Juxtasomal biocitina Etichettatura per studiare la struttura-funzione relazioni dei singoli neuroni corticali

L'obiettivo generale di questa procedura è collegare l'attività di spiking del potenziale d'azione specifica per tipo cellulare nella corteccia sensoriale durante l'elaborazione delle informazioni all'identità morfologica dei neuroni registrati. Questo risultato si ottiene innanzitutto preparando chirurgicamente il ratto per registrazioni juxta-somatiche. Una volta preparato, un elettrodo registra l'attività di spiking spontanea ed evocata da stimoli sensoriali, e il neurone registrato viene caricato con biocidina mediante corrente e iniezioni.

Successivamente, il cervello viene processato per la colorazione con biotina. Infine, il neurone riempito con biotina viene ricostruito digitalmente a partire da sezioni consecutive per la classificazione del tipo cellulare. In definitiva, le registrazioni juxta-somatiche di singoli neuroni permettono lo studio dell'elaborazione sensoriale e delle informazioni strutturali all'interno della rete corticale.

Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nelle neuroscienze, ad esempio qual è il ruolo dei singoli tipi cellulari e dei diversi strati durante l'elaborazione sensoriale? In generale, chi necessita di questo metodo potrebbe incontrare difficoltà, poiché è molto facile danneggiare i neuroni durante la procedura di riempimento. La probabilità di un riempimento con biocidina riuscito aumenta preparando pipette di qualità ottimale e, inoltre, è necessaria un'esperienza consolidata per controllare le iniezioni di corrente a banda stretta.

Pertanto, è necessaria esperienza per aumentare il tasso di successo nel recupero di neuroni ben riempiti. Per iniziare, posizionare un ratto Wistar anestetizzato su un telaio stereotassico dotato di un tappetino riscaldante. Verificare la profondità della sedazione testando il riflesso alla compressione delle dita dei piedi.

Inserire quindi una sonda rettale per mantenere la temperatura corporea corretta. Fissare la testa dell'animale e rimuovere i peli dalla zona chirurgica. Applicare un unguento sugli occhi per prevenire l'essiccazione.

Attendere tre a cinque minuti dopo l'iniezione di lidocaina nel sito operatorio e rimuovere la cute che ricopre la superficie del cranio. Successivamente, eliminare eventuali tessuti residui e pulire accuratamente il cranio con soluzione fisiologica allo 0,9%. Determinare le coordinate della corteccia somatosensoriale primaria nell'emisfero sinistro e segnare la posizione sul cranio con una penna marcacutanea chirurgica.

Utilizzare un trapano dentale per raschiare l'osso dalla regione di interesse. Continuare a raschiare l'osso fino a quando non diventa trasparente e i vasi sanguigni sono chiaramente visibili. Successivamente, praticare una piccola finestra nel cranio sottile con un bisturi.

Avendo cura di non danneggiare la dura madre e i vasi sanguigni. Delimitare i margini della craniotomia utilizzando una penna marcante chirurgica. Per migliorare la visibilità, applicare uno strato sottile di colla cianoacrilica sul cranio asciutto e quindi del cemento dentale per costruire una camera.

Per chiudere la craniotomia, tagliare i vibrisi sul lato controlaterale esattamente a cinque millimetri per facilitarne la visibilità. Evidenziare le vibrisi tagliate con del mascara nero prima di iniziare le registrazioni; preparare le pipette per il patching utilizzando vetro Borosilicato. La morfologia ideale della pipetta è un restringimento sottile graduale, un angolo del cono basso e un diametro interno della punta di circa un micron.

Caricare la pipetta per il patch con ringer normale per rad, integrato con biotina al 2%, e montare la pipetta su un supporto per pipetta, fissato a una testa registrante, e collegato a un micromanipolatore. Per indirizzare in modo specifico la colonna D due della S uno del ratto, impostare l'angolo del supporto dell'elettrodo a 34 gradi rispetto al piano sagittale. Successivamente, posizionare la pipetta per il patch in prossimità della craniotomia.

Riempire il bagno con cloruro di sodio allo 0,9%. Con l'amplificatore in modalità ponte, applicare impulsi quadrati con iniezione di corrente positiva per determinare la resistenza dell'elettrodo. La resistenza ottimale dell'elettrodo è compresa tra tre e cinque mega.

Stabilire una pressione superiore di 100-150 millibar e avanzare la pipetta per il patch in passi di un micron applicando contemporaneamente una corrente positiva sotto forma di impulsi quadrati. Monitorare il netto cambiamento di resistenza al momento del contatto con la dura madre. A questo punto, impostare le coordinate del micromanipolatore su zero per consentire misurazioni precise della profondità.

Avanzare in modalità passo da un micrometro fino a quando la pipetta per il patch penetra nella dura madre, indicato da un brusco calo della resistenza dell'elettrodo. Rimuovere la pressione di mantenimento della pipetta. Successivamente, cercare unità singole avanzando a passi di un micrometro.

Monitorare continuamente la resistenza dell'elettrodo applicando impulsi di accensione e spegnimento della durata di 200 millisecondi; un aumento della resistenza dell'elettrodo indica tipicamente la vicinanza di un singolo neurone. Avanzare l'elettrodo fino a quando non vengono registrate forme d'onda del potenziale d'azione positive di circa due millivolt. Facoltativamente, registrare l'attività di scarica spontanea e determinare l'attività di scarica dei vibrischi deflettendo delicatamente singoli vibrischi mediante un dispositivo piezoelettrico, al fine di ottenere le condizioni ottimali per il riempimento juxta-somatico.

Avanzare l'elettrodo fino a quando la resistenza raggiunge 25-35 megaohm e le punte hanno ampiezze comprese tra tre e otto millivolt per iniziare il riempimento juxta-somale. Applicare impulsi di corrente quadrati positivi a partire da un nanoampere.

Aumentare lentamente e gradualmente la corrente a passi di 0,1 nanoampere monitorando la forma d'onda e la frequenza del potenziale d'azione. Monitorare l'apertura della membrana come un chiaro aumento della frequenza del potenziale d'azione durante la fase di accensione dell'impulso di blocco; la forma d'onda del potenziale di picco durante il riempimento mostra un'ampiezza aumentata e una ridotta iperpolarizzazione post-sinaptica. Aumentare o diminuire la corrente durante il riempimentio per mantenere una perfusione stabile di biotina, ridurre o interrompere gli impulsi di corrente in caso di brusco aumento della frequenza del potenziale d'azione. Per evitare tossicità dovuta all'eccessivo afflusso di ioni extracellulari come gli ioni sodio.

È importante notare che ogni neurone risponderà in modo diverso alla procedura di riempimento. Pertanto, i parametri di marcatura juxta-somata devono essere regolati in base alle condizioni di registrazione. Monitorare attentamente il segnale dopo aver interrotto l'iniezione di corrente.

La forma d'onda del potenziale d'azione dopo una sessione di riempimento è solitamente allargata e mostra una forte riduzione dell'iperpolarizzazione post-sinaptica, in attesa del recupero del neurone, che risulta evidente quando la forma d'onda del potenziale d'azione torna alle sue proprietà originali, riducendo al contempo qualsiasi stress meccanico sulla cellula. Ritirare la pipetta di registrazione a passi di un micrometro fino a quando l'ampiezza del potenziale d'azione diminuisce; attendere almeno un'ora per consentire la diffusione intracellulare della biotina, monitorando attentamente la temperatura corporea e la respirazione dell'animale. Infine, si ottengono campioni cerebrali che vengono processati per valutare la qualità dell'etichettatura juxta-somatale.

Queste immagini mostrano neuroni riempiti in modo giustapposto nella corteccia somatosensoriale primaria. Questa vista tangenziale di un neurone parametale illustra la differenza di dimensione tra dendriti e assoni. In questa ricostruzione digitale di un neurone marcato giustasomalmente, l'immagine della proiezione neuronale è mostrata ad alta risoluzione, ma a bassa ingrandimento, con la ricostruzione digitale automatica che sovrappone l'assone in blu e il dendrite in rosso rispettivamente.

Qui la regione della scatola viene ingrandita per mostrare il botone assonale lungo tutta la lunghezza dell'assone. In questa animazione finale, illustriamo la sequenza di ricostruzione per un neurone parametale spesso e cespuglioso dello strato cinque della corteccia somatosensoriale primaria del ratto. La sequenza prevede la ricostruzione della morfologia dendritica e assonale a un ingrandimento di 100 volte e dei contorni dei barili a un ingrandimento di quattro volte.

Il risultato è una ricostruzione 3D completa, che successivamente viene registrata in un riferimento standardizzato per eseguire un'analisi quantitativa delle caratteristiche morfologiche. Pertanto, la marcatura juxta somatica in vivo consente una qualità di marcatura eccezionale per una ricostruzione affidabile della completa morfologia 3D. Qui abbiamo mostrato il metodo in animali anestetizzati con uretano.

Tuttavia, le registrazioni juxtasomatiche possono essere utilizzate anche in animali svegli con la testa immobilizzata per studiare il ruolo di specifici tipi cellulari e strati durante l'esplorazione attiva dell'ambiente. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una comprensione migliore di come eseguire l'etichettatura con Biocidina su singoli neuroni per l'identificazione post mortem e la ricostruzione morfologica.