Analisi dell'espettorato a qualità controllata mediante citometria a flusso

Questo protocollo risolve le sfide comuni riscontrate con l'elaborazione dell'espettorato che hanno reso difficile in passato l'uso con la citometria a flusso per scopi diagnostici clinici ad alto rendimento. Questo protocollo è progettato per risparmiare tempo utilizzando il peso dell'espettorato per determinare i volumi di colorazione di anticorpi e coloranti. Durante l'incubazione della colorazione, il conteggio delle cellule può essere eseguito per le fasi a valle.

È importante ottenere un conteggio cellulare accurato per determinare il corretto volume di risospensione per prevenire eventuali problemi durante l'esecuzione sul citometro a flusso. Questo protocollo può fornire informazioni sulle aree di ricerca che studiano la salute dei polmoni. Ad esempio, potrebbero essere studiate malattie come la BPCO, l'asma, il cancro ai polmoni o gli effetti del COVID.

A dimostrare la procedura sarà il Dr.Michael Lai, uno scienziato di ricerca e sviluppo del mio laboratorio. Per cominciare, pesare il campione di espettorato per determinare i volumi di reagenti di dissociazione. Trasferire il campione al recipiente di dimensioni appropriate in base al peso dell'espettorato, quindi aggiungere un millilitro per grammo dello 0,5% NAC e quattro millilitri per grammo dello 0,1% DTT.

Vortice i campioni alla massima velocità per 15 secondi e oscilla alla massima velocità per 15 minuti a temperatura ambiente. Diluire questo campione con soluzione salina bilanciata 4X Hanks o HBSS per neutralizzare il NAC e il DTT. E dopo un rapido vortice, scuotere il campione a temperatura ambiente per cinque minuti.

Filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare a rete di nylon da 100 micrometri in uno o più tubi centrifughici conici da 50 millilitri per creare una sospensione a cella singola. Pellet giù per le celle. Dopo aver aspirato il surnatante, combinare i pellet in un tubo conico da 15 millilitri e lavare con HBSS nelle stesse condizioni.

Risospesso il pellet cellulare in un volume di tampone determinato dal peso iniziale del campione di espettorato. Prendere un'aliquota dalla sospensione cellulare e mescolare 10 microlitri della diluizione dell'espettorato con 30 microlitri di blu tripano allo 0,4%, quindi caricare nelle camere di conteggio di un emocitometro per un conteggio delle cellule vive / morte. Etichettare l'espettorato nei tubi di compensazione.

Aggiungere l'anticorpo HBSS e il colorante a ciascun tubo cellulare dell'espettorato e ai tubi di compensazione come indicato nel testo. Aggiungere le cellule dell'espettorato ai tubi di analisi e aggiungere perline di compensazione ai tubi di compensazione come menzionato nel testo. Incubare tutti i tubi sul ghiaccio protetti dalla luce per 35 minuti.

Quindi, dopo aver riempito i tubi con HBSS ghiacciato, centrifugare a quattro gradi Celsius per 10 minuti a 800 volte G.Per i tubi di compensazione, aspirare il surnatante il più vicino possibile al pellet e far scorrere il pellet per allentare. Quindi, aggiungere 0,5 millilitri di HBSS freddo ai tubi di compensazione e conservare i tubi sul ghiaccio in un'area protetta dalla luce fino a quando non è necessario per l'analisi della citometria a flusso. Quindi aspirare il surnatante dall'espettorato non macchiato, dall'isotipo, dal sangue e dai tubi epiteliali.

Allentare i pellet facendo scorrere i tubi. Aggiungere due millilitri di 1% PFA ai tubi non macchiati e isotipici e 10 millilitri ai tubi del sangue e dell'epitelio. Incubare i tubi sul ghiaccio in modo protetto dalla luce per 30 minuti, quindi ruotare rapidamente alla massima velocità e incubare di nuovo per altri 30 minuti.

Quindi riempire i tubi con HBSS ghiacciato. Successivamente, centrifugare i tubi a quattro gradi Celsius per 10 minuti a 1.600 volte G.Aspirare il più possibile surnatante senza disturbare il pellet cellulare e far scorrere il tubo con le dita per allentare le cellule, quindi aggiungere 200 microlitri di HBSS freddo ai tubi non macchiati e isotipi. Calcolare e aggiungere il volume richiesto di HBSS per la risospensione del sangue e del tubo epiteliale in base al numero totale di cellule.

Conservare tutti i campioni in provette di compensazione protette dalla luce sul ghiaccio a quattro gradi Celsius fino all'esecuzione dell'analisi citometrica a flusso. Applicare procedure di avvio appropriate per il citometro a flusso utilizzato. Utilizzare la miscela di perline del National Institute of Standards and Technology o del NIST per garantire che le tensioni di dispersione diretta e di dispersione laterale siano impostate per posizionare le perle NIST per coprire la trama senza posizionare le perline troppo vicino agli assi.

Impostare la portata su media per LSRII o alta per Navios EX. Regolare le tensioni per ciascun parametro utilizzato per i parametri scatter e fluorescenti per posizionare le popolazioni cellulari su scala. Usa le figure con la strategia di gating come guida per regolare le tensioni di conseguenza. Acquisire prima i dati per il campione di espettorato non macchiato, seguito dal campione colorato con isotipo, quindi dalla sonda sanguigna e dalla tuba epiteliale.

Il peso dell'espettorato è stato utilizzato per determinare i volumi di anticorpi o coloranti per la colorazione. La correlazione tra peso dell'espettorato e resa cellulare non era forte. I campioni di espettorato sono stati divisi in quattro categorie di peso, che si sono raggruppate nella distribuzione della resa cellulare.

Ogni anticorpo utilizzato è stato titolato in una concentrazione nella fase di plateau con il più alto indice di colorazione è stato scelto come concentrazione di lavoro. In tutte le categorie di peso, la contaminazione media da SEC era inferiore al 20% con la percentuale di cellule vitali mostrate. Viene presentata la strategia di gating utilizzata per l'analisi.

Le perle del NIST sono state utilizzate per impostare un cancello che è stato applicato al campione di espettorato per eliminare i detriti. Piccoli detriti sono stati ulteriormente eliminati dal cancello largo. Il colorante di vitalità è stato utilizzato per eliminare le cellule morte, mentre il cancello del singoletto ha rimosso i doppietti.

L'etichettatura degli anticorpi anti-CD45 ha permesso la separazione di singole cellule espettorato vive in una cellula del sangue e in un compartimento non di cellule del sangue. I profili ottenuti da Navios EX, LSRII e Lyric sono stati confrontati. Viene mostrata la strategia di gating per eliminare i detriti, le cellule morte, i doppietti e confrontare i profili di sangue e non sangue.

Questa tecnica ci ha permesso di applicare questi metodi per rilevare il rischio di cancro al polmone da utilizzare come test clinico non invasivo.