-25 impulsi di 5 s con intervalli di 15 s con una potenza di uscita di 20 W per campione. La potenza di sonicazione appropriata deve essere regolata per ogni strumento per evitare il surriscaldamento e garantire la totale interruzione della cella. Per ottenere prestazioni migliori, si consiglia vivamente di utilizzare sonde sonicator multi-tip ad alta produttività.</li>
	<li>Centrifugare a 20.000 x g per 30 min. Raccogliere 20 μL di lisato chiarificato per la successiva analisi SDS-PAGE.</li>
	<li>Equilibrare la resina (50 μL per ciascun campione) con 1 mL di tampone di lisi ghiacciato per 10 minuti, centrifugare a 2.000 x g per 30 s ed eliminare il surnatante.</li>
	<li>Aggiungere lisati cellulari (concentrazione proteica totale: 20-50 mg/ml) alla resina, incubare per 10 minuti a rotazione costante di 15 giri/min, centrifugare a 2.000 x g per 30 s ed eliminare il surnatante. Raccogliere 20 μL della frazione non legata per la successiva analisi SDS-PAGE.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di tampone di lavaggio ghiacciato e incubare per 1 minuto. Centrifugare a 2.000 x g per 30 s ed eliminare il surnatante. Le ricette comuni per i tamponi di lavaggio sono:<ol><li>6xHis-pulldown: mescolare 30 mM HEPES (pH 7,5), 400 mM NaCl, 30 mM Imidazolo, 0,1% NP40, 10% [p/p] glicerolo e 5 mM beta-mercaptoetanolo.</li>
		<li>GST o MBP-pulldown: miscelare 20 mM Tris (pH 7,5 a 25 °C), 500 mM NaCl, 10 mM KCl, 10 mM MgCl 2, 0,1 mM ZnCl2, 0,1% NP40, 10% [p/p] glicerolo e 5 mM DTT.</li>
	</ol></li>
	<li>Eseguire due lavaggi lunghi: aggiungere 1 mL di tampone di lavaggio ghiacciato, incubare per 10-30 minuti con una rotazione costante di 15 giri/min, centrifugare a 2.000 x g per 30 s e scartare il surnatante.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di tampone di lavaggio ghiacciato, incubare per 1 minuto, centrifugare a 2.000 x g per 30 s ed eliminare il surnatante.</li>
	<li>Eluire le proteine legate con 50 μL del tampone di eluizione in uno shaker a 1.200 rpm per 10 minuti. Le ricette comuni dei tamponi di eluizione sono:<ol><li>6xHis-pulldown: mescolare 30 mM HEPES (pH 7,5), 400 mM NaCl, 300 mM Imidazolo e 5 mM beta-mercaptoetanolo.</li>
		<li>GST pulldown: 20 mM Tris (pH 7,5 a 25 °C), 150 mM NaCl, 50 mM Glutatione (regolato a pH 7,5 con Tris basico) e 5 mM DTT.</li>
		<li>MBP-pulldown: Miscelare 20 mM Tris (pH 7,5 a 25 °C), 150 mM NaCl, 40 mM di maltosio e 5 mM DTT.</li>
	</ol></li>
	<li>Analizzare le proteine eluite con SDS-PAGE. NOTA: La percentuale di acrilammide deve essere adattata alla dimensione delle proteine. Negli esempi forniti in questo studio, sono stati utilizzati gel di acrilammide al 12%, funzionanti in tampone tris-glicina-SDS (2 mM Tris, 250 mM Glycine, 0,1% SDS) a tensione costante di 180 V. I gel sono stati colorati mediante ebollizione in 0,2% di blu Coomassie R250, acido acetico al 10% e isopropanolo al 30% e decolorati mediante ebollizione in acido acetico al 10%. La quantità di proteine caricate non dovrebbe essere uguale, poiché varie quantità di proteine interagenti possono essere abbattute in diversi esperimenti.</li>
</ol>

<ol><li>Louche, A., Salcedo, S. P., Bigot, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-protein+interactions%3A+Pulldown+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein-protein interactions: Pulldown assays.</a> Methods in Molecular Biology. 1615, 247-255 (2017).</li>
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<li>Kohler, A., Zimmerman, E., Schneider, M., Hurt, E., Zheng, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+assembly+and+activation+of+the+heterotetrameric+SAGA+histone+H2B+deubiquitinase+module%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Structural basis for assembly and activation of the heterotetrameric SAGA histone H2B deubiquitinase module.</a> Cell. 141 (4), 606-617 (2010).</li>
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</ol>

Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.

Il metodo descritto consente di testare le interazioni proteina-proteina che non possono essere assemblate in modo efficiente in vitro e richiedono la co-espressione. Il metodo è uno dei pochi approcci adatti per lo studio delle proteine eterodimerizzanti, che sono anche in grado di omodimerizzare poiché, se purificate separatamente, tali proteine formano omodimeri stabili che il più delle volte non possono dissociarsi e riassociarsi durante l'esperimento 3,11...

Il pulldown convenzionale è ampiamente utilizzato per studiare le interazioni proteina-proteina1. Tuttavia, le proteine purificate spesso non interagiscono efficacemente in vitro2,3, e alcune di esse sono insolubili senza il loro partner legante 4,5. Tali proteine potrebbero richiedere l'assemblaggio co-traduzionale o la presenza di chaperoni molecolari 5,6,7,8,9. Un'altra limitazione del pulldown convenzionale è la verifica della possibile attività di eteromultimerizzazione tra domini che possono esistere come omo-oligomeri stabili assemblati co-traduzionalmente 8,10, poiché molti di essi non possono dissociarsi e riassociarsi in vitro durante il tempo di incubazione. La co-espressione è risultata utile per superare tali problemi 3,11. La co-espressione utilizzando vettori compatibili nei batteri è stata utilizzata con successo per purificare grandi complessi macromolecolari multi-subunità, incluso il complesso repressivo policomb PRC212, il modulo testa del mediatore della RNA polimerasi II13, il batteriofago T4 baseplate 14, il modulo di deubiquitinylasi del complesso SAGA 15,16 e la ferritina 17. Le origini di replica comunemente usate per la co-espressione sono ColE1, p15A18, CloDF1319 e RSF20. Nel sistema di espressione Duet disponibile in commercio, queste origini sono combinate con diversi geni di resistenza agli antibiotici e convenienti siti di clonazione multipli per produrre vettori policistroni, consentendo l'espressione di un massimo di otto proteine. Queste origini hanno numeri di copie diversi e possono essere utilizzate in varie combinazioni per raggiungere livelli di espressione equilibrati delle proteine bersaglio21. Per testare le interazioni proteina-proteina, vengono utilizzati vari tag di affinità; i più comuni sono la 6xIstidina, la glutatione-S-transferasi (GST) e la proteina legante il maltosio (MBP), ognuno dei quali ha un'affinità specifica con la resina corrispondente. GST e MBP migliorano anche la solubilità e la stabilità delle proteine marcate22.
Sono stati inoltre sviluppati numerosi metodi che coinvolgono la co-espressione proteica nelle cellule eucariotiche, il più importante dei quali è il saggio a due ibridi di lievito (Y2H)23. Il test Y2H è economico, facile e consente di testare più interazioni; Tuttavia, il completamento del flusso di lavoro richiede più di 1 settimana. Esistono anche alcuni saggi basati su cellule di mammifero meno frequentemente utilizzati, ad esempio il saggio fluorescente a due ibridi (F2H)24 e il saggio di interazione proteina-proteina (CAPPIA)25. Il test F2H è relativamente veloce, consentendo di osservare le interazioni proteiche nel loro ambiente cellulare nativo, ma comporta l'uso di costose apparecchiature di imaging. Tutti questi metodi hanno un vantaggio rispetto all'espressione procariotica che fornisce la traduzione eucariotica nativa e l'ambiente di piegatura; Tuttavia, rilevano l'interazione indirettamente, sia per attivazione trascrizionale che per trasferimento di energia fluorescente, che spesso produce artefatti. Inoltre, le cellule eucariotiche possono contenere altri partner di interazione di proteine di interesse, che possono interferire con il test delle interazioni binarie tra proteine di eucarioti superiori.
Il presente studio descrive un metodo per la co-espressione batterica di proteine marcate in modo differenziale seguito da tecniche convenzionali di pulldown. Il metodo consente di studiare le interazioni tra proteine bersaglio che richiedono co-espressione. È più efficiente in termini di tempo rispetto al pulldown tradizionale, consentendo il test in batch di più obiettivi, il che lo rende vantaggioso nella maggior parte dei casi. La co-espressione usando vettori compatibili è più conveniente della co-espressione policistronica poiché non richiede una laboriosa fase di clonazione.

<table><tbody><tr><td>Sonda a 8 ELEMENTI</td><td>Sonics</td><td>630-0586</td><td>L'alta produttività Sonde sonicatrici a 8 elementi Agar</td></tr><tr><td></td><td>AppliChem</td><td>A0949</td><td></td></tr><tr><td>Resina di amilosio</td><td>New England Biolabs</td><td>E8021</td><td>Resina per la purificazione di proteine marcate con MBP</td></tr><tr><td>Antibiotici</td><td>AppliChem</td><td>A4789 (kanamicina); A0839 (ampicillina)</td><td></td></tr><tr><td>Beta-mercaptoetanolo</td><td>AppliChem</td><td>A1108</td><td></td></tr><tr><td>BL21(DE3)&nbsp;</td><td>Novagen</td><td>69450-M</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>AppliChem</td><td>A4689</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Eppendorf</td><td>5415R (Z605212)</td><td></td></tr><tr><td>Glutatione</td><td>AppliChem</td><td>A9782</td><td></td></tr><tr><td>Glutatione agarosio</td><td>Pierce</td><td>16100</td><td>Resina per la purificazione di proteine marcate</td></tr><tr><td>GST Glycerol</td><td>AppliChem</td><td>A2926</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&nbsp;</td><td>AppliChem</td><td>A3724</td><td></td></tr><tr><td>HisPur Ni-NTA Superflow Agarose</td><td>Thermo Scientific</td><td>25214</td><td>Resina per la purificazione di 6 proteine con tag His-taged</td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>AppliChem</td><td>A1378</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>AppliChem</td><td>A4773</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>AppliChem</td><td>A2939</td><td></td></tr><tr><td>LB</td><td>AppliChem</td><td>414753</td><td></td></tr><tr><td>Maltosio</td><td>AppliChem</td><td>A3891</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>AppliChem</td><td>A2947</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>AppliChem</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>NP40</td><td>Roche</td><td>11754599001</td><td></td></tr><tr><td>pACYCDuet-1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71147</td><td>Vettore per la co-espressione di proteine con origine di replicazione p15A</td></tr><tr><td>pCDFDuet-1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71340</td><td>Vettore per la co-espressione di proteine con origine di replicazione CloDF13</td></tr><tr><td>PMSF</td><td>AppliChem</td><td>A0999</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail di inibitori della proteasi VII</td><td>Calbiochem</td><td>539138</td><td>Cocktail di inibitori della proteasi</td></tr><tr><td>pRSFDuet-1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71341</td><td>Vettore per la co-espressione di proteine con origine di replicazione</td></tr><tr><td>RSF SDS&nbsp;</td><td>AppliChem</td><td>A2263</td><td></td></tr><tr><td>Tris&nbsp;</td><td>Sonicatore AppliChem</td><td>A2264</td><td></td></tr><tr><td>VC505</td><td>Sonics</td><td>CV334</td><td>Processore di liquidi ad ultrasuoni</td></tr><tr><td>ZnCl2</td><td>AppliChem</td><td>A6285</td><td></td></tr></tbody></table>

saggio di pulldown accoppiato con co-espressione in cellule batteriche come strumento efficiente in termini di tempo per testare interazioni proteina-proteina impegnative

Pulldown Assay Coupled with Co-Expression in Bacteria Cells as a Time-Efficient Tool for Testing Challenging Protein-Protein Interactions

Il pulldown è un test di interazione proteina-proteina facile e ampiamente utilizzato. Tuttavia, ha limitazioni nello studio di complessi proteici che non si assemblano efficacemente in vitro. Tali complessi possono richiedere l'assemblaggio co-traduzionale e la presenza di chaperoni molecolari; o formano oligomeri stabili che non possono dissociarsi e riassociarsi in vitro o sono instabili senza un partner legante. Per superare questi problemi, è possibile utilizzare un metodo basato sulla co-espressione batterica di proteine marcate differenzialmente utilizzando un insieme di vettori compatibili seguiti dalle tecniche convenzionali di pulldown. Il flusso di lavoro è più efficiente in termini di tempo rispetto al pulldown tradizionale perché manca delle lunghe fasi di purificazione separata delle proteine interagenti e della loro successiva incubazione. Un altro vantaggio è una maggiore riproducibilità dovuta a un numero significativamente inferiore di passaggi e un periodo di tempo più breve in cui le proteine che esistono all'interno dell'ambiente in vitro sono esposte alla proteolisi e all'ossidazione. Il metodo è stato applicato con successo per studiare una serie di interazioni proteina-proteina quando altre tecniche in vitro sono risultate inadatte. Il metodo può essere utilizzato per testare in batch le interazioni proteina-proteina. Risultati rappresentativi sono mostrati per studi di interazioni tra dominio BTB e proteine intrinsecamente disordinate, e di eterodimeri di domini associati a dita di zinco.

Il metodo descritto è stato utilizzato di routine con molti obiettivi diversi. Presentati qui sono alcuni risultati rappresentativi che probabilmente non possono essere ottenuti utilizzando tecniche di pulldown convenzionali. Il primo è lo studio della dimerizzazione specifica ZAD (Zinc-finger-associated domain)11. Gli ZAD formano dimeri stabili e specifici, con eterodimeri possibili solo tra domini strettamente correlati all'interno di gruppi paraloghi. I dimeri formati da questi domini sono stab...

Qui, descriviamo un metodo per la co-espressione batterica di proteine marcate differenzialmente utilizzando un insieme di vettori compatibili, seguito dalle tecniche convenzionali di pulldown per studiare complessi proteici che non possono assemblarsi in vitro.

Saggio di pulldown accoppiato con co-espressione in cellule batteriche come strumento efficiente in termini di tempo per testare interazioni proteina-proteina impegnative

Pulldown is an easy and widely used protein-protein interaction assay. However, it has limitations in studying protein complexes that do not assemble ...

Questo metodo consente di studiare formazioni di complessi proteici che richiedono co-espressione per campioni di prova efficienti, come la formazione di eterodimeri. Il principale potenziale finale di questo metodo è lo sfruttamento della co-espressione di proteine studiate differenzialmente marcate utilizzando combinazioni di vettori compatibili per promuovere un assemblaggio complesso efficiente, insieme a un flusso di lavoro e una scalabilità efficienti in termini di tempo che consentono un rapido patch-test di interazioni multiple. Questo metodo può essere utilizzato anche per lo screening rapido dell'espressione proteica ottimale e delle condizioni di purificazione.La dimostrazione visiva consente di eseguire correttamente i passaggi critici del protocollo, ad esempio la configurazione della co-espressione, l'interruzione delle celle e le successive fasi di pulldown. Per iniziare, coltiva il ceppo Escherichia coli BL21 (DE3) in Luria-Bertani, o LB, mezzi a 37 gradi Celsius a una densità ottica, o OD, da 0,1 a 0,2. Centrifugare un millilitro della sospensione batterica per un minuto a 9.000 G a quattro gradi Celsius e scartare il surnatante.Quindi, aggiungere 0,5 millilitri di tampone di trasformazione ghiacciato, o TB, e incubare per 10 minuti sul ghiaccio. Alla fine dell'incubazione, centrifugare per 30 secondi a 8.000 G a quattro gradi Celsius e scartare il surnatante. Quindi, aggiungere 100 microlitri di tampone TB, 100 nanogrammi di ciascun vettore e incubare per 30 minuti su ghiaccio.Riscaldare a 42 gradi Celsius per 150 secondi, quindi raffreddare sul ghiaccio per un minuto. Quindi, aggiungere un millilitro di media LB senza antibiotici e incubare a 37 gradi Celsius per 90 minuti. Dopo l'incubazione, centrifugare e risospendere il pellet in 100 microlitri di mezzi LB prima di placcare la sospensione su una piastra di agar LB contenente lo 0,5% di glucosio e antibiotici corrispondenti.Incubare la piastra durante la notte a 37 gradi Celsius. Il giorno seguente, lavare le cellule dalla piastra con due millilitri di mezzi LB in 50 millilitri di media LB con antibiotici corrispondenti. Aggiungere ioni metallici o altri cofattori noti prima di conservare un'aliquota con glicerolo al 20% a meno 70 gradi Celsius per esperimenti successivi.Fai crescere le cellule con una rotazione costante di 220 RPM a 37 gradi Celsius a un OD da 0,5 a 0,7. Raffreddare la coltura a temperatura ambiente e aggiungere IPTG a una concentrazione finale di un millimole. Conservare un'aliquota da 20 microlitri di sospensione cellulare come controllo del campione non indotto.Incubare le cellule durante la notte a 220 RPM a 18 gradi Celsius. Il giorno successivo, dividere la sospensione batterica in due parti e conservare aliquote da 20 microlitri per confermare l'espressione proteica. Centrifugare la sospensione cellulare rimanente a 4.000 G per 15 minuti.Per il test di pulldown, risospendere i pellet in un millilitro di tampone di lisi ghiacciato con inibitori della proteasi e agenti riducenti aggiunti immediatamente prima dell'esperimento. Regolare la composizione del tampone per le proteine testate. Interrompere le cellule mediante sonicazione sul ghiaccio e conservare un'aliquota da 20 microlitri per l'elettroforesi.Centrifugare a 16.000 G per 30 minuti e raccogliere 20 microlitri di lisato chiarificato per elettroforesi. Equilibrare la resina con un millilitro di tampone di lisi ghiacciato per 10 minuti, quindi centrifugare a 2.000 G per 30 secondi e scartare il surnatante. Aggiungere lisati cellulari alla resina e incubare per 10 minuti ad una rotazione costante di 15 RPM.Quindi, centrifugare e scartare il surnatante prima di raccogliere 20 microlitri della frazione non legata per l'analisi. Quindi, aggiungere un millilitro di tampone di lavaggio ghiacciato e incubare per un minuto. Ancora una volta, centrifugare e scartare il surnatante.Quindi, eseguire due lavaggi lunghi con tampone di lavaggio ghiacciato. Dopo il secondo lavaggio, eluire le proteine legate con 50 microlitri di tampone di eluizione in uno shaker a 1.200 RPM a quattro gradi Celsius per 10 minuti. Analizzare le proteine eluite con l'elettroforesi su gel di poliacrilammide SDS.Gli studi sul dominio associato alle dita di zinco, o ZAD, l'omo-dimerizzazione nella proteina legante il maltosio, o MBP, e i saggi di pulldown 6xHistidine sono mostrati qui. La co-espressione di ZAD fusi con MBP e tioredossina 6xIstidina mostra una buona e riproducibile attività di omodimerizzazione, apparendo come una banda aggiuntiva nei risultati SDS-PAGE del saggio di pulldown MBP. Un altro esempio di utilizzo del metodo per studiare la formazione complessa alternativa è mostrato qui.Nel test di co-espressione, ENY2 marcato con 6xIstidina ha interagito sia con Sgf11 marcato con GST che con MBP-CTCF, ma nessun GST-Sgf11 era presente nei pulldown MBP e viceversa. Qui viene mostrato un confronto passo-passo degli intervalli di tempo richiesti nel flusso di lavoro del test di pulldown convenzionale rispetto al pulldown accoppiato alla co-espressione. I risultati dell'utilizzo di entrambe le tecniche per studiare la stessa interazione tra il dominio BTB della proteina CP190 e il dominio C-terminale marcato GST della proteina Drosophila CTCF sono mostrati qui.La scelta corretta del test di affinità e solubilità, tioredossina, GST o MBP, è fondamentale per l'esecuzione efficiente del test. Un altro passo fondamentale è la distruzione cellulare rapida e uniforme. Si consiglia vivamente di utilizzare sonde sonicator multi-tip.Questo metodo consente lo studio diretto della formazione di eterodimeri tra domini proteici che altrimenti formano omodimeri che non si dissocierebbero durante l'incubazione di proteine purificate nel saggio pulldown convenzionale.

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