Un metodo semplice e riproducibile per preparare campioni di membrana da microvasi cerebrali appena isolati del ratto
7 maggio 2018
Qui, è descritto un metodo per l'isolamento dei microvasi cerebrali di ratto e per la preparazione di campioni di membrana. Questo protocollo ha il chiaro vantaggio di produrre arricchito del microvessel campioni con proteina accettabile resa da singoli animali. Campioni possono quindi essere utilizzati per analisi di robusta proteina presso l'endotelio microvascolare cerebrale.
L'obiettivo generale di questa procedura è isolare i microvasi cerebrali dal cervello di ratto per studi biochimici volti a comprendere le caratteristiche molecolari della barriera emato-encefalica dei mammiferi. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella fisiologia della barriera emato-encefalica e nella neurofarmacologia, come la regolazione, la localizzazione e l'espressione delle proteine della giunzione stretta e dei trasportatori endogeni in salute e malattia. Il vantaggio principale di questa tecnica è che possiamo isolare un numero sufficiente di microvasi di alta qualità da un singolo animale, tenendo conto della variabilità naturale nell'espressione proteica tra i singoli animali.
A dimostrare questa tecnica sarà Bianca Reilly, un'eccezionale studentessa universitaria del mio laboratorio. Dopo l'eutanasia e la decapitazione di un ratto Sprague-Dawley secondo il protocollo di testo, utilizzare le forbici chirurgiche per resecare la pelle dal cranio del ratto eseguendo un singolo taglio trasversale. Usando i rongeur, rimuovere con cura la placca cranica ed esporre il cervello.
Quindi, con una spatola, rimuovere l'organo. Staccare il cervello e posizionare il tessuto cerebrale isolato in un tubo conico da 50 millilitri con cinque millilitri di BMB e 5,0 microlitri di cocktail di inibitori della proteasi. Per elaborare il tessuto, trasferirlo in una capsula di Petri pulita.
Quindi, usando una pinza, arrotolare delicatamente il cervello su una carta da filtro di 12,5 centimetri di diametro per rimuovere le meningi esterne, che aderiscono liberamente alla corteccia cerebrale. Durante questa fase, è necessario prestare attenzione per assicurarsi che tutto il tessuto meningeo sia stato rimosso dal campione di tessuto cerebrale. Le meningi possono essere visualizzate come un tessuto membranoso chiaro che può essere facilmente estratto dal tessuto cerebrale.
Premere delicatamente il tessuto cerebrale contro la carta da filtro e arrotolare nuovamente il fazzoletto, girando frequentemente la carta da filtro durante questo passaggio. Quindi, usando una pinza, separare il plesso coroideo dagli emisferi cerebrali. Quindi, appiattisci delicatamente il tessuto cerebrale e usa una pinza per rimuovere i bulbi olfattivi adiacenti alla sostanza bianca.
Metti il tessuto cerebrale corticale in un mortaio di vetro freddo. Quindi, aggiungere cinque millilitri di BMB con cocktail di inibitori della proteasi. Utilizzando un omogeneizzatore di potenza sopraelevato, inserire un pestello nel mortaio e omogeneizzare il tessuto cerebrale utilizzando 15 colpi su e giù a 3.700 giri/min.
Quindi, versare l'omogeneizzato in provette da centrifuga etichettate. Tra un campione e l'altro, utilizzare il 70% di etanolo per pulire il pestello. Per eseguire la centrifugazione, aggiungere 8,0 millilitri di soluzione di destrano al 26% a ciascuna provetta da centrifuga etichettata contenente omogeneizzato cerebrale.
Capovolgere il tubo due volte, quindi agitare accuratamente il campione. Condurre il vortice di ciascun campione utilizzando più angoli per garantire una miscelazione accurata della soluzione di omogeneizzato cerebrale con la soluzione di destrano al 26%. Centrifugare i campioni a 5.000 g e quattro gradi Celsius per 15 minuti.
Aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 5,0 millilitri di BMB con cocktail di inibitori della proteasi. Quindi, agitare il pellet per garantire una miscelazione accurata. Quindi, aggiungere 8,0 millilitri di destrano al 26% a ciascuna provetta da centrifuga e vorticare come appena dimostrato.
Quindi, centrifugare nuovamente i campioni. Utilizzando un pallone sottovuoto e una pipetta di vetro, aspirare il surnatante e assicurarsi che il pellet contenente il microvaso cerebrale non venga interrotto. Risospendere il pellet in BMB con l'inibitore della proteasi e poi il destrano al 26% altre due volte.
Dopo la centrifugazione finale, aggiungere 5,0 millilitri di BMB a ciascun pellet e vorticare per risospendere il campione. Utilizzando il protocollo dimostrato in questo video, è stato effettuato con successo l'isolamento di microvasi intatti dal cervello di ratto. In questa immagine, il microvaso è colorato utilizzando un anticorpo contro Oatp1a4, un trasportatore che è ben espresso sulla membrana plasmatica delle cellule endoteliali microvascolari cerebrali.
Come dimostrato dal western blot, le preparazioni di membrana da microvasi raccolti da ratti femmina di Sprague-Dawley sono state arricchite in PECAM-1, noto anche come CD31, una proteina marcatrice per la microvascolarizzazione cerebrale. Durante l'ottimizzazione di questo protocollo, è stato osservato l'arricchimento di PECAM in campioni di membrana preparati utilizzando due e quattro fasi di centrifugazione del destrano. Come determinato dal saggio delle proteine di Bradford ed elencato in questa tabella, le preparazioni a membrana producono tipicamente concentrazioni proteiche comprese tra 5,0 milligrammi per millilitro e 10,0 milligrammi per millilitro.
I valori proteici sono stati determinati sulla base di una curva standard generata utilizzando BSA come standard. Qui è mostrato un western blot per la proteina di trasporto della BBB Glut1. Sono state rilevate bande singole chiare a 54 kilodalton per questa proteina BBB altamente espressa in ciascun campione di membrana.
Questo grafico illustra una maggiore espressione di Glut1 alla BBB nei ratti maschi rispetto alle femmine. Non è stata osservata alcuna differenza nell'espressione dell'ATPasi sodio/potassio tra animali maschi e femmine. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due o 2 ore e mezza se eseguita correttamente.
Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di mantenere tutti i campioni in ghiaccio per tutta la durata del protocollo e di prestare attenzione quando si aspira il surnatante dal pellet del microrecipiente dopo le fasi di centrifugazione. Seguendo questa procedura, altri metodi, come l'analisi di co-immunoprecipitazione, possono essere eseguiti su campioni di microvasi per rispondere a ulteriori domande, come l'associazione di diverse proteine all'interno dello stesso complesso proteico alla barriera emato-encefalica. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della fisiologia della barriera emato-encefalica e della neurofarmacologia per esplorare le caratteristiche molecolari della barriera emato-encefalica in salute e nei modelli di roditori di malattie neurologiche.
Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare microvasi di alta qualità dal cervello di ratto per i tuoi studi sulla biologia della barriera emato-encefalica in salute e malattia.
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Panoramica
Questo studio presenta un protocollo per isolare i microvasi del cervello di ratto per indagare la barriera emato-encefalica (BBB). Il metodo consente analisi proteiche di alta qualità da singoli animali, facilitando l'esplorazione di proteine delle giunzioni strette e trasportatori correlati alla neurofarmacologia e alla fisiologia.
Componenti chiave dello studio
Area di scienza
- Neuroscienza
- Analisi proteica
- Fisiologia della barriera emato-encefalica
Sfondo
- La barriera emato-encefalica svolge un ruolo cruciale nel mantenimento dell'omeostasi del sistema nervoso centrale.
- Comprendere le caratteristiche molecolari della BBB può informare gli studi sulle malattie neurologiche.
- Questo metodo tiene conto della variabilità nell'espressione proteica tra diversi ratti.
- Campioni di microvasi arricchiti sono essenziali per far progredire la ricerca neurofarmacologica.
Obiettivo dello studio
- Isolare i microvasi cerebrali dai cervelli di ratti per studi biochimici.
- Analizzare i componenti molecolari associati alla BBB in varie condizioni fisiologiche.
- Valutare l'espressione e la regolazione di specifiche proteine correlate alla funzione della BBB.
Metodi utilizzati
- La piattaforma principale coinvolge tecniche chirurgiche seguite da omogeneizzazione e centrifugazione del tessuto cerebrale.
- Il modello biologico consiste di ratti Sprague-Dawley, permettendo l'analisi individuale delle caratteristiche dei microvasi.
- Non è stato menzionato un workflow multiomics.
- I passaggi chiave includono la resezione del tessuto, l'omogeneizzazione e cicli multipli di centrifugazione per isolare i microvasi.
- La resa proteica e la purificazione sono valutate attraverso Western blotting e saggi proteici di Bradford.
Principali risultati
- I microvasi intatti sono stati isolati con successo e caratterizzati per l'espressione proteica.
- L'arricchimento di PECAM-1 (CD31) e Glut1 è stato confermato nelle preparazioni dei microvasi.
- Le concentrazioni proteiche tipicamente variavano da 5 a 10 mg/mL dopo il protocollo.
- È stata osservata una differenza notevole nell'espressione di Glut1 tra ratti maschi e femmine.
Conclusioni
- Questo studio fornisce un metodo affidabile per isolare i microvasi cerebrali, aprendo la strada alla ricerca futura sulla barriera emato-encefalica.
- Il protocollo migliora la comprensione delle dinamiche neurofarmacologiche e della fisiologia della BBB.
- Le intuizioni acquisite possono informare migliori approcci terapeutici per le condizioni neurologiche.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Isolating brain microvessels enables mechanistic de-risking of CNS drug targets by providing endothelial-enriched samples that reflect physiological variability. This method supports target validation and assay development for blood-brain barrier penetration studies, improving predictive confidence in lead identification. Reproducible membrane preparation from individual animals enhances translational biomarker alignment and portfolio triage in neuropharmacology R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of endothelial-specific targets like transporters and tight junction proteins in a disease-relevant system.
- Operational Value: Provides reproducible microvessel isolation from individual rats to capture inter-animal variability in target expression.
- Strategic Value: Supports hypothesis testing and biological de-risking of CNS targets prior to lead optimization.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Yields membrane samples suitable for quantitative analysis of BBB protein expression and function.
- Operational Value: Delivers consistent protein yields (5–10 mg/mL) enabling standardized assay inputs for screening campaigns.
- Strategic Value: Facilitates assay readiness for evaluating compound effects on endothelial targets in a scalable format.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains disease relevance by isolating microvessels from rodent models to study BBB responses to pharmacological stimuli.
- Operational Value: Enables continuity from discovery through preclinical validation using matched biological systems.
- Strategic Value: Supports risk-adjusted advancement decisions by confirming target engagement at the BBB.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from target validation to preclinical evaluation by providing endothelial-enriched samples for mechanistic studies.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and target confirmation through enrichment of microvascular markers like PECAM-1 and Glut1.
- Screening: Delivers reproducible samples with quantifiable protein outputs for compound screening and target engagement assays.
- Analytics: Enables Western blot and Bradford assay readouts to compare protein expression across conditions and sexes.
- Translational Research: Connects to preclinical work by using rat brain microvessels as a disease-relevant system for BBB-targeted therapeutics.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable isolation platform for multiple projects targeting CNS drug delivery and BBB modulation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in BBB target validation.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through defined centrifugation and dextran-based enrichment steps.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing endothelial-specific data that reduces late-stage biological risk in CNS programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on validated expression in brain microvessels.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neuroanatomy and tissue handling to isolate cerebral microvessels without contamination.
- Needs access to homogenization equipment, centrifuges capable of 5,000 g at 4°C, and dextran preparation infrastructure.
- Demands cross-team standardization of sample processing to maintain consistency in protein yield and purity.
- Involves adaptation considerations when applying the method to other species or disease models beyond rat brain.
- Includes practical limitations such as the need to keep samples on ice and avoid pellet disruption during supernatant aspiration.
