Un metodo di compensazione del tessuto idrofobico per il tessuto cerebrale del ratto

L'obiettivo generale di questa tecnica di pulizia è stabilire un metodo di pulizia dei tessuti per il cervello di ratto. Questo protocollo può essere utilizzato anche per il ratto transgenico HIV-1. Il vantaggio principale di questa tecnica è che il tessuto cerebrale del ratto può essere lasciato intatto per la pulizia, consentendo così l'analisi completa del livello del circuito.

A dimostrare la procedura saranno Kristin Kirchner, una dottoranda del mio laboratorio, e anche Hailong Li, un ricercatore associato del mio laboratorio. Dopo aver eseguito la perfusione transcardica in un ratto di età compresa tra tre e sei settimane, rimuovere il cervello dal cranio usando una pinza. Quindi posizionalo in posizione sagittale e taglialo in quattro sezioni uguali larghe tre millimetri usando una lama di rasoio e una matrice cerebrale di ratto.

Fissare ogni sezione in PFA al quattro percento in un tubo di plastica sigillato da cinque millilitri durante la notte su uno shaker a quattro gradi Celsius. Il giorno successivo, continuare la fissazione a temperatura ambiente per un'ora. Lavare ogni sezione tre volte con PBS per circa 30 minuti per lavaggio.

Incubare in serie le sezioni lavate in una soluzione di metanolo al 20, 40, 60, 80 e 100% per un'ora ciascuna. Ripetere la disidratazione con metanolo al 100%. Quindi raffreddare i campioni in metanolo al 100% a quattro gradi Celsius per 10 minuti.

Preparare una soluzione contenente il 66% di DCM e il 33% di metanolo e incubare le sezioni refrigerate in questa soluzione per una notte a temperatura ambiente con agitazione. Il giorno successivo, lavare il campione due volte con metanolo per 30 minuti e raffreddarlo in metanolo al 100% a quattro gradi Celsius per 10 minuti. Per lo sbiancamento, immergere il campione in perossido di idrogeno fresco al cinque percento in metanolo e incubarlo per una notte a quattro gradi Celsius.

Dopo l'incubazione notturna, incubare in serie il campione in soluzioni di metanolo all'80, 60, 40 e 20% per un'ora ciascuna a temperatura ambiente. Quindi incubare il campione in PBS per un'ora e lavarlo due volte in soluzione, una per un'ora per ogni lavaggio. Riempire una siringa da un millilitro con 2,5 microlitri di biotina-CTB all'uno per cento e iniettarla lentamente nel sito del nucleo accumbens per 20 secondi.

Lasciare la punta dell'ago in posizione per un minuto e rimuoverla lentamente nell'arco di 10 secondi per evitare perdite. Incubare il campione nella soluzione tre e poi nella soluzione quattro per due giorni ciascuno in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius. Quindi aggiungere l'anticorpo primario e continuare l'incubazione per sette giorni.

Lavare il campione cinque volte nella soluzione due per un'ora per lavaggio e conservarlo nella soluzione due a temperatura ambiente per una notte. Incubare il campione con un anticorpo secondario per sette giorni in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius. Infine, lavalo cinque volte nella soluzione due per un'ora per lavaggio e conservalo nella soluzione due a temperatura ambiente per una notte in condizioni di scarsa illuminazione.

Incubare il campione in serie in metanolo al 20, 40, 60, 80 e 100% per un'ora ciascuno a temperatura ambiente. Quindi incubarlo in metanolo fresco al 100% per una notte. Il giorno successivo, incubare il campione in 66%DCM appena preparato in metanolo al 33% per tre ore a temperatura ambiente con agitazione.

Dopo tre ore, incubare il campione in etere dibenzilico senza agitare fino a quando non è limpido. Quindi conservarlo in etere dibenzilico fino all'imaging. Procurati una camera per stampante 3D e fissala a un vetrino da microscopio utilizzando la resina epossidica.

Posizionare il campione nello spazio quadrato al centro della camera e riempire completamente la camera con etere dibenzilico. Posizionare un vetrino di copertura di 0,17 millimetri di spessore sulla camera e applicare pressione per assicurarsi che sia completamente a contatto con le pareti della camera. Quindi sigillare i bordi con resina epossidica.

Assicurarsi di ruotare la camera per consentire la fuoriuscita di bolle d'aria dall'ingresso di riempimento. Riempire la camera con ulteriore etere dibenzilico. Quindi sigillare l'ingresso di riempimento con resina epossidica e lasciarlo indurire.

Osservare il campione utilizzando un sistema di microscopio confocale per eseguire una scansione z con un ingrandimento quattro volte. L'immagine confocale del campione di tessuto ripulito idrofobicamente con un ingrandimento quattro volte superiore mostra una densa colorazione TH nell'area della substantia nigra, neuroni TH radi adiacenti alla substantia nigra e un'area nera scura di tessuto priva di neuroni TH. La morfologia tipica di un neurone TH-positivo a 20 volte l'ingrandimento ha un grande soma e diversi processi di ramificazione.

Mentre le microglia colorate con IBA1 hanno piccoli corpi cellulari e processi di estensione più brevi. L'immagine confocale ideale mostra una colorazione TH positiva e densa nell'area della substantia nigra con un adeguato guadagno di fluorescenza. Esempi di immagini confocali scadenti includono un'immagine messa a fuoco in modo improprio con un guadagno fluorescente eccessivo, una colorazione falsamente positiva con punti luminosi non a fuoco con il resto del tessuto e un'elevata colorazione di fondo a seguito dell'utilizzo di un siero bloccante che non corrisponde a un anticorpo secondario.

Qui viene mostrata la colorazione CTB positiva nel cervello di ratto. Le fibre lunghe e sottili sono proiezioni afferenti lungo la via dopaminergica. La colocalizzazione di TH e CTB consente di visualizzare il sito di iniezione nell'area del nucleo accumbens che appare come un cerchio verde densamente fluorescente.

La colocalizzazione di TH e CTB nella substantia nigra è mostrata qui. Le cose più importanti da ricordare quando si tenta questa procedura sono di lasciare al campione tutto il tempo necessario per incubare in tutte le soluzioni anticorpali e tutto il tempo necessario per eliminare completamente prima dell'imaging. Il campione dovrebbe avere un'esposizione limitata all'aria in quanto ciò danneggerebbe il campione.

Questa tecnica è altamente versatile e può essere utilizzata per studiare molte proteine di interesse in diverse regioni del cervello. L'attuale tecnica aiuta a spianare la strada ai neuroscienziati per studiare il cervello di ratto a livello di circuito, che è essenziale per lo studio del cervello nel suo intero sistema.