Immagine a base di Citometria a flusso Tecnica per valutare le variazioni Granulocyte Funzione In Vitro

L'obiettivo generale di questa procedura è valutare la funzione dei granulociti come approccio a due parametri. Ciò si ottiene incubando prima i granulociti dai campioni di sangue dei pazienti con particelle biologiche e reagenti per visualizzare l'esplosione ossidativa. Nella seconda fase, la fagocitosi post-incubazione viene bloccata, quindi i recettori di superficie cellulare di interesse vengono marcati per consentire l'identificazione positiva dei granulociti.

Infine, i sottogruppi di granulociti attivati possono essere identificati e isolati mediante citometria a flusso basata su immagini. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della nutrizione o dell'immunologia clinica, come ad esempio il modo in cui le abitudini alimentari e le pratiche nutrizionali contribuiscono alle alterazioni e alla funzione dei granulociti. A dimostrare questa procedura sarà Eric Prado, uno studente di dottorato del mio laboratorio.

Dopo aver ottenuto lo scongelamento del campione di sangue periferico, le bioparticelle SIU e il DHE a temperatura ambiente e l'etilmalamed in un bagno B a 37 gradi Celsius, quando i reagenti si sono scongelati, aggiungere 20 microlitri di bioparticelle SSUS a quattro provette singole da 1,2 millilitri all'interno di una cappa sterile. Quindi aggiungere 40 microlitri di DHE scongelato a ciascuna provetta contenente le particelle biologiche e picchiettare delicatamente le provette sul banco per raccogliere il reagente sul fondo delle provette. Dopo aver aggiunto 100 microlitri di sangue intero misto a ciascuna provetta, rimuovere il sangue contaminante lungo il bordo interno delle provette con un applicatore di cotone e mescolare il sangue e i reagenti con un set di pipette elettroniche per tre cicli.

Dopo il terzo ciclo, posizionare tutti i tubi in un secchiello per il ghiaccio al riparo dalla luce. Quindi incubare le provette per 10, 20 o 40 minuti in un bagno di velocità a 37 gradi Celsius, iniziando con la provetta da 40 minuti per assicurarsi che tutte le incubazioni finiscano contemporaneamente. Al termine delle incubazioni, erogare 15 microlitri di malamed di etile in ciascuna delle provette.

Dopo 30 minuti, incubare le cellule con 10 microlitri ciascuno degli anticorpi appropriati. Dopo un'ora di ulteriore incubazione delle cellule in 750 microlitri di soluzione per pidocchi dei globuli rossi fissata per globuli bianchi. Dopo un'altra ora, centrifugare le cellule per incubazione e aspirare sotto vuoto il surnatante, lasciando un volume di fluido residuo di 100 microlitri sopra il pellet cellulare.

A questo punto, aggiungere a ciascun campione 10 microlitri di sette A d appena diluiti, 50 microlitri di PBS e 25 microlitri di microsfere di calibrazione. Quindi tappare i tubi, avvolgerli in un foglio di alluminio e conservarli a quattro gradi Celsius. Quando il citometro a flusso a immagini è pronto, eseguire ogni provetta del campione raccogliendo un minimo di 3000 eventi ULU utilizzando parametri predefiniti per analizzare i campioni.

Utilizzare la procedura guidata di compensazione software automatizzata del software IDEA per applicare una matrice di compensazione ai file di immagine grezzi e per creare file di immagine compensati. Quindi caricare i singoli file CIF nel software IDEA e generare i seguenti grafici per identificare i sottogruppi di granulociti per ciascun campione di paziente. Utilizzando prima il controllo non stimolato come standard di riferimento, utilizzare l'istogramma del quadratico medio della radice del gradiente di campo chiaro per stabilire i gate iniziali e identificare le celle che sono state considerate a fuoco.

Quindi, per separare le cellule singoletto dai detriti e dai doppietti, creare un grafico a punti del rapporto d'aspetto del campo chiaro rispetto all'area del campo chiaro. Una volta identificata una popolazione pulita di cellule, stabilire un dot plot di CD 45 rispetto a CD 66 B.To identificare positivamente i granulociti CD 45 positivi CD 66 B positivi. Infine, crea un grafico a punti dell'intensità dei dettagli luminosi per l'aureo rispetto all'intensità dei dettagli luminosi per l'esplosione ossidativa.

Per identificare i sottoinsiemi dei granulociti attivati che raccolgono le immagini in campo chiaro nei canali uno e nove, le particelle bio nel canale tre, il DHE nel canale quattro, i sette a d nel canale cinque, il CD 66 B nel canale 11 e il CD 45 nel canale 12, è possibile generare anche una sovrapposizione a due colori che raffigura eventi combinati di DHE e bioparticelle. Utilizzando la citometria a flusso basata su immagini, una popolazione omogenea di granulociti attivati può essere separata in tre diversi sottogruppi di attivazione. Con questo metodo, il modo più efficace per risolvere i tre sottoinsiemi è tracciare l'intensità dei dettagli luminosi per la fagocitosi rispetto al burst ossidativo.

L'ulteriore utilizzo della procedura guidata di colocalizzazione nel software IDEAS consente di quantificare la presenza della simultanea fagocitosi e burst ossidativo dei granulociti, segno distintivo di elevata attivazione. Inoltre, in questo esperimento, il periodo di incubazione di 40 minuti ha dimostrato la massima percentuale di granulociti altamente attivi. Pertanto, l'inclusione di almeno tre periodi di incubazione nel protocollo facilita la determinazione di come un determinato trattamento clinico possa alterare lo stato di attivazione temporale dei granulociti.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come i saggi multiplex basati su microsfere, per rispondere a ulteriori domande. Ad esempio, come cambia la produzione di chemochine nei granulociti nel supinato in seguito all'esposizione a bioparticelle?