Mappatura della densità assoluta del DNA nei nuclei cellulari mediante microscopia a localizzazione a singola molecola

Il presente metodo consente di misurare la densità assoluta del DNA nei nuclei cellulari per studiare i vincoli spaziali nelle strutture della cromatina che altrimenti sarebbero caratterizzate solo da modificazioni istoniche post-traduzione. La tassellatura di Voronoi combinata con SMLM consente stime della densità assoluta del DNA in termini di coppia di basi per micrometro quadrato. L'unica conoscenza a priori necessaria è il contenuto totale di DNA del nucleo cellulare misurato.

In esperimenti futuri, sarebbe interessante indagare se le differenze di densità assoluta sono correlate con le informazioni biologiche provenienti da altri metodi, come l'immunofluorescenza delle modifiche epigenetiche o i dati Hi-C. Iniziare ricostruendo l'area scansionata affiancando le singole immagini preregistrate. Aprire CellProfiler e quindi caricare la pipeline cellcycleanalysis.cpproj.

Nelle immagini del primo passaggio della pipeline, trascinare e rilasciare le immagini, inclusa l'immagine di riferimento. Quindi, definisci una posizione in cui verranno memorizzate le immagini di riferimento. Quindi fare clic sull'icona Avvia modalità test seguita da Esegui.

Una volta visualizzato l'istogramma dei nuclei nell'immagine da analizzare, determinare gli intervalli di intensità per le fasi G1, S e G2 e assicurarsi che siano inseriti nei successivi passaggi dell'oggetto filtro della pipeline e che questi passaggi siano attivi. Fare quindi di nuovo clic sul pulsante Esegui per continuare con la seconda metà della pipeline. Guardate le tre immagini con le sovrapposizioni che rappresentano le diverse fasi del ciclo cellulare, G1, S o G2, e selezionate i nuclei in G1 o G2 per ulteriori immagini in modo che la quantità di DNA nelle coppie di basi dei nuclei dell'immagine sia nota.

Riposizionare le cellule sul microscopio di localizzazione di una singola molecola e garantire il corretto lampeggiamento del processo FPALM. Innanzitutto, registra una pila 3D del nucleo scelto utilizzando solo 500 fotogrammi per sezione. Ciò consente di determinare la quantità relativa di DNA nella sezione centrale, che viene successivamente ripresa con molti più fotogrammi per rivelare la sua ultrastruttura.

Iniziare l'acquisizione della serie di immagini utilizzando un tempo di esposizione di 50 millisecondi, con una frequenza fotogrammi di circa 20 fotogrammi al secondo. Prendi uno Z-stack attraverso il nucleo con intervalli di passo di 200 nanometri e solo 500 fotogrammi per sezione ottica leggera. Dopo aver acquisito la pila, tornare alla posizione z iniziale e acquisire il set di dati principale di 50.000 fotogrammi con lo stesso tempo di esposizione di 50 millisecondi.

Aprire il set di dati FPALM in ImageJ. Per ottimizzare le impostazioni per il rilevamento dei segnali lampeggianti, fare clic su ThunderSTORM, quindi su Esegui analisi. Ora scegli Configurazione fotocamera.

Immettere la dimensione corretta in pixel dei dati dell'immagine, il conteggio A/D, l'efficienza quantica della telecamera utilizzata, il livello di base e il guadagno EM, quindi fare clic su OK. Scegli l'algoritmo per determinare le coordinate di localizzazione adattando i segnali lampeggianti. Nella sezione Filtro immagini, utilizzare il filtro Wavelet B-Spline con una scala B-Spline di ordine 3 e una scala B-Spline 2. Quindi, imposta il Metodo di localizzazione approssimativa delle molecole su Massimo locale, imposta la soglia di intensità di picco e la connettività su 8 quartieri.

Nella sezione Localizzazione sub-pixel delle molecole, come Metodo, scegli Gaussiana integrata PSF, imposta Raggio di adattamento px su 3, seleziona Metodo di adattamento come Massima verosimiglianza e imposta Sigma iniziale su 1,6. Quindi fare clic su OK per avviare il rilevamento dei segnali e la ricostruzione dell'immagine. Se l'acquisizione è partizionata in stack di immagini diversi, concatenare le tabelle di localizzazione in ThunderSTORM.

Per fare ciò, fai clic su Importa nella finestra popup. Assicurarsi che l'opzione Aggiungi alla tabella corrente sia attivata e che venga utilizzato il numero iniziale corretto per evitare di sovrascrivere le localizzazioni nella tabella. Quindi selezionare il percorso del file e fare clic su OK per importare un file dopo l'altro.

Per evitare il conteggio eccessivo dei segnali tra fotogrammi consecutivi, unisci i dati di localizzazione utilizzando una distanza massima di 20 nanometri, 1 massimo fuori fotogrammi e 0 fotogrammi massimi per molecola, quindi fai clic su Unisci. Per misurare e correggere la deriva correlando le sottosezioni dei dati, aprire il menu Correzione deviazione e fare clic sulle frecce. Aggiungi 3 contenitori e imposta l'ingrandimento su 5.

Quindi fare clic su Applica e apparirà la finestra che mostra la deriva x e y. Per determinare la quantità di segnale che è proporzionale al contenuto di DNA in ogni sezione dello stack 3D preregistrato con 500 fotogrammi per ogni fetta, scegli Plugin, quindi ThunderSTORM, seguito da Importa/Esporta, e importa la tabella dei risultati per la prima sezione dello stack. Per evitare di sovracontare i segnali provenienti da altri piani dell'immagine dello stack 3D, è necessario rimuovere i segnali al di fuori dell'intervallo di passi di 200 nanometri in z tra le fette.

Premere Istogramma grafico e nella finestra di dialogo Distribuzione aperta, scegliere z e premere OK. Determinare la posizione del picco e utilizzare il campo filtro per selezionare i segnali con la dimensione del passo ottico di 200 nanometri. Fare clic su Visualizzazione e scegliere l'opzione Istogrammi, quindi fare clic su OK. Salvate l'immagine risultante in una cartella in formato TIFF. Apri tutte le sezioni e combinale usando Immagine seguita da Pile e quindi Immagini da impilare.

Dopo aver selezionato l'intera area dell'immagine, vai su Analizza, fai clic su Strumenti e seleziona ROI Manager. Fare clic su Aggiungi, quindi su Analizza, quindi su Imposta misure e selezionare Densità integrata. Ora, scegli l'opzione Altro, seleziona Multi Measure, seleziona Misura tutte le pile e Una riga per fetta.

Fare clic su OK per visualizzare i risultati. La somma delle intensità di tutte le fette è proporzionale al contenuto di DNA dell'intero nucleo nello stesso modo in cui le intensità delle singole fette sono proporzionali alla loro frazione dell'intero genoma. Dopo aver aperto la tabella dei risultati del piano centrale che contiene i segnali di 50.000 fotogrammi, filtrarla ad uno spessore di 100 nanometri.

Crea l'istogramma dei segnali risultanti come dimostrato in precedenza e misura la densità integrata della sezione centrale. Converti la grande tabella di localizzazione ThunderSTORM contenente le informazioni ultrastrutturali dalla sezione centrale dal formato csv al formato ORTE eseguendo lo script MATLAB TS2orte. m, che trasforma la tabella di localizzazione in una matrice MATLAB e la salva nel formato mat.

Accedere alla cartella LAND-voronoi e nella sottocartella coreAlgorithm aprire il file voronoicluster. m e regolare il contenuto di DNA, la frazione della sezione centrale osservata dell'intera frazione del nucleo DNA e le localizzazioni, e il fattore di conversione in base al tipo di cellula utilizzata e allo stadio del ciclo cellulare per i calcoli della densità assoluta. Modificare lo script che avvia l'analisi voronoi.m.

Regolare il percorso del file con i dati di localizzazione orte e la cartella di output per i file dei risultati. Specificare le coordinate che definiscono l'area in cui deve essere eseguita la tassellatura. Definisci più aree da calcolare all'interno dello stesso set di dati di input.

Dopo aver eseguito lo script, cerca l'immagine che mostra le densità assolute del DNA insieme ad altri file contenenti grafici che mostrano l'istogramma della distribuzione dell'area e una densità. m contenente le densità di ogni singola cella Voronoi calcolata nella cartella di output. La misurazione FPALM composta da 50.000 fotogrammi ha prodotto 2,68 volte 10 alla potenza di 6 localizzazioni rilevate all'interno di una sezione centrale spessa 100 nanometri.

L'accuratezza di localizzazione dell'immagine ricostruita era di 10 nanometri. Il gran numero di localizzazioni ha permesso la combinazione di imaging a super risoluzione pur mostrando densità assolute del DNA. Era evidente che le densità di DNA misurate non erano distribuite uniformemente in tutto il nucleo e coprivano un'ampia gamma dinamica.

Ingrandimenti più elevati delle aree all'interno del nucleo che mostravano cellule di Voronoi più grandi indicavano basse densità di DNA, mentre le cellule più piccole indicavano alte densità di DNA. Le densità del DNA misurate in un G1C3H10T mezzo nucleo mostravano la distribuzione assoluta della densità del DNA all'interno del nucleo di un tipo e di una specie diversi. Sebbene l'organizzazione di base assomigliasse al nucleo HeLa G1 primordiale, possedeva anche cluster costitutivi di eterocromatina paracentrica.

Non sono stati osservati cambiamenti architettonici drammatici in un nucleo G2 nonostante un leggero aumento delle dimensioni nucleari. Il nucleo HeLa trattato con TSA ha mostrato notevoli differenze rispetto alla topografia nucleare e alla densità del DNA. Fatta eccezione per l'eterocromatina periferica, che mostrava isole di maggiore densità di DNA, il resto della cromatina appariva molto più omogeneo e decondensato.