In vivo Imaging per misurare le metastasi polmonari spontanee di cellule tumorali mammarie iniettate ortotopicamente

Il manoscritto descrive una metodologia per l'instaurazione e il monitoraggio longitudinale della crescita delle metastasi polmonari spontanee da tumori mammari iniettati ortotopicamente, suscettibili di intervento in tutte le fasi della cascata metastatica.

Gli effetti sistemici dei tumori primari sono ora riconosciuti per svolgere un ruolo significativo nel processo di disseminazione metastatica. Tuttavia, questo aspetto viene spesso trascurato nei saggi sperimentali di metastasi. Questo modello mira a fornire ai ricercatori un modo per valutare questo effetto.

Questo protocollo include la valutazione delle metastasi spontanee dopo la rimozione chirurgica di un tumore primario, che è clinicamente rilevante. Principalmente, sfrutta anche l'imaging a bioluminescenza per monitorare la crescita delle metastasi polmonari in tempo reale. Questo setup sperimentale può essere esteso per valutare interventi farmacologici o genetici per il carcinoma mammario nel contesto neoadiuvante, nonché la rilevanza di specifiche vie di segnalazione nel processo metastatico.

Per iniziare, raccogliere le cellule aspirando il terreno di coltura cellulare e lavare con PBS sterile. Successivamente, incubare con due millilitri di soluzione di tripsina-EDTA allo 0,25% per circa due o tre minuti a 37 gradi Celsius fino a quando le cellule non si staccano e quindi lavare con otto millimetri di terreno completo per estinguere la reazione. Dopo aver aspirato il surnatante e lavato le cellule con PBS, risospendere le cellule in PBS nel volume calcolato necessario per diluire le cellule a 6 milioni di cellule per millilitro.

Quindi trasferire la sospensione cellulare in provette da microcentrifuga da 1,5 millilitri e tenerla in ghiaccio fino al momento dell'iniezione. Radere i peli sull'addome del topo anestetizzato utilizzando un tagliacapelli elettrico, quindi posizionarlo in posizione supina. Successivamente, pulire la regione addominale preparata utilizzando una soluzione di etanolo al 70% e iodio povidone.

Usando le forbici, praticare una piccola incisione sulla linea mediana attraverso la pelle addominale a livello del quarto tessuto mammario, esponendo ma non penetrando attraverso il peritoneo sottostante. Quindi tenere la pelle lontana dal peritoneo usando una pinza e separare la pelle dal peritoneo con tamponi di cotone sterili imbevuti di soluzione fisiologica, muovendosi lateralmente per esporre il cuscinetto adiposo mammario destro e ripetere sul lato sinistro per esporre il cuscinetto adiposo mammario sinistro. Dopo aver risospeso la sospensione cellulare E0771 utilizzando una pipetta manuale, trasferire 100 microlitri in una nuova provetta per microcentrifuga da 1,5 millilitri.

Quindi aggiungere un volume uguale di soluzione di matrice di membrana basale e mescolare bene, facendo attenzione a non introdurre bolle. Successivamente, tieni il tubo sul ghiaccio. Aspirare 100 microlitri di sospensione cellulare in una siringa da insulina U-100 calibro 28 da 0,5 millilitri e tenere in ghiaccio.

Usando una pinza, solleva la pelle e afferra ed espone delicatamente il cuscinetto adiposo mammario sinistro. Successivamente, iniettare 50 microlitri di sospensione cellulare nel cuscinetto adiposo mammario e attendere da tre a cinque secondi prima di rimuovere la siringa. Quindi rilasciare la pelle dalla pinza, permettendole di tornare naturalmente nella sua posizione normale, e chiudere l'incisione cutanea, applicando le graffette cutanee.

Per monitorare la crescita della lesione ortotopica del tumore mammario, misurare la lunghezza e la larghezza del tumore primario utilizzando i calibri tre volte alla settimana. Dopo l'anestesia, somministrare 40 microlitri di meloxicam per via sottocutanea per il controllo del dolore, quindi posizionare il mouse in posizione supina. Quindi, rimuovere le graffette chirurgiche precedenti, se necessario, e pulire l'addome con etanolo al 70% e soluzione di iodio povidone.

Usando le forbici, praticare una piccola incisione sulla linea mediana attraverso la pelle addominale a livello del quarto tessuto mammario, esponendo ma non penetrando attraverso il peritoneo sottostante. Quindi rimuovere il tumore ortotopico tagliando il tessuto mammario normale, situato prossimalmente e distalmente al tumore utilizzando le forbici. Gettare il tessuto tumorale in una sacca per rischio biologico mentre si ripete la procedura con il tumore controlaterale.

Quindi, chiudi il sito chirurgico utilizzando da una a tre graffette e trasferisci il mouse in una gabbia di recupero pulita con un termoforo caldo sottostante. Iniettare negli animali 100 microlitri di soluzione di D-luciferina utilizzando un'iniezione retroorbitale inserendo l'ago nel canto mediale dell'occhio con un angolo di 45 gradi dal naso fino a quando non si avverte una resistenza ossea, assicurandosi che l'ago sia posizionato all'interno del seno venoso retroorbitale. Confermare l'avvenuta iniezione in base alla mancanza di risciacquo di qualsiasi liquido al momento dell'erogazione e attendere due minuti prima dell'imaging.

Durante l'attesa, trasferire gli animali sui coni del naso situati all'interno dell'imager bioluminescente in posizione supina. Per misurare il flusso di fotoni, crea una ROI quadrata per ogni animale raffigurato nell'immagine dal menu a discesa dello strumento ROI facendo clic sul pulsante ROI quadrato. Riposiziona la ROI generata automaticamente sul torace di ogni animale facendo clic e trascinando con il mouse.

E poi fai clic sul pulsante di misurazione del ROI. Praticare un'incisione sulla linea mediana sotto il processo xifoideo, tagliando la pelle, la muscolatura e il peritoneo per esporre la parte inferiore della cavità toracica usando le forbici fino a quando il diaframma non è visibile. Successivamente, perforare il diaframma per far collassare i polmoni e quindi tagliare il diaframma.

Taglia la gabbia toracica sul lato destro e sinistro, quindi usa un emostatico per afferrare il processo xifoideo e spostare la gabbia toracica in modo che non sia d'intralcio, esponendo il cuore e i polmoni. Quindi, taglia l'atrio destro usando le forbici. Quindi perfondere l'animale con 10 millilitri di PBS ghiacciato attraverso il ventricolo sinistro e valutare la completezza della perfusione confermando che il fluido che scorre dall'atrio destro diventa limpido e che il fegato assume un colore giallo pallido.

Successivamente, identificare la trachea e inserire una siringa ad ago calibro 22 con tre millilitri di paraformaldeide al 4%, tenendola parallela alla trachea. Quindi erogare la soluzione a un ritmo lento fino a quando i polmoni non si sono completamente gonfiati. Continua a tenere delicatamente la trachea.

Taglialo con le forbici sopra la pinza e inizia a sollevare con cura il tessuto rimuovendo tutto il tessuto connettivo. Quindi, seziona il cuore lontano dai polmoni. Successivamente, posizionare il tessuto polmonare in paraformaldeide al 4% in PBS per una notte e conservarlo a quattro gradi Celsius per la fissazione.

Utilizzando topi C57 black 6, il segnale di bioluminescenza delle metastasi polmonari significative viene in genere rilevato circa due settimane dopo la resezione del tumore primario e può essere seguito nel tempo, sebbene si possano riscontrare alcune variazioni a seconda del tipo di reporter della luciferasi e del ceppo del topo. L'imaging a bioluminescenza ex vivo del tessuto polmonare all'endpoint fornisce una quantificazione accurata e sensibile del carico metastatico polmonare che può essere confrontata con altri trattamenti. Il conteggio dei noduli polmonari sotto lo stereoscopio e l'analisi istologica dell'ematossilina e dell'eosina possono essere utilizzati per completare gli studi di quantificazione.

Ritardare leggermente il ritiro dell'ago dopo l'iniezione del cuscinetto adiposo mammario consente alla soluzione della matrice di gelificare, il che è fondamentale per prevenire la fuoriuscita della sospensione cellulare e lo sviluppo di tumori extra-mammari. Ora stiamo utilizzando questa tecnica in combinazione con vari modelli murini genetici knockout e knockin per studiare ulteriormente la cascata metastatica, in particolare lo sviluppo della nicchia pre-metastatica.