Name: Un metodo di compensazione del tessuto idrofobico per il tessuto cerebrale del ratto (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Impara un metodo di compensazione idrofobica per il cervello di ratto intatto, inclusi modelli F344/N e HIV-1 transgenici. Questa tecnica consente l'analisi a livello di circuito neuronale preservando l'integrità tissutale.

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Questo lavoro è stato finanziato da sovvenzioni NIH: NS100624, DA013137, HD043680, MH106392 e da T32 Training Grant 5T32GM081740

Tutti i protocolli degli animali sono stati esaminati e approvati dal Comitato per la cura e l'uso degli animali presso l'Università della Carolina del Sud.
1. Preparazione della soluzione stock
<ol><li>Soluzione 1 (1 L): A 900 mL di H2O deionizzato aggiungere 100 mL di 10x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e 2 mL di Triton X-100.</li>
	<li>Soluzione 2 (1 L): a 900 mL di H2O deionizzato, aggiungere 100 mL di PBS 10x, 2mL di Tween-20 e 1 mL di soluzione stock di eparina da 10 mg/mL.</li>
	<li>Soluzione 3 (500 mL): a 400 mL di Soluzione 1, aggiungere 11,5 g di glicina e 100 mL di dimetilsolfossido (DMSO).</li>
	<li>Soluzione 4 (50 mL): a 42 mL di Soluzione 1, aggiungere 3 mL di siero corrispondente e 5 mL di DMSO.</li>
	<li>Soluzione anticorpale primaria (50 mL): a 46 mL di Soluzione 2, aggiungere 2,5 mL di DMSO e 1,5 mL di siero corrispondente.</li>
	<li>Soluzione anticorpale secondaria (50 mL): a 48,5 mL di Soluzione 2, aggiungere 1,5 mL di siero corrispondente. NOTA: per la soluzione 4, la soluzione primaria e la soluzione secondaria, utilizzare un siero corrispondente all'anticorpo secondario (ad es. capra, cavallo, bovino).</li>
</ol>2. Preparazione del campione
NOTA: eseguire i passaggi da 2.1 a 2.7 in una cappa aspirante per limitare l'esposizione al PFA.
<ol><li>Anestetizzare profondamente il giovane ratto (3-6 settimane) usando il sevoflurano; procedere a 2.2 quando il ratto non risponde e non risponde al pizzico della dita e della coda.</li>
	<li>Posare il ratto in posizione supina e fare un'incisione attraverso la parete addominale usando un paio di forbici dell'iride.</li>
	<li>Tagliare attraverso il fondo della gabbia toracica fino alla clavicola su entrambi i lati della gabbia toracica usando le forbici Mayo.</li>
	<li>Apporre lo sterno e le costole lontano dal cuore e dai polmoni con un mostato.</li>
	<li>Forare il ventricolo sinistro con un ago da 23 G attaccato a una pompa di perfusione e tagliare l'atrio destro con le forbici dell'iride.</li>
	<li>Eseguire la perfusione transcardica con circa 75 mL di 100 mM (1x) PBS.</li>
	<li>Continuare la perfusione transcardica con circa 100 mL di paraformaldeide (PFA) al 4% tamponata in 1x PBS.</li>
	<li>Rimuovere il cervello dal cranio usando una pinica.</li>
	<li>Posizionare il cervello in posizione sagittale e tagliare in 4 sezioni uguali (circa 3 mm di larghezza) usando una lama di rasoio e una matrice cerebrale di ratto.</li>
	<li>Fissare ogni sezione in PFA al 4% in 1x PBS in un tubo di plastica sigillato da 5 ml durante la notte a 4 °C su uno shaker.</li>
	<li>Continuare a fissare in 4% PFA in 1x PBS a temperatura ambiente (RT) su uno shaker per 1 ora.</li>
	<li>Lavare ogni sezione con 1x PBS a RT per 30 min, 3 volte.</li>
</ol>3. Disidratazione e depigmentazione
<ol><li>Incubare il campione in una soluzione acquosa deionizzata al 20% di metanolo/80% per 1 ora a RT.</li>
	<li>Incubare il campione in una soluzione acquosa deionizzata al 40% di metanolo/60% per 1 ora a RT.</li>
	<li>Incubare il campione in una soluzione acquosa deionizzata al 60% di metanolo/40% per 1 ora a RT.</li>
	<li>Incubare il campione in una soluzione acquosa deionizzata all'80% di metanolo/20% per 1 ora a RT.</li>
	<li>Incubare il campione in metanolo al 100% per 1 ora a RT. Ripetere con più metanolo al 100%, incubando per 1 ora a RT.</li>
	<li>Raffreddare il campione in metanolo al 100% a 4° C per circa 10 min.</li>
	<li>Preparare una soluzione al 66% di diclorometano (DCM)/metanolo al 33%.</li>
	<li>Incubare il campione durante la notte nella soluzione DCM/metanolo a RT, con agitazione.</li>
	<li>Lavare con metanolo a RT per 30 minuti, 2 volte.</li>
	<li>Raffreddare il campione in metanolo al 100% a 4° C per circa 10 min.</li>
	<li>Candeggina in perossido di idrogeno al 5% refrigerato e appena preparato in metanolo durante la notte a 4 ° C.</li>
	<li>Incubare il campione in una soluzione acquosa deionizzata all'80% di metanolo/20% per 1 ora a RT.</li>
	<li>Incubare il campione in una soluzione acquosa deionizzata al 60% di metanolo/40% per 1 ora a RT.</li>
	<li>Incubare il campione in una soluzione acquosa deionizzata al 40% di metanolo/60% per 1 ora a RT.</li>
	<li>Incubare il campione in una soluzione acquosa deionizzata al 20% di metanolo/80% per 1 ora a RT.</li>
	<li>Incubare il campione in 1x PBS per 1 ora a RT.</li>
	<li>Lavare in soluzione 1 per 1 ora a RT, 2 volte.</li>
</ol>4. Etichettatura della subunità B della tossina del colera
<ol><li>Inserire la punta dell'ago di 1 mL di siringa nel sito del nucleo accumbens.</li>
	<li>Iniettare lentamente 2,5 μL di 1% di biotina-CTB su 20 s.</li>
	<li>Lasciare la punta dell'ago in posizione per 1 minuto e rimuovere lentamente oltre 10 s per evitare perdite.</li>
</ol>5. Applicazione di anticorpi
<ol><li>Incubare il campione in Soluzione 3 per 2 giorni a 37 °C a bagnomaria.</li>
	<li>Incubare il campione in Soluzione 4 per 2 giorni a 37 °C a bagnomaria.</li>
	<li>Incubare con anticorpo primario per 7 giorni a 37 °C a bagnomaria.</li>
	<li>Lavare in soluzione 2 per 5 volte, incubando 1 ora per lavaggio. Conservare nella soluzione 2 a RT durante la notte.</li>
	<li>Incubare con anticorpi secondari per 7 giorni a 37 °C a bagnomaria.</li>
	<li>Lavare in soluzione 2 per 5 volte, incubando 1 ora per lavaggio; conservare nella soluzione 2 a RT durante la notte. NOTA: tutti i passaggi dalla versione 5.6 in poi, inclusa la conservazione finale, devono avvenire in condizioni di scarsa illuminazione. Le provette campione possono essere schermate con un foglio di alluminio. Le concentrazioni utilizzate per gli anticorpi in questo protocollo erano: TH a 1:100, Iba1 a 1:200 e l'anticorpo secondario a 1:100. Aggiungere la soluzione aggiuntiva 2 ai passaggi 5.1-5.6 per garantire che i tubi siano completamente riempiti.</li>
</ol>6. Pulizia dei tessuti
<ol><li>Incubare il campione in una soluzione acquosa deionizzata al 20% di metanolo/80% per 1 ora a RT.</li>
	<li>Incubare il campione in una soluzione acquosa deionizzata al 40% di metanolo/60% per 1 ora a RT.</li>
	<li>Incubare il campione in una soluzione acquosa deionizzata al 60% di metanolo/40% per 1 ora a RT.</li>
	<li>Incubare il campione in una soluzione acquosa deionizzata all'80% di metanolo/20% per 1 ora a RT.</li>
	<li>Incubare il campione in metanolo al 100% per 1 ora a RT.</li>
	<li>Incubare in metanolo fresco al 100% durante la notte a RT.</li>
	<li>Incubare in 66% DCM/33% metanolo per 3 ore, con agitazione, a temperatura ambiente.</li>
	<li>Incubare in etere dibenzyl (DBE) senza agitare. Lasciare il campione in DBE fino a quando non è chiaro e memorizzare in DBE fino all'imaging.</li>
</ol>7. Montaggio
<ol><li>Ottieni una camera stampata in 3D in resina Visijet M3 Crystal (modelli disponibili sul sito web idisco.info).</li>
	<li>Fissare la camera a un vetrino per microscopio usando una resina epossidica.</li>
	<li>Posizionare il campione nello spazio quadrato al centro della camera.</li>
	<li>Riempire completamente la camera con DBE.</li>
	<li>Posizionare un coverslip di 0,17 mm di spessore sulla camera e applicare pressione fino a quando il coverslip non ha pieno contatto con le pareti della camera.</li>
	<li>Sigillare i bordi del coverslip alla camera usando la resina epossidica.</li>
	<li>Ruotare la camera per consentire alle bolle d'aria di fuoriuscire dall'ingresso di riempimento.</li>
	<li>Riempire la camera con DBE aggiuntivo.</li>
	<li>Sigillare l'ingresso di riempimento con resina epossidica e lasciare polimerizzare. NOTA: l'eccesso di DBE si riverserà durante il montaggio.</li>
</ol>8. Imaging
<ol><li>Utilizzare un sistema di microscopio confocale per eseguire z-scan con ingrandimento 4x (vedere il video 3Dallegato).</li>
	<li>Ottenere l'eccitazione fluorescente del campione utilizzando un set laser per emettere a una lunghezza d'onda simile alla lunghezza d'onda specificata dall'anticorpo secondario. L'eccitazione TH è stata ottenuta utilizzando un set laser HeNe per emettere a 632 nm.</li>
	<li>Impostare il rilevatore su una lunghezza d'onda vicina all'emissione laser. Per il presente protocollo, il rivelatore per TH è stato impostato a 650 nm.</li>
	<li>Aumentare il guadagno del rilevatore fino a quando non c'è un segnale visibile. Il guadagno di 650LP per le immagini è stato impostato su 7,50 B.</li>
	<li>Utilizzando l'opzione Scansione nel software di imaging confocale, spostare lo stadio del microscopio fino a quando il campione non viene messo a fuoco.</li>
	<li>Naviga intorno al tessuto in tutte le pianure e ottieni immagini singole o immagini z-stack utilizzando il software di imaging confocale.</li>
	<li>Una volta completata l'imaging, rimuovere il campione dalla camera. Rimetterlo in un tubo completamente riempito con DBE e conservarlo a RT in un luogo buio, preferibilmente coperto da un foglio di alluminio. NOTA: i campioni possono essere rimontati e ripresi finché il segnale di florescenza è ancora forte.</li>
</ol>

<ol><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li>
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<li>Barrot, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Braking+dopamine+systems%3A+a+new+GABA+master+structure+for+mesolimbic+and+nigrostriatal+functions%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscienc%22%5BJournal%5D)">Braking dopamine systems: a new GABA master structure for mesolimbic and nigrostriatal functions.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscienc. 32 (41), 14094-14101 (2012).</li>
<li>Roostalu, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+whole-brain+3D+imaging+of+tyrosine+hydroxylase-labeled+neuron+architecture+in+the+mouse+MPTP+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Quantitative whole-brain 3D imaging of tyrosine hydroxylase-labeled neuron architecture in the mouse MPTP model of Parkinson's disease.</a> Disease Models & Mechanisms. 12 (11), (2019).</li>
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<li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clarifying+tissue+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Clarifying tissue clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li>
</ol>

Nessuno degli autori ha conflitti di interesse da dichiarare.

La pulizia dei tessuti offre una soluzione ai limiti del protocollo IHC tradizionale. Un campione trasparente riduce al minimo la dispersione e l'assorbimento della luce, che fornisce accesso ottico a livello cellulare ai tessuti intatti18,19. Le tecniche di pulizia dei tessuti trasformano un tessuto trasparente attraverso la delipidazione, la decolorazione e la decalcificazione con la somministrazione di solventi. Una volta che l'indice di rifrazione del campion...

Diverse tecniche di pulizia dei tessuti sono state convalidate per l'uso nel cervello: idrogel, idrofilo e idrofobo. Queste tecniche mirano a trasformare un tessuto trasparente attraverso la delipidazione, la decolorazione e la decalcificazione attraverso la somministrazione di solventi. Una volta che l'indice di rifrazione del campione di tessuto corrisponde all'indice di rifrazione del mezzo di imaging scelto, è possibile ottenere un'immagine chiara del campione. Le tecniche a base di idrogel, come CLARITY, proteggono le biomolecole nel tessuto collegandole agli idrogel a base di acrilico, che prevengono danni strutturali e perdita di proteine1. Tuttavia, le tecniche di idrogel utilizzano sostanze chimiche aggressive che hanno il potenziale di danneggiare i tessuti più fragili e campioni di tessuto più densi potrebbero non essere compatibili con il protocollo idrogel. Alcune tecniche di idrogel possono richiedere attrezzature costose o portare all'espansione dei tessuti. Le tecniche idrofile, come CUBIC, preservano la struttura 3D attraverso la formazione di legami idrogeno all'interno del tessuto2. L'espansione tissutale può verificarsi anche in alcuni protocolli idrofili. La capacità di compensazione delle tecniche idrofile spesso non corrisponde alla capacità che hanno le tecniche idrofobiche, che è importante per i tessuti più densi e più spessi3.
Le tecniche idrofobiche sono solitamente veloci, non richiedono attrezzature speciali e producono un campione facile da maneggiare e conservare. iDISCO è una tecnica idrofoba che elimina il restringimento che può verificarsi in altri protocolli idrofobici. Originariamente, la tecnica di compensazione dei tessuti iDISCO è stata descritta da Renier et al.4 per gli embrioni e gli organi densi e adulti dei topi. Questa tecnica rimuove l'acqua dal tessuto nella fase iniziale di disidratazione, riducendo così la dispersione della luce. Il tessuto viene permeabilizzato durante il pretrattamento per consentire la penetrazione profonda degli anticorpi. I coloranti Alexa Fluor nello spettro rosso lontano sono utilizzati per l'immunolabeling per evitare l'autofluorescenza del tessuto a lunghezze d'onda inferiori5. I tessuti che sono stati sottoposti a protocolli di clearing idrofobico sono in grado di essere maneggiati facilmente e possono essere ripresi più volte grazie alla longevità dei coloranti Alexa Fluor. Se conservati correttamente, i tessuti possono fornire immagini per mesi o un anno dopo l'elaborazione iniziale.
Nel presente protocollo, l'anticorpo tirosina idrossilasi (TH), l'anticorpo Iba1 e la subunità B della tossina del colera (CTB) sono stati utilizzati sia sul cervello di ratto maschile che femminile e transgenico HIV-1 (Tg). Il ratto HIV-1 Tg possiede sette dei nove geni che compongono il genoma virale dell'HIV-1, che porta a un modello non infettivo di esposizione a lungo termine alla proteina HIV-16,7,8. Alterazioni dopaminergiche sono state precedentemente dimostrate nel ratto HIV-1 Tg e l'HIV-1 stesso è una malattia infiammatoria, quindi la scelta degli anticorpi era rilevante per il disegno sperimentale9,10,11,12. CTB è un tracciante che si attacca ai neuroni tramite il legame gangliosidico e può essere utilizzato per tracciare proiezioni afferenti nel cervello. La CTB è stata precedentemente utilizzata per studiare le proiezioni dal nucleo accumbens all'area della substantia nigra, due aree del cervello fortemente coinvolte con le vie dopaminergiche13,14,15.
In questo protocollo, TH servirà come marcatore per la produzione di dopamina e Iba1 segnerà la microglia attivata. L'anticorpo TH utilizzato etichetta selettivamente una singola banda a circa 62 kDa che corrisponde alla tirosina idrossilasi. L'anticorpo Iba1 corrisponde alla sequenza carbossi-terminale Iba1. Entrambi gli anticorpi sono stati allevati nel coniglio ed erano policlonali. La CTB sarà utilizzata per il tracciamento retrogrado dei neuroni dall'area del nucleo accumbens all'area della substantia nigra. L'attuale protocollo offre anche una linea guida per l'adeguamento del protocollo iDISCO originale in due modi distinti: 1) riduzione complessiva della colorazione di fondo modificando i reagenti sierici nelle fasi di blocco e 2) ridimensionamento del tempo di incubazione per essere adatto a campioni di tessuto più grandi. Nel complesso, il presente protocollo fornisce prove continue che le tecniche di clearing idrofobico sono fattibili nei tessuti cerebrali del ratto, non hanno interazioni dannose distinguibili con le proteine virali hiv-1 e sono compatibili con l'anticorpo TH, l'anticorpo Iba1 e il CTB.

<table><tbody><tr><td>Subunità B della tossina del colera (ricombinante), Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>C34775</td><td></td></tr><tr><td>DBE</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>108014-1KG</td><td></td></tr><tr><td>DCM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270997-100mL</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>472301-1L</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Fisher Chemical</td><td>G46-500</td><td></td></tr><tr><td>Capra anti-coniglio Alexa Fluor Plus 647</td><td>Invitrogen</td><td>A32733</td><td></td></tr><tr><td>Siero di capra</td><td>Sigma Life Science</td><td>G9023-10mL</td><td></td></tr><tr><td>Eparina</td><td>Acros Organics</td><td>41121-0010</td><td></td></tr><tr><td>Iba1 anticorpo primario</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>019-19741</td><td></td></tr><tr><td>Kwik-sil epossidico</td><td>VWR</td><td>70730-062</td><td></td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860-1l-R</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP2944-100</td><td></td></tr><tr><td>Macchina per perfusione</td><td>VWR</td><td>70730-062</td><td>mini pompa a flusso variabile</td></tr><tr><td>PFA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127-3KG</td><td></td></tr><tr><td>TH anticorpo primario</td><td>Millipore Sigma</td><td>AB152</td><td></td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP337-500</td><td></td></tr></tbody></table>

un metodo di compensazione del tessuto idrofobico per il tessuto cerebrale del ratto

A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue

I metodi di compensazione dei tessuti idrofobici sono procedure facilmente regolabili, veloci e a basso costo che consentono lo studio di una molecola di interesse in campioni di tessuto inalterati. Le tradizionali procedure di immunolabeling richiedono il taglio del campione in sezioni sottili, il che limita la capacità di etichettare ed esaminare le strutture intatte. Tuttavia, se il tessuto cerebrale può rimanere intatto durante l'elaborazione, le strutture e i circuiti possono rimanere intatti per l'analisi. I metodi di compensazione precedentemente stabiliti richiedono molto tempo per eliminare completamente il tessuto e le sostanze chimiche aggressive possono spesso danneggiare gli anticorpi sensibili. Il metodo iDISCO elimina rapidamente e completamente i tessuti, è compatibile con molti anticorpi e non richiede attrezzature di laboratorio speciali. Questa tecnica è stata inizialmente convalidata per l'uso nel tessuto dei topi, ma l'attuale protocollo adatta questo metodo agli emisferi di controllo e ai cervelli transgenici dei ratti. Oltre a questo, il presente protocollo apporta anche diverse modifiche al protocollo preesistente per fornire immagini più chiare con meno macchie di sfondo. Gli anticorpi per Iba-1 e tirosina idrossilasi sono stati convalidati nel ratto transgenico HIV-1 e nei ratti di controllo F344/N utilizzando l'attuale metodo di compensazione dei tessuti idrofobici. Il cervello è una rete intrecciata, in cui le strutture lavorano insieme più spesso che separatamente l'una dall'altra. Analizzare il cervello come un intero sistema rispetto a una combinazione di singoli pezzi è il più grande vantaggio di questo metodo di compensazione dell'intero cervello.

La completa eliminazione di ampie sezioni di tessuto cerebrale di ratto F344 / N e HIV-1 è stata ottenuta utilizzando questo protocollo di compensazione del tessuto idrofobico modificato. La Figura 1 mostra una tipica immagine confocale per TH nella regione substantia nigra. La Figura 1A rappresenta una colorazione densa e positiva. Aree dense come queste possono essere analizzate concentrandosi attraverso il piano "Z" per confermare la colorazione positiva e la...

Qui presentiamo un metodo di compensazione del tessuto idrofobico che consente la visualizzazione di molecole bersaglio come parte di strutture cerebrali intatte. Questa tecnica è stata ora convalidata per il controllo F344 / N e ratti transgenici HIV-1 di entrambi i sessi.

Un metodo di compensazione del tessuto idrofobico per il tessuto cerebrale del ratto

Hydrophobic tissue clearing methods are easily adjustable, fast, and low-cost procedures that allows for the study of a molecule of interest in unaltered ...

L'obiettivo generale di questa tecnica di pulizia è stabilire un metodo di pulizia dei tessuti per il cervello di ratto. Questo protocollo può essere utilizzato anche per il ratto transgenico HIV-1. Il vantaggio principale di questa tecnica è che il tessuto cerebrale del ratto può essere lasciato intatto per la pulizia, consentendo così l'analisi completa del livello del circuito.A dimostrare la procedura saranno Kristin Kirchner, una dottoranda del mio laboratorio, e anche Hailong Li, un ricercatore associato del mio laboratorio. Dopo aver eseguito la perfusione transcardica in un ratto di età compresa tra tre e sei settimane, rimuovere il cervello dal cranio usando una pinza. Quindi posizionalo in posizione sagittale e taglialo in quattro sezioni uguali larghe tre millimetri usando una lama di rasoio e una matrice cerebrale di ratto.Fissare ogni sezione in PFA al quattro percento in un tubo di plastica sigillato da cinque millilitri durante la notte su uno shaker a quattro gradi Celsius. Il giorno successivo, continuare la fissazione a temperatura ambiente per un'ora. Lavare ogni sezione tre volte con PBS per circa 30 minuti per lavaggio.Incubare in serie le sezioni lavate in una soluzione di metanolo al 20, 40, 60, 80 e 100% per un'ora ciascuna. Ripetere la disidratazione con metanolo al 100%. Quindi raffreddare i campioni in metanolo al 100% a quattro gradi Celsius per 10 minuti.Preparare una soluzione contenente il 66% di DCM e il 33% di metanolo e incubare le sezioni refrigerate in questa soluzione per una notte a temperatura ambiente con agitazione. Il giorno successivo, lavare il campione due volte con metanolo per 30 minuti e raffreddarlo in metanolo al 100% a quattro gradi Celsius per 10 minuti. Per lo sbiancamento, immergere il campione in perossido di idrogeno fresco al cinque percento in metanolo e incubarlo per una notte a quattro gradi Celsius.Dopo l'incubazione notturna, incubare in serie il campione in soluzioni di metanolo all'80, 60, 40 e 20% per un'ora ciascuna a temperatura ambiente. Quindi incubare il campione in PBS per un'ora e lavarlo due volte in soluzione, una per un'ora per ogni lavaggio. Riempire una siringa da un millilitro con 2,5 microlitri di biotina-CTB all'uno per cento e iniettarla lentamente nel sito del nucleo accumbens per 20 secondi.Lasciare la punta dell'ago in posizione per un minuto e rimuoverla lentamente nell'arco di 10 secondi per evitare perdite. Incubare il campione nella soluzione tre e poi nella soluzione quattro per due giorni ciascuno in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius. Quindi aggiungere l'anticorpo primario e continuare l'incubazione per sette giorni.Lavare il campione cinque volte nella soluzione due per un'ora per lavaggio e conservarlo nella soluzione due a temperatura ambiente per una notte. Incubare il campione con un anticorpo secondario per sette giorni in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius. Infine, lavalo cinque volte nella soluzione due per un'ora per lavaggio e conservalo nella soluzione due a temperatura ambiente per una notte in condizioni di scarsa illuminazione.Incubare il campione in serie in metanolo al 20, 40, 60, 80 e 100% per un'ora ciascuno a temperatura ambiente. Quindi incubarlo in metanolo fresco al 100% per una notte. Il giorno successivo, incubare il campione in 66%DCM appena preparato in metanolo al 33% per tre ore a temperatura ambiente con agitazione.Dopo tre ore, incubare il campione in etere dibenzilico senza agitare fino a quando non è limpido. Quindi conservarlo in etere dibenzilico fino all'imaging. Procurati una camera per stampante 3D e fissala a un vetrino da microscopio utilizzando la resina epossidica.Posizionare il campione nello spazio quadrato al centro della camera e riempire completamente la camera con etere dibenzilico. Posizionare un vetrino di copertura di 0,17 millimetri di spessore sulla camera e applicare pressione per assicurarsi che sia completamente a contatto con le pareti della camera. Quindi sigillare i bordi con resina epossidica.Assicurarsi di ruotare la camera per consentire la fuoriuscita di bolle d'aria dall'ingresso di riempimento. Riempire la camera con ulteriore etere dibenzilico. Quindi sigillare l'ingresso di riempimento con resina epossidica e lasciarlo indurire.Osservare il campione utilizzando un sistema di microscopio confocale per eseguire una scansione z con un ingrandimento quattro volte. L'immagine confocale del campione di tessuto ripulito idrofobicamente con un ingrandimento quattro volte superiore mostra una densa colorazione TH nell'area della substantia nigra, neuroni TH radi adiacenti alla substantia nigra e un'area nera scura di tessuto priva di neuroni TH. La morfologia tipica di un neurone TH-positivo a 20 volte l'ingrandimento ha un grande soma e diversi processi di ramificazione.Mentre le microglia colorate con IBA1 hanno piccoli corpi cellulari e processi di estensione più brevi. L'immagine confocale ideale mostra una colorazione TH positiva e densa nell'area della substantia nigra con un adeguato guadagno di fluorescenza. Esempi di immagini confocali scadenti includono un'immagine messa a fuoco in modo improprio con un guadagno fluorescente eccessivo, una colorazione falsamente positiva con punti luminosi non a fuoco con il resto del tessuto e un'elevata colorazione di fondo a seguito dell'utilizzo di un siero bloccante che non corrisponde a un anticorpo secondario.Qui viene mostrata la colorazione CTB positiva nel cervello di ratto. Le fibre lunghe e sottili sono proiezioni afferenti lungo la via dopaminergica. La colocalizzazione di TH e CTB consente di visualizzare il sito di iniezione nell'area del nucleo accumbens che appare come un cerchio verde densamente fluorescente.La colocalizzazione di TH e CTB nella substantia nigra è mostrata qui. Le cose più importanti da ricordare quando si tenta questa procedura sono di lasciare al campione tutto il tempo necessario per incubare in tutte le soluzioni anticorpali e tutto il tempo necessario per eliminare completamente prima dell'imaging. Il campione dovrebbe avere un'esposizione limitata all'aria in quanto ciò danneggerebbe il campione.Questa tecnica è altamente versatile e può essere utilizzata per studiare molte proteine di interesse in diverse regioni del cervello. L'attuale tecnica aiuta a spianare la strada ai neuroscienziati per studiare il cervello di ratto a livello di circuito, che è essenziale per lo studio del cervello nel suo intero sistema.

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Questo video descrive la procedura di colorazione con cloruro di 2,3,5-trifenil-2H-tetrazolio per visualizzare fette di tessuto cerebrale di ratto e differenziare il tessuto vitale da quello danneggiato dopo l'occlusione e la riperfusione dell'arteria cerebrale media.

Colorazione TTC di fette di tessuto cerebrale di ratto: una procedura di colorazione per differenziare il tessuto vitale e necrotico in fette di tessuto dopo una lesione da ischemia-riperfusione

Questo video mostra il processo di isolamento dei microvasi cerebrali dai ratti soppressi. Comprende la dissezione del cervello, la pulizia del tessuto e la digestione meccanica, seguita da centrifugazione ripetuta per isolare la frazione pura dei microvasi.

Un metodo per l'isolamento delle unità neurovascolari dal cervello di ratto

Fonte: Kirchner, K.N., et al., Un metodo di pulizia del tessuto idrofobico per il tessuto cerebrale di ratto. J. Vis. Exp. (2020). Questo video mostra il metodo di pulizia del tessuto idrofobico di un campione di tessuto cerebrale di ratto. Il campione viene disidratato in sequenza in metanolo, trattato con una miscela di diclorometano e metanolo per sciogliere lipidi e pigmenti e trasferito in etere dibenzilico per la completa pulizia dei tessuti, consentendo un imaging dettagliato senza...

Un metodo di pulizia del tessuto idrofobico per un campione di tessuto cerebrale di ratto

Occlusione carotidea bilaterale accoppiato con ipotensione sistemica produce ischemia cerebrale globale nel ratto, con conseguenti danni al dell'ippocampo con severità riproducibile. Soggetti animali sono compromesse con modelli prevedibili di danni cerebrali, si riprendono speditamente, ed i tassi di mortalità sono relativamente bassi.

2-occlusione di vasi / Ipotensione: un modello di ratto di Global Ischemia cerebrale

Presentiamo qui un protocollo ottimizzato e dettagliato per la doppia immunocolorazione in sezioni di tessuto del sistema nervoso centrale (SNC) e dei linfonodi periferici (LN) di ratto fissate in formalina e incluse in paraffina.

Analisi immunoistochimica nel Sistema Nervoso Centrale e Periferico Rat linfa nodo del tessuto Sezioni

Per comprendere la struttura delle reti neuronali, caratterizzazione funzionale e morfologica dei singoli neuroni è una necessità. Qui, dimostriamo etichettatura juxtasomal biocitina, che permette registrazioni elettrofisiologiche nella configurazione extracellulare, pur mantenendo la capacità di etichettare intracellulare neurone per la ricostruzione post-hoc di dendritiche e dell'architettura assonale.

Juxtasomal biocitina Etichettatura per studiare la struttura-funzione relazioni dei singoli neuroni corticali

Viene presentato un protocollo per la sublimazione della matrice DAN su tessuto cerebrale di ratto per la rilevazione di gangliosidi utilizzando la spettrometria di massa per immagini MALDI.

Sublimazione di DAN Matrix per la rilevazione e visualizzazione dei gangliosidi nel cervello di ratto Tissue per MALDI Imaging Mass Spectrometry

Qui, è descritto un metodo per l'isolamento dei microvasi cerebrali di ratto e per la preparazione di campioni di membrana. Questo protocollo ha il chiaro vantaggio di produrre arricchito del microvessel campioni con proteina accettabile resa da singoli animali. Campioni possono quindi essere utilizzati per analisi di robusta proteina presso l'endotelio microvascolare cerebrale.

Un metodo semplice e riproducibile per preparare campioni di membrana da microvasi cerebrali appena isolati del ratto

Presentiamo un protocollo per stabilire un massiccio modello di emorragia pontina in un ratto attraverso la doppia iniezione di sangue autologo.

Emorragia pontina massiccia per doppia iniezione di sangue autologo

La morfologia dendritica neuronale è spesso alla base della funzione. In effetti, molti processi patologici che influenzano lo sviluppo dei neuroni si manifestano con un fenotipo morfologico. Questo protocollo descrive un metodo semplice e potente per analizzare i pergole dendritiche intatte e le loro spine associate.

Imaging e quantificazione di dendriti neuronali intatti tramite CLARITY Tissue Clearing

Questo studio presenta un protocollo per l'estrazione e la preparazione di campioni chiari di intero cervello e midollo spinale con segnali fluorescenti conservati, migliorando l'efficienza sperimentale e l'integrità dei dati per far progredire la ricerca neuroscientifica.

Estrazione e pulizia dei tessuti Preparazione di campioni di cervello e midollo spinale di topo

Impara un metodo di compensazione idrofobica per il cervello di ratto intatto, inclusi modelli F344/N e HIV-1 transgenici. Questa tecnica consente l'analisi a livello di circuito neuronale preservando l'integrità tissutale.

Un metodo di compensazione del tessuto idrofobico per il tessuto cerebrale del ratto

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