Preparazione del campione per la profilazione metabolica utilizzando la spettrometria di massa MALDI

La spettrometria di massa MALDI Imaging è un progresso unico nel campo della metabolomica che ci consente di misurare e visualizzare l'abbondanza e la distribuzione relativa dei metaboliti, che sono indicativi di organismi, condizioni fisiologiche e patologiche. Il vantaggio principale di MALDI Imaging è la sua capacità di rilevare i metaboliti in C2 senza la necessità di marcatura. A dimostrazione della procedura, abbiamo Sami Sauma, uno studente laureato del laboratorio della dottoressa Patricia Casita.

Yuki Chen e Kelly Veerasammy, studentesse ricercatrici del mio laboratorio. Dopo la raccolta, posizionare immediatamente il tessuto in una barchetta di alluminio ad azoto liquido, raffreddata, e in una scatola di polistirolo. Chiudere il coperchio della scatola di polistirolo per congelare il fazzoletto per 2-10 minuti, a seconda delle dimensioni del fazzoletto.

Quando il tessuto è sufficientemente congelato, utilizzare una pinza per rimuovere la barca e trasportare il tessuto fissato all'interno della pellicola su ghiaccio secco al criostato. Prima di sezionare il tessuto, fare attenzione a non respirare sui vetrini. Utilizzare guanti e un voltmetro impostato sulla resistenza per testare la conducibilità del numero appropriato di vetrini rivestiti di ossido di indio e stagno compatibili MALDI per l'analisi.

Dopo l'etichettatura, posizionare i vetrini su un tovagliolo di carta pulito e un criostato pulito con etanolo al 70% impostato a meno 20 gradi Celsius. Posizionare il campione di tessuto nel criostato e impostare la temperatura della camera del criostato e della testa del campione, in base al tipo di tessuto. Dopo aver lasciato equilibrare il tessuto per 30 minuti, utilizzare un composto per l'inclusione di tessuti criogenici per montare il tessuto sul mandrino.

E posizionare e bloccare una lama pulita nel tavolino, regolare la posizione del tavolino e l'angolo del campione per ottenere l'angolo di taglio desiderato. E sezionare il tessuto fino a rivelare la regione di interesse. Quando la regione desiderata è stata raggiunta, ottenere sezioni spesse da 10 a 12 micron, utilizzando un pennello pre-raffreddato per raccogliere con cura, ma rapidamente, ogni sezione sul lato etichettato di ogni vetrino man mano che vengono acquisite.

Posizionare un dito sotto le guide per riscaldare le sezioni, per garantire un montaggio sicuro sulla diapositiva. Le sezioni diventeranno trasparenti in 5-10 secondi e diventeranno opache dopo circa 30-60 secondi. Quando tutte le sezioni sono state raccolte, posizionare i vetrini nel supporto del vetrino e portare il ghiaccio secco a un dissacratore.

In alternativa, i vetrini possono essere trasportati in una scatola a vuoto. Posizionare i vetrini in un dissacratore con essiccante e asciugare sottovuoto i vetrini per 45-60 minuti. Dopo l'asciugatura, se non si utilizza immediatamente, posizionare i vetrini nel trasportatore di vetrini e riempire il carrello con azoto.

Sigillare il supporto con parafilm e posizionare il supporto in un sacchetto con cerniera. Quindi ha inserito la prima busta con cerniera in una seconda busta con cerniera etichettata contenente essiccante per una conservazione fino a 80 gradi Celsius per un massimo di sei mesi. Dopo la disidratazione, utilizzare un pennarello argentato a punta grassa per posizionare i segni X sugli spazi vuoti dei vetrini al di fuori delle sezioni di tessuto e utilizzare un pennarello nero a punta fine per posizionare una seconda X nera sopra ogni X argentata. Caricare un vetrino nel bersaglio metallico del vetrino MALDI e posizionare una copertura di plastica sul vetrino.

Delineare la posizione del campione sul coperchio di plastica e posizionare il vetrino e il target MALDI sulla superficie di uno scanner piano. Quindi visualizza l'anteprima della diapositiva e seleziona l'area desiderata. Scansiona la diapositiva in scala di grigi a 16 bit, in 2.400 punti per pollice e salva l'immagine per un uso successivo.

Per applicare la matrice ai vetrini, accendere un'unità irroratrice automatica a matrice, assicurandosi che la valvola sia posizionata al carico, e avviare il software dell'irroratrice. Verificare che la ventola di scarico funzioni correttamente e confermare nella scheda comunicazioni che il sistema stia comunicando correttamente. Avviare la pompa del solvente a 100 microlitri al minuto con una contropressione di circa 500 libbre per pollice quadrato.

E impostare il serbatoio dell'azoto a 30 libbre per pollice quadrato per avviare il flusso di aria compressa allo spruzzatore a matrice. Regolare il regolatore di pressione sulla parte anteriore dello spruzzatore a 10 libbre per pollice quadrato e impostare la temperatura dell'ugello dello spruzzatore come desiderato. Con la valvola e la posizione di carico, utilizzare la siringa per lavare l'ansa con sette millilitri di metanolo al 70% prima di riempire l'ansa con sei millilitri a matrice.

Posizionare un vetrino cieco nel supporto e nello spruzzatore, fissando entrambe le estremità per evitare movimenti e controllare che la portata e la temperatura siano stabili. Premere start per impostare la temperatura dell'ugello e per regolare la portata della pompa, in modo che corrisponda al metodo selezionato. Commutare la valvola da carico a spruzzare e fare clic su continua.

Ha permesso al sistema di funzionare fino al completamento. Al termine della deposizione, passare la valvola da spray a caricare e fare clic su continua. Esaminare il modello di codifica della matrice al microscopio.

Se si osserva uno strato uniforme di cristallo a matrice fine, depositare la matrice sui vetrini campione appropriati come appena dimostrato. Quando tutti i vetrini sono stati trattati, pulire il sistema secondo le istruzioni del produttore per evitare l'intasamento dell'ugello dello spruzzatore. Qui, vengono mostrate le immagini di output dell'analisi dei dati di MALDI MS Imaging degli spettri di scarica di massa selezionati da ogni intervallo di 100 Dalton, che descrivono chiaramente l'utilità per l'identificazione degli spettri dai metaboliti di piccole molecole ai lipidi ad alto peso molecolare.

Ogni strada raffigura le rispettive mappe di calore ionico contenenti informazioni spaziali e spettrali di una specifica specie di metabolita attraverso tre tessuti raccolti nei giorni postnatali 1, 21 e 60. Un punto di forza della metodologia MALDI MSI è la capacità di discernere la specificità di alcune specie identificate dal rapporto massa/carica rispetto alle tappe dello sviluppo o a specifiche strutture anatomiche. In questa analisi, è stato osservato che alcuni metaboliti si arricchiscono nei neonati del primo giorno postnatale o negli adulti del 60° giorno postnatale, o che sono distribuiti uniformemente tra le età testate.

È stato osservato che altre specie molecolari sono specificamente arricchite nella materia grigia, nella sostanza bianca o nel liquido cerebrospinale e nei ventricoli. È stata analizzata anche la distribuzione spaziale di metaboliti rappresentativi, tra cui l'ipoxantina, l'acido glutammico, l'acido N-acetil aspartico, l'acido arachidonico e diversi lipidi. Per mantenere la fedeltà dello stato metabolico, un'appropriata dissezione, conservazione e sezionamento del campione sono fondamentali per prevenire i cambiamenti metabolici artificiali.

Dopo aver eseguito l'esperimento MALDI, potresti voler verificare l'identità dei metaboliti che hai trovato. Ciò può essere ottenuto mediante microestrazione e cromatografia liquida tandem MS. MALDI MS Imaging facilita l'indagine basata sulla metabolomica con risoluzione spaziale e offre agli investigatori l'opportunità di accertare i dati metabolici in un mezzo quantitativo e visivo. Di recente c'è molto interesse per l'effetto della dieta nei disturbi neurodegenerativi, la relazione tra il microbioma intestinale e il cervello.

E quindi c'è stata un'enorme importanza nello studio del metabolismo nelle neuroscienze, dallo sviluppo neurologico alla neurodegenerazione. Il fatto principale dell'interazione intestino-cervello. Ed è in questo contesto che l'idea della struttura MALDI Imaging può davvero fornire tecnologie eccezionali per visualizzare l'effetto che una specifica manipolazione potrebbe avere nel cervello.