Name: Arricchimento di colture di neuroni dei gangli dorsali di topo adulto mediante immunopanning (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-24T14:15:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Impara l'arricchimento di neuroni dai gangli dorsali di topo adulto mediante immunopanning. Questo metodo riduce la contaminazione da cellule non neuronali e migliora la resa delle colture primarie per studi di neurofisiologia.

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Questo lavoro è stato supportato da un Project Grant del Canadian Institutes of Health Research (FRN-162434) e da un Discovery Grant della MS Society of Canada (EGID-3761). Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Sun e il Cross Cancer Institute per la formazione e l'uso del sistema ImageXpress.

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti con l'approvazione del Comitato per la cura e l'uso degli animali delle scienze della salute dell'Università di Alberta (protocollo 0000274).
1. Preparazione del reagente
<ol><li>Per il giorno 1, preparare i seguenti reagenti: acqua per coltura cellulare; poli-D-lisina-preparare un materiale madre ricostituendo l'intera bottiglia in 50 mL di acqua per coltura fino a una concentrazione di 100 μg/ml, conservare a 4 °C e diluire il brodo 1:10 in acqua di coltura fino a una concentrazione finale di 10 μg/ml; tris-HCl-preparare un materiale di riserva sciogliendo il tris cloridrato in polvere in acqua di coltura fino a raggiungere una concentrazione di 500 mM (3,94 g in 50 ml), pH 9,5, sterilizzare con filtro (0,22 μm), conservare a 4 °C e diluire il materiale madre 1:10 in acqua di coltura fino a una concentrazione finale di 50 mM; anticorpi secondari (capra anti-ratto, -coniglio e -topo).</li>
	<li>Per il giorno 2, preparare i seguenti reagenti.<ol><li>Preparare la soluzione salina bilanciata di Hank di grado Ca 2+, senza Mg2+ (HBSS; HBSS-/-), e soluzione salina tamponata con fosfato D di grado di coltura cellulare (PBS) con Ca 2+ e Mg2+. Preparare un'aliquota di riserva di laminina e conservare a -80 °C immediatamente dopo la ricezione; diluire il materiale madre in HBSS-/- sterile fino ad una concentrazione finale di 10 μg/mL per il materiale di lavorazione.</li>
		<li>Preparare il 4% di sieroalbumina bovina (BSA) sciogliendo 400 mg di BSA in 7,5 mL di D-PBS (pH 7,4), portare il volume a 10 mL, sterilizzare il filtro (0,22 μm), aliquote e conservare a -20 °C. Preparare lo 0,2% di BSA diluendo 750 μL di BSA al 4% in 14,25 mL di D-PBS.</li>
		<li>Preparare lo 0,4% di scorte di DNAse aggiungendo 1 mL di soluzione salina bilanciata (EBSS) di Earle per 12.500 unità di DNAse, sterilizzare con filtro (0,22 μm), aliquote e conservare a -20 °C. Preparare il tampone di panning (0,02% BSA) aggiungendo 3 ml di BSA allo 0,2% e 100 μL di DNAsi allo 0,4% in 27 ml di D-PBS. Preparare anticorpi primari (CD45, PDGRFβ, O4). NOTA: Questo protocollo utilizza un ibridoma O48,9, tuttavia, 10 μg di un anticorpo O4 disponibile in commercio sarebbero anche appropriati.</li>
		<li>Preparare il brodo di collagenasi di associazione sciogliendo un flacone di collagenasi di associazione (50 mg) in 5 mL di HBSS-/-, aliquota e conservare a -20 °C. Preparare uno stock di lavoro per due topi aggiungendo 500 μL di collagenasi combinata riscaldata e 50 μL di DNasi riscaldata allo 0,4% a 4,5 mL di HBSS-/-.</li>
		<li>Preparare ovomucoidi bassi aggiungendo 3 g di BSA a 150 ml di D-PBS, quindi aggiungere 3 g di inibitore della tripsina e mescolare per sciogliere. Regolare il pH a 7,4 e portare il volume fino a 200 ml con D-PBS. Sterilizzare con il filtro, preparare 1 mL di aliquote e conservare a -20 °C. Il giorno della dissezione, combinare 1 mL di ovomucoide basso in 9 mL di D-PBS per la soluzione di lavoro.</li>
		<li>Preparare il 15% di BSA sciogliendo 7,5 g di BSA in 50 mL di HBSS-/- (porre su uno shaker per sciogliere completamente), sterilizzare il filtro e conservare a 4 °C.</li>
		<li>Preparare 50 mL di media neuronale aggiungendo 23,2 mL di DMEM, 23,2 mL di mezzo neurobasale, 500 μL di glutamax, 500 μL di piruvato di sodio, 500 μL di penicillina/streptomicina (aliquota immediatamente all'arrivo e conservare a -20 °C), 500 μL di insulina (5 μg/mL finale), 500 μL di SATO, 50 μL di N-acetil-L-cisteina (NAC; 5 μg/mL finale), e 1.000 μL di B27+ (aliquota immediata e conservare a -20 °C al momento della ricezione).<ol><li>Preparare il brodo di insulina sciogliendolo in acqua di coltura ad una concentrazione di 0,5 mg/ml (50 mg in 100 ml), regolare il pH a 7,4, sterilizzare il filtro (0,22 μm), preparare 500 μL di aliquote e conservare a -20 °C.</li>
			<li>Preparare lo stock SATO combinando 20 μL di progesterone (2,5 mg in 100 μL di etanolo), 800 μL di selenito di sodio (4 mg in 10 mL di terreno neurobasale + 10 μL di 1 N NaOH), 800 mg di BSA, 800 mg di transferrina, 128 mg di putrescina dicloridrato e 80 mL di neurobasale. Sterilizzare con filtro (0,22 μm), preparare aliquote da 500 μL e conservare a -20 °C. È essenziale preparare soluzioni fresche di progesterone e selenito di sodio.</li>
			<li>Preparare 50 μL di N-acetil-L-cisteina (NAC) sciogliendo in mezzo neurobasale fino a una concentrazione di 5 mg/ml (50 mg in 10 ml), sterilizzare con filtro (0,22 μm), aliquote e conservare a -20 °C.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Per i giorni 4 e 5, preparare i seguenti reagenti.<ol><li>Preparare un tampone fosfato 0,2 M (PB) sciogliendo 21,8 g di fosfato bibasico di sodio (Na 2 HPO 4) e 8,34 g di fosfato monobasico diidrato di sodio(NaH2PO4) in 1.000 ml di acqua. Regolare il pH a 7,4 e conservare a temperatura ambiente.</li>
		<li>Preparare la paraformaldeide (PFA) all'8% come segue: in una cappa aspirante, riscaldare 50 ml di acqua a 55 °C, spegnere il fuoco e aggiungere 8 g di granuli PFA, mescolando continuamente. Aggiungere 1 N NaOH goccia a goccia fino a quando la soluzione inizia a schiarirsi, quindi aggiungere 40 mL di 0,2 M PB e continuare a mescolare fino a quando non è limpido. Raffreddare la soluzione a temperatura ambiente, regolare il pH a 7,4 e portare il volume a 100 ml con 0,2 M PB. Filtrare e conservare a 4 °C per un massimo di 2 settimane.</li>
		<li>Preparare D-PBS + Triton X-100 (PBSTX) aggiungendo lo 0,2% di Triton X-100 in grado di coltura D-PBS (1 mL di Triton + 500 mL di D-PBS). Conservare a 4 °C. Preparare la soluzione di blocco, che è siero d'asino normale all'1% (NDS) in PBSTX. In anticipo, 1 mL di NDS + 9 mL di PBSTX possono essere preparati e conservati a -20 °C in aliquote da 10 ml.</li>
		<li>Preparare la soluzione anticorpale che è 0,2% NDS / 0,2% BSA in PBSTX : 200 μL di NDS + 200 mg BSA + 9,6 mL di PBSTX; può essere preparato in anticipo e conservato a -20 °C in aliquote da 10 ml.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Configurazione dell'attrezzatura
<ol><li>Installare le seguenti apparecchiature: armadio di biosicurezza per colture cellulari sterili, set di micropipette, pipette sierologiche e pistola per pipette, piastre di Petri da 10 cm, piastre di coltura cellulare desiderate per la placcatura (qui sono state utilizzate piastre con fondo in vetro nero a 24 pozzetti per l'imaging), tubi conici da 15 ml e 50 ml, strumenti di dissezione (vale a dire: forbici a molla fine per laminectomia e taglio nervoso, pinze sottili, e una lama di rasoio), bagnomaria a 37 °C, filtro cellulare da 70 μm, centrifuga (10 min a 300 x g) con adattatori per tubi conici da 15 ml, blu tripano ed emocitometro, cappa aspirante e piastra riscaldante magnetica.</li>
</ol>3. Metodo sperimentale
<ol><li>Giorno 1: preparazione dei piatti<ol><li>In un armadio di biosicurezza, rivestire la superficie di coltura desiderata con abbastanza poli-D-lisina per coprire il fondo del pozzetto. Conservare per una notte a 4 °C. Qui, per l'imaging sono state utilizzate lastre con fondo di vetro a 24 pozzetti e quindi sono stati utilizzati 300 μL di poli-D-lisina.</li>
		<li>In un armadio di biosicurezza, preparare i piatti di panning: per il piatto CD45, aggiungere 10 ml di soluzione tris-HCl funzionante e 30 μL di IgG anti-ratto di capra in una capsula di Petri da 10 cm; per il piatto PDGFRβ, aggiungere 10 ml di soluzione di tris-HCl funzionante e 30 μL di IgG anti-coniglio di capra in una capsula di Petri da 10 cm; per il piatto di ibridoma O4, aggiungere 10 ml di soluzione tris-HCl funzionante e 30 μL di IgG anti-topo di capra in una capsula di Petri da 10 cm. Assicurarsi che la soluzione copra l'intera area del piatto e lasciare a 4 °C durante la notte.</li>
	</ol></li>
	<li>Giorno 2: dissezione, triturazione e immunopanning<ol><li>Aspirare la poli-D-lisina, lavare le piastre tre volte con acqua di coltura tissutale, aprire il coperchio e lasciare asciugare completamente la superficie in un armadio di biosicurezza. Applicare una quantità sufficiente di laminina sulle piastre per rivestire il fondo di ciascun pozzetto e metterle in un'incubatrice a 37 °C. Per le piastre a 24 pozzetti sono sufficienti 200 μL.</li>
		<li>Finisci di preparare i piatti panoramici. Lavare ogni piatto con D-PBS e incubare con 10 μg di anticorpo primario. Lasciare riposare a temperatura ambiente per almeno 2 ore.</li>
		<li>Per il piatto CD45, aggiungere 5 ml di BSA allo 0,2% e 20 μL di CD45 primario; per il piatto PDGFRβ, aggiungere 5 mL di BSA allo 0,2% e 15,4 μL di PDGFRβ; per la capsula O4, aggiungere 3 ml di BSA allo 0,2%, 2 ml di ibridoma O4 e altri 100 μL di BSA al 4% (per garantire che la concentrazione finale di BSA rimanga allo 0,2%).</li>
		<li>Eutanasia da uno a quattro topi usando 0,1 mL/kg di pentobarbitolo di sodio (per piatto immunopanning da 10 cm). Abbiamo usato topi C57BL / 6 a 8-10 settimane di età. Entrambi i sessi sono stati usati e coltivati separatamente l'uno dall'altro. Perfondere l'animale con 30 ml di soluzione salina fredda allo 0,9%.</li>
		<li>Appuntare le zampe anteriori e posteriori a uno stadio di polistirolo e utilizzare una lama di rasoio pulita per esporre la colonna vertebrale dal retro. Eseguire una laminectomia facendo tagli circa a metà strada profonda su entrambi i lati della colonna vertebrale dorsale, rimuovendo la metà dorsale della colonna, per esporre il midollo spinale. Tagliare delicatamente i nervi e rimuovere il midollo spinale, o spingere delicatamente il cavo di lato, mantenendo l'integrità del nervo.</li>
		<li>Utilizzare le radici nervose spinali (recise o attaccate al midollo spinale) per trovare e rimuovere tutti i DRG da entrambi i lati della colonna vertebrale. Tagliare i detriti nervosi da ciascun DRG mentre viene rimosso (più detriti nervosi nella coltura possono portare a una scarsa sopravvivenza della cultura). Raccogliere i DRG in 15 mL di HBSS-/- in un tubo conico da 15 mL su ghiaccio. NOTA: Si noti che il tessuto viene sezionato all'aria aperta, ma una volta aggiunti i DRG al tubo devono essere trattati come sterili e manipolati solo in un armadio di biosicurezza.</li>
		<li>Mettere le scorte congelate di stemxyme 1 e 0,4% DNAse a bagnomaria, circa 30 minuti prima della fine delle dissezioni (all'incirca quando si avvia l'ultimo topo). Lasciare che si depositino sul fondo del tubo conico, quindi continuare il protocollo in un armadio di biosicurezza.</li>
		<li>Aspirare la maggior parte dell'HBSS-/- dai DRG. Utilizzare una pipetta piuttosto che aspirare per ottenere <1 ml di liquido e lasciare ~ 100 μL di liquido in modo da non rischiare di perdere tessuto.</li>
		<li>Lavare tre volte con 1 mL di HBSS-/-. Aggiungere 5 ml di soluzione di stelo funzionante al tessuto. Coprire il coperchio con una pellicola trasparente e far galleggiare il tubo su un lato a bagnomaria impostato a 37 °C per 1 ora.</li>
		<li>Dopo l'incubazione nell'enzima, aggiungere 1 mL di soluzione a basso inibitore ovo al tubo. Triturare delicatamente le cellule con una pipetta p1000 10-15 volte. Lasciare che i pezzi di tessuto si depositino.</li>
		<li>Trasferire i primi 2-3 mL di soluzione (contenenti cellule dissociate) in una soluzione ovomucoide fresca a basso contenuto di ovomucoidi. Ripetere fino a quando il tessuto è completamente dissociato e non rimangono pezzi visibili.</li>
		<li>Centrifugare per 10 min a 300 x g a temperatura ambiente. Sifonare nuovamente il surnatante usando una pipetta anziché aspirare per l'ultimo 1 ml, lasciando ~100 μL, e risospendere il pellet cellulare in 1 mL di tampone di panning.</li>
		<li>Pipettare delicatamente per mescolare. Pre-bagnare un filtro cellulare da 70 μm con 1 mL di tampone panoramico su un tubo conico da 50 ml. Filtrare la soluzione cellulare attraverso il filtro cellulare.</li>
		<li>Lavare il tubo con 1 mL di tampone panoramico, quindi passare attraverso il filtro (3 mL di filtrato). Sovrapporre delicatamente la sospensione cellulare (1 mL alla volta) sopra 2 mL di un cuscino BSA al 15% per rimuovere i residui di mielina. Un cuscino da 2 ml è efficace per due topi e 3 ml è efficace per quattro topi.<ol><li>Per la stratificazione, posizionare i 2 ml di BSA nel tubo, chiudere e rivestire delicatamente i lati del tubo con BSA. Quindi, stratificare delicatamente la sospensione cellulare della parte superiore, mediante pipettaggio contro il lato del tubo.</li>
		</ol></li>
		<li>Centrifugare a temperatura ambiente a 300 x g per 10 minuti (accelerazione e decelerazione lente). Utilizzare una pipetta P1000 per rimuovere il liquido trasparente sulla parte superiore, la fase mielinica intermedia e la BSA, 1 mL alla volta (cambiando le punte tra ogni mL). Lasciare ~100 μL di BSA per non disturbare il pellet.</li>
		<li>Aggiungere 5 ml di tampone panoramico e incubare il tubo in un incubatore a 37 °C, 10% CO2 per 30-45 minuti. Ciò consente il recupero dell'antigene. Assicurati di allentare il tappo per consentire lo scambio di gas.</li>
		<li>Lavare il piatto CD45 tre volte con D-PBS. Versare il risciacquo finale. Decantare la sospensione cellulare nel piatto CD45.</li>
		<li>Incubare le cellule sul piatto CD45 per un totale di 20 minuti a temperatura ambiente, roteando delicatamente al punto di 10 minuti per consentire alle cellule un accesso uguale all'anticorpo.</li>
		<li>Risciacquare il piatto PDGFRβ tre volte con D-PBS e versare il risciacquo finale. Trasferire le cellule non legate dal piatto CD45 al piatto PDGFRβ.</li>
		<li>Agitare delicatamente il piatto CD45 e appoggiarlo ad angolo. Pipettare delicatamente 1 mL della sospensione cellulare sul piatto per raccogliere le cellule non legate. Decantare nel piatto PDGFRβ e pipetta per trasferire la sospensione cellulare rimanente sulla piastra PDGFRβ.</li>
		<li>Incubare la piastra PDGFRβ per un totale di 20 minuti a temperatura ambiente, ruotando delicatamente al punto di 10 minuti per consentire alle cellule un accesso uguale all'anticorpo.</li>
		<li>Risciacquare il piatto O4 tre volte con D-PBS e versare il risciacquo finale. Trasferire le celle non legate dal piatto PDGFRβ al piatto O4 usando lo stesso metodo del punto 3.2.19. Incubare la piastra di O4 per un totale di 20 minuti a temperatura ambiente, roteando delicatamente al punto di 10 minuti per consentire alle cellule un accesso uguale all'anticorpo.</li>
		<li>Trasferire la sospensione cellulare in un tubo conico da 15 mL e centrifugare per 10 minuti a 300 x g. Risospendere le cellule nel volume desiderato e diluire 1:1 con tripano blu per la vitalità cellulare. Contare le cellule medio-grandi con un emocitometro (questo consentirà la migliore rappresentazione del numero di neuroni nella coltura).</li>
		<li>Rimuovere la laminina e placcare le cellule alla densità desiderata. Non lasciare asciugare la piastra tra la rimozione della laminina e la placcatura e aggiungere immediatamente le cellule.</li>
		<li>Coltura delle cellule quantificate per l'arricchimento neuronale (Figura 3) con 500 neuroni in 25 μL di terreno di coltura (descritto in 1.2.7) per pozzetto in piastre da 24 pozzetti e incubazione a 37 °C per 30 minuti. Inondare i pozzi fino a un volume finale di 500 μL.</li>
	</ol></li>
	<li>Giorno 4: fissazione immunocitochimica (ICC), blocco e primaria<ol><li>Dopo 48 ore di crescita, aggiungere 500 μL/pozzetto (o volume equivalente al mezzo nel pozzetto) di PFA all'8% per 15 minuti a temperatura ambiente per fissare le cellule. Se si desidera l'analisi dei media, si può risolvere direttamente con il 4% di PFA. Tuttavia, non abbiamo testato questo.</li>
		<li>Lavare le cellule con D-PBS tre volte. Nota, abbiamo tenuto queste cellule in coltura senza cambio di terreno per un massimo di 72 ore, ma ipotizziamo che potrebbero sopravvivere più a lungo, in particolare se il mezzo è cambiato a metà.</li>
		<li>Rimuovere il lavaggio finale e aggiungere una soluzione bloccante sufficiente per pozzetto per coprire completamente le cellule. Bloccare per 30 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere la soluzione bloccante e aggiungere l'anticorpo primario nella soluzione anticorpale: β3-tubulina ad una diluizione 1:1.000. Sigillare la piastra con pellicola trasparente e incubare per una notte a 4 °C. NOTA: Si potrebbe considerare la colorazione con PDGFRβ per l'assenza di fibroblasti, CD45 per l'assenza di cellule immunitarie, P0 o PMP22 per l'assenza di mielina o fabp7 per la glia satellita.</li>
	</ol></li>
	<li>Giorno 5: ICC secondario<ol><li>Lavare le cellule con D-PBS tre volte. Rimuovere il lavaggio finale e aggiungere anticorpi secondari nella soluzione anticorpale: anti-coniglio 488 a una diluizione 1:500 e DAPI a una diluizione 1:2.000. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente, al riparo dalla luce.</li>
		<li>Lavare con D-PBS tre volte. Aggiungi abbastanza D-PBS per coprire il fondo del pozzo e l'immagine. La piastra può essere sigillata con pellicola trasparente, protetta dalla luce e conservata a 4 °C per un massimo di 2 settimane.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Haberberger, R. V., Barry, C., Dominguez, N., Matusica, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+dorsal+root+ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Human dorsal root ganglia.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 271(2019).</li>
<li>Perner, C., Sokol, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+dissection+and+culture+of+murine+dorsal+root+ganglia+neurons+to+study+neuropeptide+release%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Protocol for dissection and culture of murine dorsal root ganglia neurons to study neuropeptide release.</a> STAR Protocols. 2 (1), 100333(2021).</li>
<li>Lin, Y. T., Chen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsal+root+ganglia+isolation+and+primary+culture+to+study+neurotransmitter+release%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3AJoVE%22%5BJournal%5D)">Dorsal root ganglia isolation and primary culture to study neurotransmitter release.</a> Journal of Visualized Experiments:JoVE. (140), e57569(2018).</li>
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<li>Sommer, I., Schachner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+that+are+O4+antigen-positive+and+O1+antigen-negative+differentiate+into+O1+antigen-positive+oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Cell that are O4 antigen-positive and O1 antigen-negative differentiate into O1 antigen-positive oligodendrocytes.</a> Neuroscience Letters. 29 (2), 183-188 (1982).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Questo protocollo di immunopanning aumenta la proporzione di cellule neuronali nelle colture primarie di DRG. Per i migliori risultati, le dissezioni dovrebbero essere eseguite in modo tempestivo e i DRG dovrebbero essere tagliati dai nervi in eccesso. La fase di dissociazione deve essere attentamente monitorata e non deve superare 1 ora, per evitare che le cellule subiscano stress inutili. Per quanto riguarda specificamente l'immunopanning, ogni piastra deve essere ruotata delicatamente a metà strada per consentire alle...

I gangli delle radici dorsali (DRG) ospitano i corpi cellulari dei neuroni sensoriali che innervano i tessuti periferici. Lo studio di questi neuroni ci permette di comprendere le basi meccanicistiche del dolore e delle condizioni sensoriali. Tuttavia, i DRG non sono composti solo da neuroni, ma contengono anche fibroblasti, cellule di Schwann, macrofagi e altre cellule immunitarie1. Nonostante la presenza di questi vari tipi cellulari, intere colture di DRG sono spesso indicate in letteratura come neuronali 2,3. Queste colture sono ancora utili per l'indagine neuronale mediante imaging o citometria a flusso, che consentirebbe l'identificazione neuronale mediante colorazione, dimensione cellulare e / o morfologia. Tuttavia, per saggi come la reazione a catena della polimerasi (PCR) o il western blotting, in cui le colture sono omogeneizzate per la raccolta di RNA o proteine, la presenza di tipi di cellule non neuronali può interferire con i risultati. Quindi, vi è la necessità di aumentare la proporzione di cellule neuronali nelle colture DRG.
L'immunopanning è una tecnica utilizzata per purificare una varietà di tipi di cellule, tra cui neuroni corticali, astrociti, cellule precursori degli oligodendrociti e microglia. In parole semplici, implica l'adesione di un anticorpo contro un marcatore di superficie cellulare a una capsula di Petri, destinato a legare determinate cellule (Figura 1), e può essere utilizzato per selezionare a favore o contro i tipi di cellule di interesse 4,5,6. Immunopanning DRG embrionali di ratto da selezionare contro cellule non neuronali è stato descritto in precedenza da Zuchero7. Tuttavia, non siamo stati in grado di trovare un protocollo di immunopanning specifico per i DRG del topo. In questo protocollo, ci basiamo sui tenant di base del protocollo Zuchero, ma invece abbiamo adattato la sequenza immunopanning per arricchire le colture DRG di topo adulto (Figura 2). Questo è un potente strumento per studiare i neuroni sensoriali stabiliti nella cultura. È vantaggioso in quanto consente l'uso di topi adulti da modelli genetici, di malattia e di lesione, in modo che i loro neuroni sensoriali possano essere studiati con maggiore specificità.
Questo protocollo è vantaggioso per i lettori che cercano di aumentare la proporzione di neuroni nelle colture DRG di topo adulto. Tuttavia, le fasi di immunopanning possono anche essere omesse e questo protocollo può essere utilizzato anche per intere colture DRG.

<table><tbody><tr><td>Filtri per siringhe da 0,2 um</td><td>Fisher</td><td>723-2520</td><td></td></tr><tr><td>Piastre di Petri da 100 mm</td><td>ThermoFisher</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>Piastre nere con fondo in vetro a 24 pozzetti</td><td>Cellvis</td><td>P24-1,5H-N</td><td></td></tr><tr><td>Filtro cellulare da 70 um</td><td>Cedarlane</td><td>15-1070-1(BI)</td><td></td></tr><tr><td>B27+ integratore</td><td>Gibco</td><td>A3582801</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7906</td><td>per cuscino BSA al 15% e ICC (frazione di shock termico &ge; 98%)</td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4161</td><td>per il 4% BSA per l'immunopanning e SATO per i terreni (essenzialmente priva di globuline, adatta per colture cellulari, &ge; 99%)</td></tr><tr><td>CD45 anticorpo</td><td>BD Pharmigen</td><td>550539</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11960069</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Worthington</td><td>LS002007</td><td>per soluzione stemxyme e tampone panning</td></tr><tr><td>D-PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8662</td><td></td></tr><tr><td>EBSS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E6267</td><td>per DNAsi soluzione</td></tr><tr><td>Carta da filtro grado P8</td><td>ThermoFisher</td><td>09-795K</td><td>per 8%</td></tr><tr><td>PFA Glutamax</td><td>ThermoFisher</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>capra-anti-topo IgG</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>115-005-020</td><td>per piatto O4</td></tr><tr><td>capra-anti-coniglio 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>capra-anti-coniglio IgG</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>115-005-003</td><td>per PDGFRB piatto</td></tr><tr><td>capra-anti-ratto IgG</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>115-005-044</td><td>per CD45 piatto</td></tr><tr><td>HBSS -/-</td><td>Sigma Aldrich</td><td>14175145</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I2643</td><td></td></tr><tr><td>laminina</td><td>Invitrogen</td><td>23017-015</td><td></td></tr><tr><td>N-acetil cisteina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8199</td><td></td></tr><tr><td>Gibco</td><td>neurobasale</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>siero d'asino normale</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo O4</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>Ibridoma</td></tr><tr><td>Inibitore della tripsina ovomucoide</td><td>Cedarlane</td><td>LS003086</td><td>per ovuli bassi</td></tr><tr><td>prills di paraformaldeide</td><td>Sigma Aldrich</td> 441244 <td>per l'8% di PFA</td><td></td></tr><tr><td>PDGFRB anticorpo</td><td>Abcam</td><td>AB32570</td><td></td></tr><tr><td>penicillina/ streptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Poli-D-lisina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>Progesterone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8783</td><td>per SATO</td></tr><tr><td>Putrescina diidroclorloride&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5780</td><td>per SATO</td></tr><tr><td>Sodio fosfato bibasico</td><td>Fisher</td><td>S374-1</td><td>per 0,2 M PB</td></tr><tr><td>Sodio fosfato monobasico diidrato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>04269</td><td>per 0,2 M PB</td></tr><tr><td>Sodio piruvato</td><td>ThermoFisher</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>selenito di sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5261</td><td>per SATO</td></tr><tr><td>Stemxyme I</td><td>Cedarlane</td><td>LS004107</td><td>per la dissociazione tissutale; combinazione collagenasi</td></tr><tr><td>Transferrina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1147</td><td>per SATO</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Millipore Sigma</td><td>T5941</td><td></td></tr><tr><td>tripano blu</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>&beta; 3-Tubulina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2200</td><td></td></tr></tbody></table>

arricchimento di colture di neuroni dei gangli dorsali di topo adulto mediante immunopanning

Enrichment of Adult Mouse Dorsal Root Ganglia Neuron Cultures by Immunopanning

I gangli delle radici dorsali (DRG) sono strutture periferiche adiacenti al corno dorsale del midollo spinale, che ospitano i corpi cellulari dei neuroni sensoriali e vari altri tipi di cellule. I protocolli di coltura pubblicati spesso si riferiscono a intere colture DRG dissociate come neuronali, nonostante la presenza di fibroblasti, cellule di Schwann, macrofagi e linfociti. Mentre queste colture di DRG intere sono sufficienti per applicazioni di imaging in cui i neuroni possono essere individuati in base alla morfologia o alla colorazione, gli omogenati di proteine o RNA raccolti da queste colture non sono principalmente di origine neuronale. Qui, descriviamo una sequenza di immunopanning per DRG di topo in coltura. L'obiettivo di questo metodo è quello di arricchire le colture DRG per i neuroni rimuovendo altri tipi di cellule. L'immunopanning si riferisce a un metodo di rimozione dei tipi di cellule aderendo agli anticorpi ai piatti di coltura cellulare. Usando questi piatti, possiamo selezionare negativamente e ridurre il numero di fibroblasti, cellule immunitarie e cellule di Schwann in coltura. Questo metodo ci consente di aumentare la percentuale di neuroni nelle colture.

Le cellule fisse colorate con DAPI e β3-tubulina sono state quindi visualizzate con un sistema di screening confocale ad alto contenuto. Le immagini sono state analizzate utilizzando un software commerciale adatto per determinare la percentuale di cellule DAPI-positive che hanno co-marcato con β3-tubulina (Figura 3). Le colture DRG intere sono state determinate per avere il 42,36% ± il 6,4% di colorazione β3-tubulina e le colture di DRG immunopannate sono state determinate per avere il 71,44...

Questo articolo descrive un protocollo di immunopanning per i gangli della radice dorsale del topo adulto. Aderendo agli anticorpi alle piastre di coltura, possiamo selezionare e rimuovere negativamente le cellule non neuronali. Mostriamo che le colture sono arricchite per i neuroni utilizzando questo protocollo, consentendo uno studio approfondito delle risposte neuronali alla manipolazione.

Arricchimento di colture di neuroni dei gangli dorsali di topo adulto mediante immunopanning

Dorsal root ganglia (DRGs) are peripheral structures adjacent to the dorsal horn of the spinal cord, which house the cell bodies of sensory neurons as ...

Questo protocollo ci consente di aumentare il numero di neuroni nelle colture di gangli dorsali di topo adulto. Questo può aiutare a determinare il contributo delle cellule neuronali a una data risposta. Abbiamo aggiunto una fase di immunopanning a un protocollo di coltura DRG di base.Il vantaggio principale è quello di selezionare contro le cellule non neuronali. Se sei nuovo alle culture DRG primarie, è meglio praticare le dissezioni per ottenere il maggior numero possibile di DRG e tagliare il più possibile il nervo. Per iniziare, aspirare la poli-D-lisina utilizzata per il rivestimento della piastra di coltura e lavare la piastra tre volte con acqua di coltura tissutale.Inclinare il coperchio aperto e lasciare asciugare completamente la superficie. Applicare abbastanza laminina alla piastra per rivestire il fondo di ciascun pozzetto e posizionarlo in un'incubatrice a 37 gradi Celsius. Lavare i piatti di panning precedentemente preparati di CD45, PDGFR-beta e O4 con D-PBS.Per il piatto CD45, aggiungere 5 millilitri di 0,2% BSA e 20 microlitri di anticorpo primario CD45. Per il piatto PDGFR-beta, aggiungere 15,2 microlitri di PDGFR-beta ai 5 millilitri di piastra contenente BSA a

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Neuroscienze

Questo articolo descrive i metodi per ricavare le popolazioni murine arricchito di cellule precursori degli oligodendrociti (OPC) in colture primarie, che differenziano per produrre oligodendrociti maturi (OLS). Inoltre, questo rapporto descrive le tecniche per produrre murino mielinizzanti co-colture da semina OPC del mouse su un letto neurite dei neuroni dei gangli spinali del mouse (DRGNs).

Derivazione di Arricchito Culture oligodendrociti e degli oligodendrociti / Neuron mielinizzanti co-culture di tessuti murini post-natale

Studio genetico della rigenerazione assonale con colture di neuroni adulti Root dorsali gangliari

Questo video mostra una procedura per isolare i neuroni del ganglio della radice dorsale (DRG) da embrioni di ratto e co-coltivarli con i precursori delle cellule di Schwann per generare cellule di Schwann mature. I DRG isolati vengono elaborati per isolare i neuroni e le cellule gliali. Le cellule isolate vengono coltivate per purificare i neuroni, che vengono poi co-coltivati con cellule simili a cellule di Schwann (SCLC) in un terreno di co-coltura. L'interazione con i neuroni DRG porta alla...

Isolamento di neuroni DRG e cocoltura con precursori cellulari di Schwann per generare cellule di Schwann

Questo video dimostra un protocollo per arricchire le colture neuronali dai gangli delle radici dorsali mediante immunopanning, migliorando così la loro purezza e utilità per la ricerca neurologica.

Arricchimento neuronale dei gangli della radice dorsale mediante immunopanning

Fonte: Li, Q. et al. Indagine sulla rigenerazione degli assoni dei mammiferi: elettroporazione in vivo del ganglio della radice dorsale del topo adulto. J. Vis. Exp. (2018)Questo video dimostra la trasfezione mediata dall'elettroporazione di neuroni DRG di topo per studiare la rigenerazione degli assoni. Delinea i passaggi per la consegna di costrutti di acido nucleico ai neuroni DRG, l'induzione di lesioni al nervo sciatico e la valutazione della rigenerazione assonale.

Trasfezione mediata da elettroporazione dei gangli della radice dorsale di topo per promuovere la rigenerazione sensoriale degli assoni

Qui si descrive un protocollo dettagliato per la generazione simultanea di colture di cellule precursore neuronali, sia come monostrati aderenti o neurosfere, dalla zona subventricolare e giro dentato di singoli topi adulti.

Un mouse, due culture: isolamento e la coltura di Adult Neural Stem Cells dalle due zone neurogena Mice individuale

Lo sviluppo del dolore neuropatico comporta alterazioni patologiche delle cellule gliali cordone spinale. Un affidabile sistema di coltura gliali derivate da tessuto del midollo spinale adulto e progettato per studiare queste cellule in vitro è carente. Pertanto, mostriamo qui come stabilire colture gliali miste primarie di topo adulto tessuto del midollo spinale.

Preparazione delle colture gliali miste primarie da adulti mouse spinale tessuto del midollo

In questo rapporto, vengono evidenziati i vantaggi delle colture organotipiche e colture primarie dissociate di gangli spinali del mouse-derivati per studiare una vasta gamma di meccanismi connessi con interazione neurone-glial, neuroplasticità, neuroinflammation e risposta all'infezione virale.

Topo adulto DRG Explant e dissociato modelli cellulari per studiare neuroplasticità e risposte agli insulti ambientali, compreso l'infezione virale

Presentiamo un modello in vitro per valutare la capacità neuroregenerativa olfattiva di glia (OEG), dopo la lesione neurale. Si basa su una cocultura di neuroni ganglionali della retina adulta assotomizzati (RGN) su monostrati OEG e sul successivo studio della rigenerazione assonale, analizzando marcatori assonali e somatodendritici RGN.

Cocultura di neuroni ganglionali retini di ratto axotomizzati con glia ensheathing olfattiva, come modello in vitro di rigenerazione assionale adulta

Questo protocollo descrive i metodi per stabilire colture intere e dissociate di gangli della radice dorsale di topo (DRG) e il loro utilizzo per valutare le interazioni tumore-nervo.

Definizione di modelli in vitro di coltura dei gangli della radice dorsale: approcci complementari per lo studio del crosstalk cancro-nervo

Impara l'arricchimento di neuroni dai gangli dorsali di topo adulto mediante immunopanning. Questo metodo riduce la contaminazione da cellule non neuronali e migliora la resa delle colture primarie per studi di neurofisiologia.

Arricchimento di colture di neuroni dei gangli dorsali di topo adulto mediante immunopanning

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