Juxtasomal biocitina Etichettatura per studiare la struttura-funzione relazioni dei singoli neuroni corticali

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di collegare il potenziale d'azione specifico del tipo di cellula che aumenta nella corteccia sensoriale durante l'elaborazione delle informazioni all'identità morfologica dei neuroni registrati. Ciò si ottiene preparando prima chirurgicamente il ratto per le registrazioni juxtasomiali. Una volta preparato, un elettrodo registra l'attività di picco evocata spontaneamente e sensorialmente e il neurone registrato viene caricato con biocidina utilizzando corrente e iniezioni.

Successivamente, il cervello viene elaborato per la colorazione della biotina. Infine, il neurone riempito di biotina viene ricostruito digitalmente dalle sezioni successive per la classificazione del tipo di cellula. In definitiva, le registrazioni juxtasomiali di singoli neuroni consentono lo studio dell'elaborazione sensoriale e delle informazioni strutturali all'interno della rete corticale.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nelle neuroscienze, come ad esempio qual è il ruolo dei singoli tipi di cellule e strati durante l'elaborazione sensoriale? In generale, le persone che hanno bisogno di questo metodo avranno difficoltà perché è molto facile uccidere i neuroni durante la procedura di riempimento. Le possibilità di successo del riempimento di biocidina aumentano preparando pipette di qualità ottimale e, inoltre, è necessario un occhio allenato per controllare le iniezioni di corrente a banda stretta.

Pertanto, ci vuole esperienza per aumentare il tasso di successo del recupero di neuroni ben riempiti. Per iniziare, posizionare un ratto wistar anestetizzato su un telaio stereotassico dotato di un termoforo. Confermare la profondità della sedazione testando il riflesso di pizzicamento delle dita dei piedi.

Quindi inserire una sonda rettale per mantenere la corretta temperatura corporea. Fissare la testa dell'animale e rimuovere i peli dal sito chirurgico. Applicare un unguento sugli occhi per prevenire la secchezza.

Attendere da tre a cinque minuti dopo l'iniezione di lidocaina nel sito dell'operazione e rimuovere la pelle che copre la superficie del cranio. Quindi, eliminare il tessuto rimanente e pulire accuratamente il cranio con cloruro di sodio allo 0,9%. Determinare le coordinate per la corteccia somatosensoriale primaria nell'emisfero sinistro e segnare la posizione sul cranio con un pennarello cutaneo chirurgico.

Usa un trapano dentale per raschiare l'osso dalla regione di interesse. Continua a raschiare l'osso fino a quando non diventa trasparente e i vasi sanguigni sono chiaramente visibili. Quindi, taglia una piccola finestra nel teschio sottile con un bisturi.

Fare attenzione a non danneggiare la dura madre e i vasi sanguigni. Segna i bordi della craniotomia usando un pennarello cutaneo chirurgico. Per migliorare la visibilità, applicare un sottile strato di super colla sul cranio asciutto, quindi cemento dentale per costruire un bagno.

Nel chiudere la craniotomia, tagliare i baffi sul lato controlaterale esattamente a cinque millimetri per favorire la loro visibilità. Evidenzia i baffi tagliati con il mascara nero prima di iniziare le registrazioni, crea pipette patch in vetro Boro Silicic. La morfologia ideale della pipetta è una conicità graduale e sottile, un angolo del cono basso e un diametro interno del puntale di circa un micron.

Caricare la pipetta per cerotti con un normale rad ringer, integrato con biotina al 2%, e montare la pipetta per cerotti su un supporto per pipette, fissato a uno stadio di testa e collegato a un manipolatore microm. Per mirare in modo specifico alla colonna D due di ratto S uno, impostare l'angolo del portaelettrodo a 34 gradi rispetto al piano sagittale. Quindi, posizionare la pipetta patch in prossimità della craniotomia.

Riempire la vasca con cloruro di sodio allo 0,9%. Con l'amplificatore in modalità ponte, applicare impulsi quadrati con iniezione di corrente positiva per determinare la resistenza dell'elettrodo. La resistenza ottimale dell'elettrodo è compresa tra tre e cinque mega.

Stabilire una sovrapressione da 100 a 150 millibar e far avanzare la pipetta patch in incrementi di un micron applicando corrente positiva sotto forma di impulsi quadrati. Monitorare la robusta variazione di resistenza quando si stabilisce un contatto con la dura madre. A questo punto, impostare le coordinate del micromanipolatore su zero per consentire misurazioni accurate della profondità.

Avanzare in modalità a passi di un micron fino a quando la pipetta patch non penetra nella dura madre, indicata da un improvviso calo della resistenza dell'elettrodo. Rimuovere la pressione di mantenimento della pipetta. Quindi, cerca le singole unità mentre avanzi con incrementi di un micron.

Monitorare continuamente la resistenza dell'elettrodo applicando impulsi on off di 200 millisecondi e l'aumento della resistenza dell'elettrodo indica tipicamente la vicinanza di un singolo neurone che fa avanzare l'elettrodo fino all'azione positiva in corso. Vengono registrate forme d'onda potenziali di circa due millivolt. Opzionalmente, registrare l'attività di spiking spontanea e determinare l'attività di spiking revocata del baffo deviando in modo codardo i singoli baffi utilizzando un dispositivo elettrico pizo per ottenere le condizioni ottimali per il riempimento somiale.

Far avanzare l'elettrodo fino a quando la resistenza è compresa tra 25 e 35. I megaohm e i picchi hanno ampiezze da tre a otto millivolt per avviare il riempimento somiale. Applica impulsi di corrente quadra positiva a partire da un nano ampere.

Aumentare lentamente e gradualmente la corrente a passi di 0,1 nano ampere monitorando la forma d'onda e la frequenza AP. Monitorare l'apertura della membrana come un chiaro aumento della frequenza AP durante la fase di accensione dell'impulso di blocco, la forma d'onda spike durante il riempimento mostra una larghezza aumentata e ridotta dopo l'iperpolarizzazione, aumentare o diminuire la corrente durante il riempimento per mantenere stabile l'infusione di biotina, ridurre o interrompere gli impulsi di corrente in caso di aumento improvviso della frequenza AP. Per evitare la tossicità dovuta all'afflusso eccessivo di ioni extracellulari come gli ioni sodio.

È importante notare che ogni neurone risponderà in modo diverso alla procedura di riempimento. Pertanto, i parametri di marcatura juxta somali devono essere regolati in base alle condizioni di registrazione. Monitorare attentamente il segnale dopo aver interrotto l'iniezione di corrente.

La forma d'onda spike dopo una sessione di riempimento è solitamente allargata e mostra un'attesa fortemente ridotta dopo l'iperpolarizzazione per il recupero del neurone, che è evidente quando la forma d'onda spike ritorna alle sue proprietà originali per ridurre qualsiasi stress meccanico alla cellula. Ritrarre la pipetta del cerotto con incrementi di un micron fino a quando l'ampiezza del picco non diminuisce, attendere almeno un'ora affinché la biotina si diffonda a livello intracellulare monitorando attentamente la temperatura corporea e la respirazione dell'animale. Infine, i campioni di cervello vengono ottenuti ed elaborati per rivelare la qualità della marcatura iuxtasomiale.

Queste immagini mostrano immagini di neuroni riempiti di juxtamialmente nella corteccia somatosensoriale primaria. Questa vista tangenziale di un neurone parametallico dimostra la differenza di dimensioni tra dendriti e assoni. In questa ricostruzione digitale di un neurone marcato con juxta somalo, l'immagine di proiezione del neurone viene mostrata ad alta risoluzione, ma a basso ingrandimento, e con la ricostruzione digitale automatizzata sovrapposta all'assone in blu, il dendrite in rosso rispettivamente.

Qui la regione della scatola è espansa per mostrare l'assone bhuton per tutta la lunghezza dell'assone. In questa animazione finale, esemplifichiamo la pipeline di ricostruzione per un neurone parametallico a ciuffi spessi di cinque strati dalla corteccia somatosensoriale primaria di ratto. La pipeline comporta la ricostruzione della morfologia dendritica e assonale a un ingrandimento di 100 volte e dei contorni del barilotto a un ingrandimento di quattro volte.

Il risultato è una ricostruzione 3D completa, che viene successivamente registrata in un quadro di riferimento standardizzato per eseguire l'analisi quantitativa delle caratteristiche morfologiche. Pertanto, la marcatura juxta somica in vivo consente un'eccezionale qualità di marcatura per una ricostruzione affidabile della morfologia 3D completa. Qui abbiamo mostrato il metodo negli animali anestetizzati con uretano.

Tuttavia, le registrazioni Jux Somal possono essere utilizzate anche in animali con la testa sveglia trattenuta per studiare il ruolo dei singoli tipi di cellule e strati durante l'esplorazione attiva dell'ambiente. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una migliore comprensione di come eseguire la marcatura della biocidina sui singoli neuroni per l'identificazione e la ricostruzione morfologica del dopoguerra.