Name: Amputazione e rigenerazione delle cifre del mouse adulto: un modello semplice per indagare sulla formazione del Blastema mammario e sullossificazione intramembranosa (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Scopri l'amputazione della falange terminale nel topo adulto per studiare la formazione del blastema e l'ossificazione intramembranosa. Questo modello preclinico permette di analizzare i meccanismi rigenerativi mammiferi.

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Ringraziamo i membri del Muneoka Lab e del Texas Institute for Genomic Medicine (TIGM). Questo lavoro è stato supportato dalla Texas A&M University.

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<li>Ilizarov, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tension-stress+effect+on+the+genesis+and+growth+of+tissues.+Part+I.+The+influence+of+stability+of+fixation+and+soft-tissue+preservation%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Orthopaedics+And+Related+Research%22%5BJournal%5D)">The tension-stress effect on the genesis and growth of tissues. Part I. The influence of stability of fixation and soft-tissue preservation.</a> Clinical Orthopaedics And Related Research. (238), 249-281 (1989).</li>
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<li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SDF-1alpha%2FCXCR4+signaling+mediates+digit+tip+regeneration+promoted+by+BMP-2%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">SDF-1alpha/CXCR4 signaling mediates digit tip regeneration promoted by BMP-2.</a> Developmental Biology. 382, 98-109 (2013).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo protocollo descrive una procedura standardizzata di amputazione P3 del topo adulto, colorazione immunohistochimica fluorescente per visualizzare e analizzare la formazione di blastema e l'ossificazione intramembranosa, e la scansione sequenziale in-vivo identificare i cambiamenti morfologici ossei, di volume e di lunghezza dopo l'amputazione. L'amputazione P3 è un modello unico, proceduralmente semplice e riproducibile per analizzare un ambiente di ferite pro-rigenerativo che innesca la formazione di blastema. Ino...

I mammiferi, compresi gli esseri umani e i topi, hanno la capacità di rigenerare le punte delle loro cifre dopo l'amputazione distale della falange terminale (P3)1,2,3. Nei topi, la risposta di rigenerazione è dipendente dal livello di amputazione; amputazioni a cifre sempre più prossimal mostrano una risposta rigenerativa progressivamente attenuata fino al completo fallimento rigenerativo alle amputazioni che trasmettono e proximal alla matrice di unghie P34,5,6 , 7 (in questo stato , 8. La rigenerazione P3 è mediata dalla formazione di un blastema, definito come una popolazione di cellule proliferanti che subiscono la morfogenesi per rigenerare le strutture amputate9. La formazione di un blastema per rigenerare le strutture perse dall'amputazione, un processo chiamato rigenerazione epimorfica, distingue la risposta di rigenerazione P3 multi-livello tissutale dalla riparazione tradizionale dei tessuti dopo la lesione6, 10.La rigenerazione P3 è un modello riproducibile e procedurale semplice per studiare complessi processi rigenerativi tra cui la guarigione delle ferite11,12, istolisi ossea11,12, vascellizzazione13, rigenerazione del nervo periferico14, e conversione blastemica in osso tramite ossificazione intramembranosa15.
Studi precedenti che utilizzano l'immunosintochimica hanno dimostrato che il blastema è eterogeneo, avascolare, ipossico e altamente proliferante11,13,15,16. A seguito dell'amputazione dissatsale del P3, il blastema primitivo è inizialmente associato al periosteo P3 e all'endosteo ed è caratterizzato da una robusta proliferazione e osteogenesi nascente adiacente alla superficie ossea15. Dopo la degradazione ossea e la chiusura della ferita, il blastema eterogeneo è formato dalla fusione di cellule associate al periosteal ed endosteal, seguito dalla differenziazione dei componenti blastemale, tra cui l'osso attraverso l'ossificazione intramembrana 15.
La riparazione ossea in risposta a lesioni avviene tipicamente per ossificazione endocondrale, cioè tramite un callo cartilagineo iniziale che forma un modello per la successiva formazione ossea17,18. L'ossificazione intramembranosa dell'osso lungo, cioè la formazione ossea senza un intermedio cartilagineo, è comunemente indotta utilizzando complessi dispositivi di distrazione o fissazione chirurgica19,20. La risposta alla rigenerazione numerica è un modello preclinico che offre vantaggi rispetto ai modelli convenzionali di osssificazione intramembranous: 1) non richiede lesioni post post di fissaggio esterne o interne per stimolare l'ossificazione intramembrana, 2) è l'analisi sequenziale in vivo della tomografia microcalcolata (CT) può essere eseguita con facilità e velocità utilizzando 4 cifre, massimizzando così i campioni riducendo al minimo l'uso di animali e l'analisi sequenziale della tomografia microcalcolata in vivo (CT) può essere eseguita con facilità e velocità.
Nel presente studio, mostriamo il piano standardizzato di amputazione P3 per ottenere una risposta di rigenerazione riproducibile e robusta. Inoltre, dimostriamo un protocollo di immunohistochimica a fluorescenza ottimizzato utilizzando sezioni di paraffina per visualizzare la formazione di blastema, la rivascolarizzazione nel contesto della rigenerazione e la conversione blastemica in osso tramite intramembranous Ossificazione. Dimostriamo anche l'uso di una tasie-invivo sequenziale per identificare i cambiamenti nella morfologia ossea, nel volume e nella lunghezza nella stessa cifra nel corso della rigenerazione. L'obiettivo di questo protocollo è quello di studiare la formazione di blastema mammifero dopo l'amputazione e di dimostrare 2 tecniche, immunohistochimica a fluorescenza e in vivo in vivo sequenziale, per lo studio della rigenerazione ossea intramembrana.

<table><tbody><tr><td>Siero a blocchi proteici senza</td><td>DAKO</td><td>X0909</td><td>Pronto all'uso</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-PCNA di topo</td><td>Abcam</td><td>ab29</td><td>Diluizione 1:2000</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-CXCR4 di ratto</td><td>R& D Systems</td><td>MAB21651</td><td>diluizione 1:500</td></tr><tr><td>Anticorpo vWF XIII di coniglio</td><td>DAKO</td><td>A0082</td><td>Diluizione 1:800</td></tr><tr><td>Anti-osterix di coniglio, anticorpo SP7</td><td>Abcam</td><td>ab22552</td><td>diluizione 1:400</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-Runx2 di coniglio</td><td>Sigma-Aldrich Co.</td><td>HPA022040</td><td>Diluizione 1:250</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647-capra coniugata anti-topo IgG (H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>A21235</td><td>Diluizione 1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-capra coniugata anti-coniglio IgG (H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td>Diluizione 1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568-capra coniugata anti-ratto IgG (H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>A11077</td><td>Diluizione 1:500</td></tr><tr><td>Prolong Gold reagente</td> <td>anti-dissolvenzaInvitrogen</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Decalicificatore Surgipath</td> pronto all'uso 1 <td>Leica Biosystems</td><td>3800400</td><td>Pronto all'uso</td></tr><tr><td>Z-Fix, Fissativo acquoso in formalina di zinco tamponato</td><td>Anatech LTD</td><td>174</td><td>Pronto all'uso</td></tr><tr><td>CD-1 Femmina di topo</td><td>Envigo</td><td>ICR(CD-1)</td><td>VivaCT 40 SCANCO</td></tr><tr><td></td><td>Medical</td><td></td><td></td></tr> di 8-12 settimane</tbody></table>

amputazione e rigenerazione delle cifre del mouse adulto: un modello semplice per indagare sulla formazione del blastema mammario e sull'ossificazione intramembranosa

Adult Mouse Digit Amputation and Regeneration: A Simple Model to Investigate Mammalian Blastema Formation and Intramembranous Ossification

Qui, presentiamo un protocollo di amputazione terminale distale distale adulto (P3), un modello di mammifero procedurale semplice e riproducibile di rigenerazione epimorfica, che coinvolge la formazione di blastema e l'ossificazione intramembrana analizzata da immunohistochimica a fluorescenza e tomografia microcalcolata in vivo sequenziale (CT). La rigenerazione dei mammiferi è limitata alle amputazioni che trasmettono la regione distale della falange terminale (P3); le cifre amputate a livelli più prossimali non riescono a rigenerare e a subire la guarigione fibrotica e la formazione di cicatrici. La risposta di rigenerazione è mediata dalla formazione di un blastema proliferante, seguita dalla rigenerazione ossea tramite ossificazione intramembranosa per ripristinare la lunghezza scheletrica amputata. L'amputazione P3 è un modello preclinico per studiare la rigenerazione epimorfica nei mammiferi ed è un potente strumento per la progettazione di strategie terapeutiche per sostituire la guarigione fibrotica con una risposta rigenerativa di successo. Il nostro protocollo utilizza l'immunohistochimica a fluorescenza a 1) identificare le popolazioni di cellule di blastema precoce e tardiva, 2) studiare la rivascolarizzazione nel contesto della rigenerazione, e 3) studiare l'ossificazione intramembranosa senza la necessità di ossa complesse dispositivi di stabilizzazione. Dimostriamo anche l'uso di immagini sequenziali in vivo per creare immagini ad alta risoluzione per esaminare i cambiamenti morfologici dopo l'amputazione, nonché quantificare i cambiamenti di volume e lunghezza nella stessa cifra nel corso della rigenerazione. Crediamo che questo protocollo offra un'enorme utilità per studiare le risposte epimorfiche e rigenerative dei tessuti nei mammiferi.

I topo adulti che rigenerano le cifre P3 a 6/7 DPA (Figura 2A-D),9 DPA (Figura 2E-H)e 10 DPA (Figura 2I-L) sono stati immunostainse con anticorpi a Runx2, OSX e PCNA per visualizzare l'osso intramembranoso rigenerazione e immunostaincato con anticorpi a CXCR4 e vWF per visualizzare la formazione di blastema. I rendering di cFR rappresentativi delle cifre scansionate prima dell'amput...

Qui, presentiamo un protocollo di amputazione della falange terminale dei topi adulti per studiare la formazione di blastema mammifero e l'ossificazione intramembranosa, analizzata dall'immunohistochimica fluorescente e dalla tomografia microcalcolata in vivo sequenziale.

Amputazione e rigenerazione delle cifre del mouse adulto: un modello semplice per indagare sulla formazione del Blastema mammario e sull'ossificazione intramembranosa

Here, we present a protocol of adult mouse distal terminal phalanx (P3) amputation, a procedurally simple and reproducible mammalian model of epimorphic ...

L'amputazione P3 è un modello preclinico per lo studio della rigenerazione epimorfa dei mammiferi e un potente strumento per identificare le popolazioni cellulari critiche e i meccanismi che controllano la rigenerazione endogena. Il modello P3 consente l'identificazione delle popolazioni di cellule blastemali precoci e tardive, lo studio della rivascolarizzazione durante la rigenerazione e lo studio dell'ossificazione intramembranosa senza complessi requisiti del dispositivo di stabilizzazione ossea. A dimostrare la procedura con me saranno Osama Qureshi, Alyssa Falck e Katherine Zimmel, tecnico, e Regina Brunaeur, un assistente di ricerca professore tutto del nostro laboratorio.Dopo aver confermato una mancanza di risposta al dito del dito in un mouse CD-1 di otto-12 settimane, applicare un unguento agli occhi dell'animale e posizionare il mouse sotto un microscopio a dissezione 10X. Utilizzare iodio povidone chirurgico e 70%etanolo per sterilizzare le cifre di ogni arto posteriore e utilizzare microscissori per tagliare i capelli lontano dal sito chirurgico. Applicare localmente un microlitro di bupivacaina topica per anestetizzare il sito chirurgico e svasare delicatamente una zampa posteriore per esporre la superficie della cifra mediale.Quindi tenendo il bisturi ad un angolo parallelo al cuscinetto grasso, utilizzare un bisturi sterile numero 10 per amputare la punta distale della falange terminale delle cifre due e quattro. Applicare localmente un microlitro aggiuntivo di bupivacaina su ogni cifra amputata e riportare il mouse in una gabbia pulita per consentire alle ferite di guarire senza medicazione della ferita e con monitoraggio fino alla piena reclinabilità. Per garantire un piano di amputazione P3 di successo, tenere il bisturi parallelo al cuscinetto grasso durante l'amputazione ed eseguire la scansione micro-CT per confermare la corretta lunghezza di amputazione.All'endpoint sperimentale appropriato, utilizzare un bisturi per ertare la cifra a metà della falange centrale all'indentazione approssimativamente del secondo cuscinetto di grasso ventrale. Trasferire il tessuto in una fiala a scintillazione da 20 millilitri contenente 10 millilitri di zinco fresco tamponato formalina fissante per 24-48 ore. E utilizzare un microtomo per acquisire sezioni spesse da quattro a cinque micrometri di ogni cifra, posizionando le fette in un bagno d'acqua da 38 a 41 gradi Celsius integrato con una soluzione adesiva istologica man mano che si ottengono.Quindi catturare le fette su diapositive adesive e posizionare le diapositive su uno scivolo Celsius di 37 gradi per asciugare. Quando le diapositive sono state deparaffinizzate immergere i campioni in un barattolo di colorazione di un'appropriata soluzione di recupero dell'antigene e riscaldare le diapositive a 95 gradi Celsius per 25 minuti assicurandosi che l'ebollizione non si verifichi. Alla fine dell'incubazione, lasciare che il barattolo venga a temperatura ambiente e posare gli scivoli piatti in una scatola di plastica coperta profonda un pollice con carta velina inumidita alla base.Aggiungere 100 microlitri di proteinasi K prebellica ad ogni campione. Coprire ogni diapositiva con una piccola striscia di parafilm per assicurarsi che le sezioni non si asciughino. Dopo 12 minuti a 37 gradi Celsius, rimuovere con cura il film di paraffina e scolare delicatamente le diapositive su carta velina per rimuovere la soluzione di blocco in eccesso.Successivamente, aggiungere da 100 a 200 microlitri della soluzione anticorpale primaria di interesse per ogni diapositiva. Riportare i siti nella camera umidificante coperta da pellicola di paraffina per un'incubazione notturna a quattro gradi Celsius. La mattina dopo aver lavato le diapositive in soluzione salina tamponata TRIS più TWEEN o TBST etichettare le diapositive con un'appropriata soluzione anticorpale secondaria per un'incubazione di 45 minuti a temperatura ambiente protetta dalla luce.Alla fine dell'incubazione, lavare gli scivoli in TBST e lasciare asciugare. Utilizzare quindi 100 microlitri di mezzo di montaggio anti dissolvenza per posizionare con cura le coverlips sugli scivoli essiccati e conservare gli scivoli piatti a temperatura ambiente durante la notte protetti dalla luce per consentire al mezzo di montaggio di asciugarsi. Per la tomografia micro-calcolata sequenziale in vivo o la micro-TC, l'imager micro-CT è dotato di tubi per consentire il flusso di ossigeno all'interno e all'esterno della camera animale micro-CT, assicurandosi che l'ossigeno in uscita sia dotato di un filtro a carbone attivo per intrappolare l'isoflurane.Impostare Voxelsize su 10,5 micrometri a 55 kilovoltage di picco e 145 microarti con 1.000 proiezioni per 180 gradi e rotazione continua con un tempo di integrazione di 200 millisecondi, con un massimo di 213 fette per scansione. Quando lo scanner è pronto, posizionare delicatamente il mouse anestetizzato nella camera animale micro-CT con le cifre degli arti posteriori disposte in piano, chiudere il lato ventrale di associazione verso l'alto con la zampa sinistra sul lato sinistro e la destra sul lato destro della piattaforma di scansione. Quindi applicare il nastro chirurgico per fissare delicatamente le cifre in posizione.Applicare unguento oftalmico agli occhi dell'animale prima di iniziare la scansione. Dopo la scansione, riportare l'animale in una gabbia pulita con monitoraggio fino alla piena rimi clemenza e consentire fino a diverse ore per la ricostruzione delle immagini micro-CT. Per l'analisi dell'immagine ossea 3D ricostruita, utilizzando il software fornito con la micro-TC, convertire i file di immagine in una serie di file DICOM.Una volta convertiti tutti i file, scaricare la serie DICOM in un'unica cartella utilizzando un downloader di file batch in un browser Web. Caricare il plug-in BoneJ nella cartella del plug-in ImageJ. Trascinare la cartella della serie di file DICOM nella barra ImageJ per aprire i file.Verrà aperto uno stack di immagini a 16 bit che visualizza tutti i valori grigi. Per visualizzare solo le ossa, fare clic su Regolazione immagine e Soglia. Far scorrere la barra di soglia superiore all'estrema destra e regolare la barra di soglia inferiore fino a quando solo l'osso non viene evidenziato in rosso.Il valore soglia inferiore sarà approssimativamente da 10.000 a 13.000 ad un'intensità massima del segnale di 32.767. Fare clic su Applica e nella nuova finestra di dialogo fare clic su Sfondo nero. Fare quindi clic su OK. Verrà generata un'immagine a otto bit che mostra i valori in bianco e nero.Con il bianco corrispondente all'osso. Disegna un rettangolo attorno all'osso P3 per selezionarlo e duplicare la pila. Per generare un'immagine 3D, fare clic su Plugin e Visualizzatore 3D e utilizzare lo strumento di selezione a mano libera per cerchiare l'osso da eliminare.Quindi fare clic con il pulsante destro del mouse e selezionare Selezione riempimento per ritagliare qualsiasi osso non necessario dall'immagine. Per quantificare il volume osseo dal rendering 3D, aprite il plug-in BoneJ e selezionate Frazione volume (Volume Fraction). Verrà visualizzata una finestra dei risultati e verrà visualizzato il volume osseo in millimetri al cubo.Per quantificare la lunghezza ossea del rendering 3D, usate lo strumento multipunto ImageJ. Per acquisire un'immagine del rendering 3D, fare clic su Visualizza e scattare un'istantanea. Quindi salva l'immagine come file TIF o JPEG.In queste immagini sezioni di un topo adulto rigenerante P3 digit sono state immunostained con anticorpi per visualizzare la rigenerazione ossea intramembranosa e la formazione di blastema al giorno da sei a sette, nove e 10 post-amputazione. Qui vengono mostrati rendering rappresentativi micro-CT di cifre scansionate prima dell'amputazione e in vari punti di tempo nel corso della rigenerazione con punti di riferimento utilizzati per identificare le misurazioni della lunghezza. Il modello a cifre del mouse è un potente sistema per analizzare un ambiente pro-rigenerativo della ferita che innesca la formazione di blastema quando viene amputato a livello distale.Al contrario, l'amputazione prossimale delle cifre funge da sistema modello per lo studio del fallimento rigenerativo e da un sito per testare strategie per migliorare la rigenerazione.

adult-mouse-digit-amputation-regeneration-simple-model-to-investigate

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Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

I modelli animali sono spesso impiegati per imitare gravi lesioni ossee nella ricerca biomedica. A causa delle loro piccole dimensioni, l'insediamento di lesioni ossee stabilizzate nei topi è al di là delle capacità della maggior parte dei gruppi di ricerca. In questo articolo, descriviamo un metodo semplice per stabilire e analizzare i difetti femorali sperimentali nei topi.

Un semplice Critical dimensioni femorale Difetto Modello in Mice

Presentiamo un protocollo per catturare la dinamica della rigenerazione della pinna caudale larvale del pesce zebra su una scala dell'intero tessuto utilizzando la stereomicroscopia basata sul campo chiaro. Questa tecnica consente di catturare le dinamiche di rigenerazione con la risoluzione di una singola cella. Questa metodologia può essere adattata a qualsiasi stereomicroscopio dotato di una telecamera CCD e di un software time-lapse.

Catturare Tissue Repair in Zebrafish Larve con Time-lapse Brightfield stereomicroscopia

Un modello di ossificazione eterotopica di tenotomia e ustione di Achille consente lo studio affidabile della formazione ossea ectopica indotta da traumi senza l'applicazione di fattori esogeni.

Diretta mouse Trauma / Burn modello di ossificazione eterotopica

Sebbene i modelli murini siano strumenti inestimabili per l'ingegneria del tessuto osseo, i modelli di difetti delle ossa lunghe sono scarsi. Questa necessità ha motivato lo sviluppo del presente protocollo che utilizza una piastra di bloccaggio con quattro viti e una maschera dedicata per eseguire e stabilizzare un difetto riproducibile, femorale, di dimensioni critiche con bassa morbilità.

Istituzione di un segmentale femorale critico-size difetto del modello in topi stabilizzati da osteosintesi Piastra

Questo articolo descrive come eseguire un metodo chirurgico per inibire la formazione dell'epidermide della ferita durante la rigenerazione dell'arto axolotl suturando immediatamente la pelle a tutto spessore sul piano di amputazione. Questo metodo consente ai ricercatori di studiare i ruoli funzionali dell'epidermide della ferita durante le prime fasi della rigenerazione degli arti.

Inibizione della formazione dell'epidermide della ferita tramite chirurgia del lembo della pelle completa durante la rigenerazione degli arti Axolotl

Questo protocollo descrive una procedura chirurgica per l'instaurazione di una frattura diafisaria nel femore dei topi, che viene stabilizzata con un filo intramidollare, per studi di guarigione delle fratture.

Stabilire un modello di frattura del femore diafisario nei topi

Questo protocollo dimostra i dettagli passo-passo su come estrarre il primo molare mandibolare nel topo. Fornisce un metodo alternativo per i ricercatori che si concentrano sulla guarigione e la rigenerazione della mandibola.

L'istituzione di un modello murino di guarigione dell'orbita di estrazione molare mandibolare

Viene presentato un protocollo per la chirurgia dell'osteotomia femorale con l'uso della fissazione interna della placca in axolotl maturi. La procedura può essere utilizzata per eseguire studi comparativi sulla rigenerazione degli arti e sulla guarigione delle fratture negli anfibi acquatici.

Stabilizzazione di un'osteotomia del femore con una fissazione della placca nell'Ambystoma mexicanum

In questo protocollo, mostriamo come preparare il tessuto axolotl per la microscopia a forza atomica (AFM) ed eseguire misurazioni dell'indentazione nella cartilagine degli arti intatta e in rigenerazione.

Misurazioni al microscopio a forza atomica della cartilagine in arti axolotl intatti e in rigenerazione

Il modello di lesione del midollo osseo murino è uno strumento utile per studiare l'osteogenesi postnatale attraverso l'ossificazione intramembranosa. Questo protocollo chirurgico semplificato descrive la procedura di ablazione del midollo osseo per la valutazione a valle della formazione di nuovo osso e delle risposte cellulari dopo la lesione.

Metodologia migliorata per lo studio dell'osteogenesi postnatale tramite ossificazione intramembranosa in un modello di lesione del midollo osseo murino

L'obiettivo di questo studio era standardizzare un approccio chirurgico sicuro e riproducibile per eseguire un'amputazione trasversale completa della mandibola in Ambystoma mexicanum per lo studio della rigenerazione dei tessuti craniofacciali.

Progettazione e standardizzazione di un modello di lesione mandibolare per lo studio della rigenerazione del tessuto craniofacciale nel modello Ambystoma mexicanum

Scopri l'amputazione della falange terminale nel topo adulto per studiare la formazione del blastema e l'ossificazione intramembranosa. Questo modello preclinico permette di analizzare i meccanismi rigenerativi mammiferi.

Amputazione e rigenerazione delle cifre del mouse adulto: un modello semplice per indagare sulla formazione del Blastema mammario e sullossificazione intramembranosa (Video) | JoVE Journal

Amputazione e rigenerazione delle cifre del mouse adulto: un modello semplice per indagare sulla formazione del Blastema mammario e sull'ossificazione intramembranosa

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