Complementazione dell'attività di splicing da parte di un complesso snRNP Galectin-3 - U1 su perline

Questo rapporto fornisce l'evidenza sperimentale per la documentazione che un complesso snRNP di galectina-3 U1 si lega al substrato di pre mRNA, forma un complesso funzionale e porta ai prodotti della reazione di splicing. Questo protocollo utilizza l'immunoselezionato snRNP galectina-3 U1 su perle accoppiate in modo covalente ad anticorpi anti-gal3 per avviare la reazione di splicing, che può progredire fino al completamento. Una fase critica del protocollo è l'attenta rimozione del liquido dopo la pellettatura delle perle contenenti il complesso snRNP galectina-3 U1 e il suo uso immediato nell'avvio della reazione di splicing.

Per esaurire gli snRNP U1 dall'estratto nucleare, incubare 200 microlitri di estratto nucleare con 100 microlitri di perle anti-U1. Aggiungere cinque microlitri di RNA nella miscela e ruotare la testa del microtubo sulla coda a quattro gradi Celsius per un'ora. Pellettare la miscela mediante centrifugazione e raccogliere il materiale non legato utilizzando una siringa Hamilton.

Dializzare l'intero volume dell'estratto nucleare impoverito di U1 insieme a un'aliquota separata di 50 microlitri dell'estratto nucleare originale non impoverito in compartimenti separati di un microdializzatore agitando per 75 minuti contro il 60% di tampone D a quattro gradi Celsius. Utilizzare una membrana per dialisi con un peso molecolare tagliato di 8K. Subito dopo la dialisi, dividere i preparati in aliquote da 20 microlitri, quindi congelarli in un bagno di etanolo con ghiaccio secco e conservarli a meno 80 gradi Celsius.

Poco prima dell'uso, lavare due volte le perle anti-gal3 con 0,5 millilitri di tampone di lavaggio TX. Per ogni lavaggio, aggiungere il tampone di lavaggio e centrifugare. Rimuovere il surnatante prima con una micropipetta e poi con una siringa di Hamilton per far uscire il liquido dalle perline.

Frazionare l'estratto nucleare con un gradiente di glicerolo compreso tra il 12% e il 32%. Combina e mescola le frazioni di gradiente di glicerolo tre, quattro e cinque che si trovano vicino alla regione 10S. Preparare due aliquote da 150 microlitri di frazioni combinate di gradiente da tre a cinque e metterle in 50 microlitri di perle anti-gal3.

In parallelo, preparare due campioni ciascuno con 150 microlitri di frazione uno e metterli in 50 microlitri di perle anti-gal3. Come controllo, inserire 150 microlitri di tampone D al 60% in 50 microlitri di perle anti-gal3. Mescolare delicatamente picchiettando i tubi, quindi ruotarli dalla testa alla coda a quattro gradi Celsius per un'ora.

Pellettare i campioni con una centrifugazione delicata. Rimuovere la maggior parte del surnatante con una micropipetta. Rimuovere il surnatante utilizzando una siringa Hamilton inserendo con cura la punta dell'ago sul fondo delle perline.

Utilizzare immediatamente le perline per le reazioni di giunzione. Assemblare la reazione di giunzione come descritto nel manoscritto del testo e aggiungerla a un set di campioni di perline. Assemblare un insieme identico di reazioni di splicing in un volume totale di 24 microlitri ma senza estratto nucleare impoverito di U1 e aggiungerlo all'altro set di perline.

Preparare una reazione di giunzione di controllo da eseguire in assenza di perle per un volume totale di 12 microlitri. Questa reazione di controllo contiene estratto nucleare, tampone D al 60% e substrato di splicing radioattivo. Mescolare delicatamente i tubi picchiettandoli e ruotarli dalla testa alla fine a 30 gradi Celsius per 90 minuti, quindi pellettare la miscela mediante centrifugazione delicata.

Arrestare la reazione ed eluire le proteine dalle perle aggiungendo 24 microlitri di tampone per campioni 2X SDS alle provette contenenti le perle e 12 microlitri di tampone per campioni 2X SDS alla provetta di controllo contenente estratto nucleare ma senza perline. Agitare ogni tubo. Scaldare i tubi a 100 gradi Celsius per sette minuti.

Centrifugare le provette a 1.000 volte G in un rotore a secchiello oscillante a temperatura ambiente per 10-15 secondi. Trasferire i surnatanti in microprovette fresche. Aggiungere 20 milligrammi per millilitro di proteinasi K per digerire e solubilizzare le proteine.

Incubare le provette a 37 gradi Celsius per 40 minuti. Dopo l'incubazione, centrifugare delicatamente le provette. Diluire le elusioni delle perle con 39,5 microlitri di TE e 10 microlitri di acetato di sodio a tre molari.

Diluire il controllo dell'estratto nucleare con 63,5 microlitri di TE e 10 microlitri di acetato di sodio. Estrarre e analizzare l'RNA come descritto nel manoscritto del testo. Estratti nucleari impoveriti di complessi snRNP U1 e snRNP Gal3 U1 dalla regione 10S del gradiente di glicerolo immunoprecipitato da anti-gal3 sono stati miscelati in una reazione di splicing.

Questa miscela di reazione conteneva snRNA U1 e la proteina specifica U1 U1-70K. Come previsto, l'anti-gal3 ha fatto precipitare gal3. L'snRNA U1, la proteina U1-70K e il gal3 non sono stati trovati nella precipitazione di controllo pre-immunitario.

Rispetto a un estratto nucleare non depletato effettuato come controllo positivo, l'estratto nucleare impoverito di U1 snRNP non ha mostrato attività di splicing. L'attività di splicing nell'estratto nucleare impoverito di U1 potrebbe essere ricostituita dal complesso snRNP gal3 U1 legato a bigelle. Sono stati trovati sia i prodotti della reazione di splicing, gli esoni legati che l'introne lariato asportato, nonché negli intermedi.

I componenti delle frazioni da tre a cinque sono stati fondamentali per ripristinare lo splicing dell'estratto nucleare impoverito di U1. Quando queste frazioni sono state sostituite dal solo tampone, non è stata osservata alcuna attività di splicing, indicando che le perle anti-gal3 non erano responsabili del ripristino dell'attività di splicing nell'estratto nucleare impoverito di U1. Più convincente, quando le frazioni da tre a cinque sono state sostituite dalla frazione uno nella procedura di immunoprecipitazione e poi aggiunte all'estratto nucleare impoverito di U1, non sono stati trovati intermedi o prodotti della reazione di splicing. Quando si tenta questo protocollo, una persona deve completare l'immunoprecipitazione mentre l'altra persona prepara la reazione di splicing con il minor ritardo possibile.

L'analisi proteomica della composizione polipeptidica della galectina-3 U1 SNRP che ripristina l'attività di splicing di un estratto nucleare impoverito di U1 sarebbe di grande interesse.