Un flusso di lavoro integrato di identificazione e quantificazione sul metaboloma non mirato basato sul controllo FDR

Questo protocollo consente l'analisi qualitativa e quantitativa del metaboloma non mirato basato sul controllo di qualità FDR che riduce efficacemente i falsi positivi dell'identificazione del metabolita. Questo flusso di lavoro integra XY-Meta che utilizza la strategia target-esca per valutare FDR in modo più accurato per l'identificazione del metaboloma nel modulo di analisi qualitativa. Questa misura può filtrare efficacemente i risultati falsi positivi dell'identificazione del metaboloma non mirato, il che migliora la robustezza della scoperta di biomarcatori o molecole chiave.

Ci aspettiamo che i ricercatori possano comprendere e padroneggiare la strategia target-esca per il controllo FDR e dovrebbero provare a eseguire rigorosamente questa pipeline più volte con i parametri predefiniti del protocollo. Iniziare accedendo alla pagina Web del database GNPS e fare clic su Sfoglia set di dati. Cerca la parola chiave nella colonna del titolo, quindi fai clic sul numero ID del set di dati.

Scaricare il set di dati utilizzando FTP e salvare i dati grezzi nella rispettiva cartella. Per convertire il formato dei dati grezzi, installare prima il software ProteoWizard. Nel percorso di installazione di ProteoWizard digitare msconvert.

exe, seguito dai parametri specifici per convertire il formato dei dati grezzi in formato mzXML. Ancora una volta, usando msconvert. exe converte questi dati in formato MGF e li memorizza nella cartella MGF.

Per preparare la libreria spettrale di riferimento per i metaboliti, visitare la pagina Web GNPS. Cerca la parola chiave NIST, fai clic su Visualizza per i dettagli e scarica la libreria. Salvare la libreria nella cartella del database.

Scarica il programma XY-Meta. Individuare il file di configurazione dei parametri nella cartella di configurazione e modificarne il contenuto come descritto nel protocollo di testo. Impostare il tipo di addotti come elenco nella cartella degli addotti.

Eseguire l'identificazione del metabolita e il controllo della velocità di falsa scoperta utilizzando il comando XY-Meta.exe. Scaricare e installare il pacchetto software metaX. Quindi modificare l'elenco di esempio.

txt per specificare il campione e i dati di spettrometria di massa corrispondenti come descritto nel protocollo di testo. Utilizzare il file R fornito con il protocollo di testo per eseguire lo script per la quantificazione di gruppi di tipo fittizio e wild utilizzando il software metaX. Controllare la cartella di output in cui sono memorizzati i risultati dell'analisi quantitativa, ad esempio il grafico PCA.

Successivamente, modificare i parametri nello script R per annotare i picchi nell'analisi qualitativa e quantitativa utilizzando le identificazioni dei metaboliti al fine di integrare sia i risultati che eseguire lo script R. Box plot di metaboliti quantificati hanno mostrato che la distribuzione generale di campioni sani e di malattia era simile con una bassa fluttuazione dei valori medi. Solo il 3,39% dei metaboliti aveva più del 30% dei valori mancanti.

Il grafico di analisi dei componenti principali dei campioni di entrambi i gruppi ha mostrato che metaX ha notevolmente aumentato la proporzione dei metaboliti con CV inferiore a 0,3. Un diagramma di Venn di metaboliti differenzialmente rilevati da tre metodi di test statistici ha rivelato 119 metaboliti comuni. Il tempo di ritenzione e la distribuzione massa per carica di tutti i metaboliti annotati sono stati tracciati con un tasso di falsa scoperta inferiore a 0,01, mostrando sei metaboliti significativi e differenzialmente rilevati.

È importante limitare il tempo per il test del flusso di lavoro. Ricorda, di non selezionare troppi campioni per l'analisi e di conservare almeno due campioni in ciascun gruppo. Questa tecnica consente il controllo di qualità dell'identificazione metabolizzata da dati di acquisizione indipendenti dai dati costruendo una libreria spettrale dello spettro di riferimento più robusta utilizzando i risultati di corrispondenza dello spettro basati sul controllo FDR.