Analisi dell'espettorato a qualità controllata mediante citometria a flusso
9 agosto 2021
Questo protocollo descrive un metodo efficace per dissociare l'espettorato in una sospensione a singola cellula e la successiva caratterizzazione di sottoinsiemi cellulari su piattaforme citometriche a flusso standard.
Questo protocollo risolve le sfide comuni riscontrate con l'elaborazione dell'espettorato che hanno reso difficile in passato l'uso con la citometria a flusso per scopi diagnostici clinici ad alto rendimento. Questo protocollo è progettato per risparmiare tempo utilizzando il peso dell'espettorato per determinare i volumi di colorazione di anticorpi e coloranti. Durante l'incubazione della colorazione, il conteggio delle cellule può essere eseguito per le fasi a valle.
È importante ottenere un conteggio cellulare accurato per determinare il corretto volume di risospensione per prevenire eventuali problemi durante l'esecuzione sul citometro a flusso. Questo protocollo può fornire informazioni sulle aree di ricerca che studiano la salute dei polmoni. Ad esempio, potrebbero essere studiate malattie come la BPCO, l'asma, il cancro ai polmoni o gli effetti del COVID.
A dimostrare la procedura sarà il Dr.Michael Lai, uno scienziato di ricerca e sviluppo del mio laboratorio. Per cominciare, pesare il campione di espettorato per determinare i volumi di reagenti di dissociazione. Trasferire il campione al recipiente di dimensioni appropriate in base al peso dell'espettorato, quindi aggiungere un millilitro per grammo dello 0,5% NAC e quattro millilitri per grammo dello 0,1% DTT.
Vortice i campioni alla massima velocità per 15 secondi e oscilla alla massima velocità per 15 minuti a temperatura ambiente. Diluire questo campione con soluzione salina bilanciata 4X Hanks o HBSS per neutralizzare il NAC e il DTT. E dopo un rapido vortice, scuotere il campione a temperatura ambiente per cinque minuti.
Filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare a rete di nylon da 100 micrometri in uno o più tubi centrifughici conici da 50 millilitri per creare una sospensione a cella singola. Pellet giù per le celle. Dopo aver aspirato il surnatante, combinare i pellet in un tubo conico da 15 millilitri e lavare con HBSS nelle stesse condizioni.
Risospesso il pellet cellulare in un volume di tampone determinato dal peso iniziale del campione di espettorato. Prendere un'aliquota dalla sospensione cellulare e mescolare 10 microlitri della diluizione dell'espettorato con 30 microlitri di blu tripano allo 0,4%, quindi caricare nelle camere di conteggio di un emocitometro per un conteggio delle cellule vive / morte. Etichettare l'espettorato nei tubi di compensazione.
Aggiungere l'anticorpo HBSS e il colorante a ciascun tubo cellulare dell'espettorato e ai tubi di compensazione come indicato nel testo. Aggiungere le cellule dell'espettorato ai tubi di analisi e aggiungere perline di compensazione ai tubi di compensazione come menzionato nel testo. Incubare tutti i tubi sul ghiaccio protetti dalla luce per 35 minuti.
Quindi, dopo aver riempito i tubi con HBSS ghiacciato, centrifugare a quattro gradi Celsius per 10 minuti a 800 volte G.Per i tubi di compensazione, aspirare il surnatante il più vicino possibile al pellet e far scorrere il pellet per allentare. Quindi, aggiungere 0,5 millilitri di HBSS freddo ai tubi di compensazione e conservare i tubi sul ghiaccio in un'area protetta dalla luce fino a quando non è necessario per l'analisi della citometria a flusso. Quindi aspirare il surnatante dall'espettorato non macchiato, dall'isotipo, dal sangue e dai tubi epiteliali.
Allentare i pellet facendo scorrere i tubi. Aggiungere due millilitri di 1% PFA ai tubi non macchiati e isotipici e 10 millilitri ai tubi del sangue e dell'epitelio. Incubare i tubi sul ghiaccio in modo protetto dalla luce per 30 minuti, quindi ruotare rapidamente alla massima velocità e incubare di nuovo per altri 30 minuti.
Quindi riempire i tubi con HBSS ghiacciato. Successivamente, centrifugare i tubi a quattro gradi Celsius per 10 minuti a 1.600 volte G.Aspirare il più possibile surnatante senza disturbare il pellet cellulare e far scorrere il tubo con le dita per allentare le cellule, quindi aggiungere 200 microlitri di HBSS freddo ai tubi non macchiati e isotipi. Calcolare e aggiungere il volume richiesto di HBSS per la risospensione del sangue e del tubo epiteliale in base al numero totale di cellule.
Conservare tutti i campioni in provette di compensazione protette dalla luce sul ghiaccio a quattro gradi Celsius fino all'esecuzione dell'analisi citometrica a flusso. Applicare procedure di avvio appropriate per il citometro a flusso utilizzato. Utilizzare la miscela di perline del National Institute of Standards and Technology o del NIST per garantire che le tensioni di dispersione diretta e di dispersione laterale siano impostate per posizionare le perle NIST per coprire la trama senza posizionare le perline troppo vicino agli assi.
Impostare la portata su media per LSRII o alta per Navios EX. Regolare le tensioni per ciascun parametro utilizzato per i parametri scatter e fluorescenti per posizionare le popolazioni cellulari su scala. Usa le figure con la strategia di gating come guida per regolare le tensioni di conseguenza. Acquisire prima i dati per il campione di espettorato non macchiato, seguito dal campione colorato con isotipo, quindi dalla sonda sanguigna e dalla tuba epiteliale.
Il peso dell'espettorato è stato utilizzato per determinare i volumi di anticorpi o coloranti per la colorazione. La correlazione tra peso dell'espettorato e resa cellulare non era forte. I campioni di espettorato sono stati divisi in quattro categorie di peso, che si sono raggruppate nella distribuzione della resa cellulare.
Ogni anticorpo utilizzato è stato titolato in una concentrazione nella fase di plateau con il più alto indice di colorazione è stato scelto come concentrazione di lavoro. In tutte le categorie di peso, la contaminazione media da SEC era inferiore al 20% con la percentuale di cellule vitali mostrate. Viene presentata la strategia di gating utilizzata per l'analisi.
Le perle del NIST sono state utilizzate per impostare un cancello che è stato applicato al campione di espettorato per eliminare i detriti. Piccoli detriti sono stati ulteriormente eliminati dal cancello largo. Il colorante di vitalità è stato utilizzato per eliminare le cellule morte, mentre il cancello del singoletto ha rimosso i doppietti.
L'etichettatura degli anticorpi anti-CD45 ha permesso la separazione di singole cellule espettorato vive in una cellula del sangue e in un compartimento non di cellule del sangue. I profili ottenuti da Navios EX, LSRII e Lyric sono stati confrontati. Viene mostrata la strategia di gating per eliminare i detriti, le cellule morte, i doppietti e confrontare i profili di sangue e non sangue.
Questa tecnica ci ha permesso di applicare questi metodi per rilevare il rischio di cancro al polmone da utilizzare come test clinico non invasivo.
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Panoramica
Questo protocollo risolve le comuni difficoltà riscontrate nella lavorazione dell'espettorato, facilitandone l'uso in citometria a flusso per diagnosi cliniche ad alto rendimento. Si sottolinea l'importanza di un conteggio cellulare accurato e di un volume di risospensione preciso per un'analisi riuscita mediante citometria a flusso.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Citometria in flusso
- Biologia cellulare
- Ricerca sulla salute polmonare
Sfondo
- La lavorazione dell'espettorato ha storicamente presentato difficoltà per la citometria a flusso.
- Il conteggio accurato delle cellule è fondamentale per un'analisi efficace.
- Le aree di ricerca includono la BPCO, l'asma, il cancro del polmone e il COVID-19.
- Questo protocollo mira a semplificare l'analisi dell'espettorato per la diagnostica clinica.
Scopo dello studio
- Fornire un metodo efficiente per dissociare l'espettorato in una sospensione di singole cellule.
- Caratterizzare i sottoinsiemi cellulari utilizzando piattaforme standard di citometria a flusso.
- Potenziare la ricerca sulla salute polmonare e sulle malattie correlate.
Metodi Utilizzati
- Determinazione dei volumi di colorazione con anticorpi e coloranti in base al peso dell'espettorato.
- Esecuzione del conteggio cellulare durante l'incubazione della colorazione.
- Utilizzo della citometria a flusso per l'analisi successiva.
- Caratterizzazione dei sottogruppi cellulari per ottenere informazioni di ricerca.
Risultati principali
- Il protocollo dissocia con successo l'espettorato in sospensioni cellulari singole.
- Vengono ottenuti conteggi cellulari accurati, facilitando una efficace citometria a flusso.
- Fornisce informazioni dettagliate sullo stato di salute del polmone e sui meccanismi delle malattie.
- Il processo ottimizzato migliora le capacità diagnostiche cliniche.
Conclusioni
- Questo protocollo offre un metodo affidabile per l'analisi dell'espettorato.
- Permette di superare le difficoltà precedenti nella lavorazione dell'espettorato per la citometria a flusso.
- I risultati sostengono ulteriori ricerche sulle malattie correlate ai polmoni.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo protocollo affronta un collo di bottiglia fondamentale nella ricerca sulle malattie polmonari, consentendo un'analisi quantitativa ad alto rendimento dell'espettorato mediante citometria in flusso. Trasforma un metodo citologico tradizionalmente a basso rendimento e ad alto impegno di manodopera in una piattaforma scalabile e riproducibile, adatta alla scoperta di biomarcatori e alla validazione di bersagli terapeutici in campo respiratorio. L'approccio consente una riduzione del rischio di natura meccanicistica fornendo una risoluzione immunofenotipica delle linee ematopoietiche ed epiteliali, escludendo al contempo detriti interferenti e cellule epiteliali squamose.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi dell'eterogeneità cellulare nel microambiente polmonare per convalidare bersagli terapeutici in percorsi infiammatori e oncologici.
- Valore operativo: Riduce la dipendenza da personale citopatologo specializzato grazie a un fenotipaggio automatizzato e standardizzato.
- Valore predittivo: Supporta la fiducia nei bersagli quantificando l'infiltrazione delle cellule immunitarie e gli stati di attivazione epiteliale rilevanti per BPCO, asma, cancro del polmone e patologie polmonari post-COVID.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera letture quantitative e multiparametriche delle popolazioni CD45+ e CD45− per la standardizzazione dei saggi in campagne di screening farmacologico.
- Valore operativo: Consente l'elaborazione di campioni ad alta produttività mediante normalizzazione dei reagenti basata sul peso, migliorando la riproducibilità tra diversi siti e operatori.
- Riutilizzo della piattaforma: Compatibilità dimostrata su citometri Navios EX, LSR II e Lyric, supportando il trasferimento del saggio tra piattaforme e l'utilizzo centralizzato nei laboratori core.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore traslazionale: Utilizza l'identificazione di macrofagi specifici del polmone come controllo di qualità per confermare l'origine del campione, aumentando la fiducia nella continuità preclinica-clinica.
- De-risking meccanicistico: Permette il monitoraggio longitudinale di modifiche immunitarie ed epiteliali nei modelli di malattia, supportando decisioni di avanzamento o interruzione nell'ottimizzazione del composto leader.
- Conferma predittiva: Fornisce un quadro pronto per biomarcatori per valutare il legame al bersaglio nell'infiammazione polmonare o nella modulazione del microambiente tumorale.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso dalla scoperta alla fase preclinica, consentendo un'analisi immunologica standardizzata di campioni derivati dai polmoni, sostenendo la verifica di ipotesi nella fase iniziale di scoperta e la validazione meccanicistica nelle fasi precliniche.
- Biologia della scoperta: Favorisce l'esplorazione basata su ipotesi dei paesaggi immunitari polmonari e delle interazioni stromali in modelli di malattia.
- Screening: Fornisce letture cellulari quantitative e riproducibili, adatte allo screening di librerie di composti e saggi di interazione con il bersaglio.
- Analisi: Genera dati di citometria a flusso multiparametrica che consentono il confronto statistico degli effetti dei trattamenti tra gruppi sperimentali.
- Ricerca traslazionale: Supporta l'allineamento di biomarcatori attraverso un gating specifico per linea cellulare ed esclusione basata sulla vitalità di cellule non vitali o contaminanti.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce un flusso di lavoro standardizzato e normalizzato per il peso, che può essere implementato in più sedi e su diverse piattaforme strumentali per una generazione di dati coerente.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione del bersaglio riducendo il rumore derivante da detriti e contaminazione da cellule epiteliali squamose.
- Valore operativo: Migliora la produttività e la riproducibilità grazie alla somministrazione di reagenti basata sul peso dell'espettorato e a strategie di selezione standardizzate.
- Valore strategico: Permette decisioni più rapide e basate sui dati riguardo al proseguimento o meno dei programmi farmacologici respiratori, fornendo fenotipi immunitari ed epiteliali quantificabili.
- Impatto sul portafoglio: Favorisce l'avanzamento con rischio calibrato generando dati su biomarcatori traslabili a partire da campioni polmonari non invasivi.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella compensazione della citometria a flusso, nell'impostazione delle finestre di analisi (gating) e nell'immunofenotipizzazione di cellule umane primarie.
- Dipende dall'accesso a citometri a flusso dotati di adeguata rilevazione della fluorescenza e risoluzione della diffusione della luce.
- Necessita della standardizzazione dei protocolli di marcatura e delle metriche di controllo qualità (ad esempio, normalizzazione con microsfere NIST) tra diversi siti.
- Richiede l'adattamento dei pannelli di anticorpi in base alla biologia dell'obiettivo, mantenendo al contempo la vitalità cellulare e il gating su cellule singole.
- È limitato dalla qualità del campione e dalla viscosità dell'espettorato, che possono influenzare l'efficienza di dissociazione e il rendimento cellulare.
