Name: Isolare le cellule epiteliali bronchiali dal tessuto polmonare resecato per il biobanking e stabilire colture di interfaccia aria-liquido ben differenziate (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-26T14:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: Impara a isolare cellule epiteliali bronchiali da tessuto polmonare umano per biobanking e colture ALI differenziate. Questo metodo robusto consente di studiare funzioni cellulari e risposte a stimoli in patologie respiratorie.

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Gli studi che utilizzano il modello descritto in questo contributo sono stati supportati da una varietà di organizzazioni di finanziamento, tra cui la Lung Foundation Netherlands, l'Organizzazione olandese per la ricerca e lo sviluppo sanitario (ZonMw, COVID-19 MKMD grant), la Dutch Society for the Replacement of Animal Testing (Stichting Proefdiervrij, grant #114025007), nonché borse di ricerca di aziende come Boehringer Ingelheim e Galapagos. La Figura 1 è stata creata con BioRender.com.

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse rilevanti.

Il protocollo qui presentato descrive l'isolamento di cellule epiteliali bronchiali umane da tessuto polmonare resecato, un metodo per l'espansione ottimale delle cellule senza perdita di potenziale di differenziazione, una procedura di crioconservazione e una procedura per generare colture ALI-PBEC ben differenziate. Inoltre, viene fornita una descrizione del controllo di qualità, nonché istruzioni per il monitoraggio e la valutazione degli ALI-PBEC differenziati.
Il protocollo descritto inizia con un anello bronchiale macroscopicamente normale, privo di tumore che viene resecato da un lobo polmonare da pazienti sottoposti a intervento chirurgico correlato alla loro diagnosi di cancro del polmone. Va quindi notato che questi anelli non possono essere considerati strettamente come tessuto sano, che può quindi influenzare le caratteristiche della coltura cellulare. Le fonti alternative per ottenere cellule epiteliali bronchiali includono l'utilizzo di biopsie bronchiali, spazzole bronchiali o tessuti da un donatore di trapianto o polmoni riceventi. Indipendentemente dalla fonte, quando si utilizza il tessuto polmonare, deve essere considerato un rischio di contaminazione microbica, e quindi gli antibiotici vengono utilizzati nei diversi terreni di coltura per ridurre il rischio di contaminazione microbica della coltura cellulare. In particolare, il micoplasma è un rischio elevato e comune nella coltura cellulare, a causa della sua ampia varietà di effetti sulla coltura cellulare, della resistenza agli antibiotici comunemente usati nelle colture cellulari e del fatto che la contaminazione da micoplasma può essere confermata solo dai saggi di rilevamento del micoplasma. Pertanto, nella fase iniziale della coltura cellulare dopo l'isolamento delle cellule dal tessuto polmonare, viene utilizzata la formulazione antimicrobica ad ampio spettro Primocin e, durante il processo di coltura, vengono testati campioni selezionati casualmente per la presenza di micoplasma.
La procedura di isolamento che inizia con un anello bronchiale fornisce materiale di partenza sufficiente per consentire il grado di espansione di queste cellule primarie necessarie per avviare le colture presso l'ALI senza compromettere la capacità di differenziazione. Tuttavia, iniziare l'espansione delle cellule epiteliali isolate con un numero limitato di cellule può porre problemi con l'ottenimento di un numero sufficiente di inserti con abbastanza cellule che possono essere seminate per la coltura di ALI. La coltura prolungata e il passaggio ripetuto delle cellule primarie possono provocare senescenza replicativa. Sono state proposte varie soluzioni per superare questa limitazione. Horani et al. hanno dimostrato che l'inibitore della Rho chinasi (ROCK) Y-27632 ha aumentato la proliferazione delle cellule basali30, Mou et al. hanno usato la doppia inibizione di Smad per espandere le cellule staminali basali mantenendo le caratteristiche dello strato di cellule epiteliali differenziate 31, e Sachs et al. hanno sviluppato un sistema organoide delle vie aeree che può essere utilizzato per espandere le cellule epiteliali delle vie aeree e mantenere il loro potenziale di differenziazione nel corso di passaggi multipli32. Quest'ultimo metodo è stato utilizzato anche per espandere cellule da fonti con numero di cellule molto basso, come aspirati tracheali (TA) da neonati pretermine (<et di gestazione settimane e liquido lavaggio broncoalveolare prima del trasferimento alla coltura ali come descritto qui class="xref">33. È stato riscontrato che le cellule isolate da BAL e TA mostravano una capacità di differenziazione simile alle cellule generate dal tessuto bronchiale, sebbene siano state osservate differenze quando la differenziazione è stata inclinata verso colture più ciliate o più contenenti cellule caliciali utilizzando l'inibizione della segnalazione di Notch o la citochina Th2 IL-1333. Si raccomanda pertanto che, se gli ALI-PBEC sono coltivati a partire da un materiale di partenza con un basso numero di cellule epiteliali utilizzando approcci simili, di controllare sempre le colture per i criteri di qualità di base, come discusso nella sezione 6 del protocollo. È importante sottolineare che l'uso di cellule di alimentazione può anche aiutare a ottenere numeri di cellule più grandi, che è essenziale in un contesto per l'ingegneria delle impalcature trapiantabili in cui il tempo e il numero di cellule sono essenziali. Ciò è illustrato da uno studio in cui cellule epiteliali autologhe sono state coltivate da biopsie derivate da un paziente con malattia tracheale e le cellule sono state rapidamente espanse in presenza di uno strato di alimentazione embrionale murino (fibroblasti 3T3-J2 mitoticamente inattivati) e del suddetto inibitore della via Rho / ROCK (Y-27632) 34. La coltura cellulare risultante si è rivelata utile per il ripopolamento degli scaffold tracheali, e quindi questo potrebbe essere visto come un protocollo adatto per un modello di trapianto.</et>
Quando si utilizza il protocollo descritto in questo contributo, ma anche quando si utilizzano altri protocolli culturali, viene inevitabilmente introdotto un bias di selezione. È importante rendersi conto che le differenze nei dettagli del protocollo, come l'origine delle cellule utilizzate per avviare le colture, la composizione del terreno e altri dettagli del protocollo, possono portare a cambiamenti nella composizione cellulare delle colture e quindi cambiamenti nella risposta della coltura ALI33,35. Inoltre, sono state osservate differenze nelle proprietà cellulari anche confrontando diversi mezzi per differenziare le cellule delle vie aeree10,11. Confrontando PneumaCult e il mezzo cBD, sono state osservate differenze nei marcatori mRNA delle cellule caliciformi e delle cellule club, nei valori TEER e nello spessore dello strato cellulare. Sulla base di queste osservazioni, nonostante la mancanza di basi statistiche, a causa del basso numero di donatori utilizzati, la composizione del mezzo è sconosciuta ai clienti e dei costi più elevati del mezzo PneumaCult, nel nostro laboratorio è stata presa la decisione di utilizzare il mezzo cBD.
Come discusso, le cellule possono essere inizialmente espanse utilizzando la coltura di organoidi e successivamente trasferite al sistema di inserti ALI 2D. Questo è importante, poiché gli organoidi epiteliali delle vie aeree non sono adatti all'esposizione a sostanze aerodisperse, mentre l'uso del sistema ALI 2D consente di valutare l'impatto di sostanze aerodisperse come il fumo di sigaretta23,36 sulle cellule epiteliali delle vie aeree in coltura. Un approccio diverso per stabilire colture di cellule epiteliali delle vie aeree ALI consiste nel generare cellule epiteliali delle vie aeree mediante la differenziazione delle cellule staminali pluripotenti umane (hiPSCs)37. In tali protocolli, nella fase finale del protocollo di differenziazione dopo la differenziazione in progenitori prossimali delle vie aeree, le cellule possono essere differenziate per coltura all'ALI utilizzando procedure simili a quelle qui descritte.
Nel protocollo attuale, il mezzo cBD viene utilizzato per la coltura presso l'ALI. Il mezzo cBD è un mezzo privo di siero che viene preparato aggiungendo un mix di diversi integratori, ispirato da Fulcher et al.38 e da altri studi. La soluzione di supplemento contiene 52 μg/mL di estratto ipofisario bovino (BPE), 0,5 μg/mL idrocortisone, 0,5 ng/mL EGF umano, 0,5 μg/mL epinefrina, 10 μg/mL transferrina, 5 μg/mL di insulina, 6,5 ng/mL di triiodotironina e 0,1 ng/mL di RA39. Poiché il BPE è un estratto tissutale ed è soggetto a variazioni per lotti, il mezzo non può essere considerato un mezzo completamente definito, né è privo di animali. Il terreno di coltura cellulare completamente definito è preferibile per ridurre al minimo le differenze tra batch. In vista della transizione verso una ricerca senza animali, è importante che si compiano sforzi per produrre terreni definiti che non contengano prodotti animali e che siano accessibili per la comunità scientifica.
Varie configurazioni sperimentali possono essere utilizzate sulla base del modello ALI, a seconda della domanda di ricerca. Ad esempio, per studiare l'impatto dei composti che possono influenzare il processo di differenziazione, questo può essere affrontato aggiungendo i composti alla coltura durante le diverse fasi della coltura sommersa, durante la differenziazione o nella fase ben differenziata. La composizione cellulare della coltura ALI-PBEC può essere influenzata dall'aggiunta di composti specifici; ad esempio, differenziando gli ALI-PBEC in presenza di IL-13 si genera una coltura con più cellule caliciformi e meno cellule ciliate, mentre il trattamento con l'inibitore della γ-secretasi DAPT (usato per bloccare la segnalazione di Notch) durante la differenziazione si traduce in una coltura con più cellule ciliate a spese delle cellule caliciformi 23,40,41,42.
Inoltre, gli agenti per stimolare le cellule o bloccare determinati processi possono essere applicati al compartimento basale o (in un volume molto piccolo) al compartimento apicale della coltura. Le cellule possono anche essere esposte a sostanze aerodisperse dal lato apicale. Tali modelli di esposizione sono stati utilizzati per studiare l'effetto dei gas di scarico diesel o del fumo di sigaretta intero sui PBEC23,43,44. Il terreno può essere raccolto ogni volta che il terreno viene cambiato per monitorare le proteine secrete sul lato basale; lo stesso vale per il lato apicale delle cellule che viene lavato con PBS mentre rinfresca il mezzo basale. Il cosiddetto lavaggio apicale viene raccolto e viene aggiunto ditioeritritolo opzionale (DTE) per dissociare il muco prodotto dalle cellule caliciformi in modo più efficiente. Gli lisati cellulari possono essere ottenuti per l'isolamento di proteine totali, RNA e DNA cromosomico e mitocondriale. Le cellule possono essere ulteriormente studiate utilizzando anticorpi per marcatori specifici, tagliando la membrana di polietilene tereftalato (PET) dall'inserto di plastica e tagliando ulteriormente questa membrana in pezzi più piccoli per colorazioni multiple di immunofluorescenza45. Inoltre, la citometria a flusso o FACS può essere utilizzata anche dopo tripsinizzazione delle cellule negli inserti. Durante la fase ALI, lo sviluppo della barriera cellulare può essere monitorato misurando la resistenza elettrica e successivamente calcolando il TEER, dove la resistenza elettrica è inversamente proporzionale alla superficie dell'inserto della membrana. Il calcolo si basa sulla legge di Ohm utilizzando la seguente formula: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/65102/65102eq01.jpg" style="margin: auto;">, in cui Rm è la resistenza elettrica misurata, Rb è la resistenza elettrica di base di un inserto senza rivestimento e celle e SA è l'area superficiale della membrana dell'inserto. La misurazione della resistenza elettrica utilizzando elettrodi EVOM2 e STX / bacchette è semplice, ma dipende fortemente dalle procedure di manipolazione quando viene introdotta nel pozzo. Inoltre, è stato suggerito che la forma dell'elettrodo influenzi la misurazione della funzione barriera della superficie relativamente grande17.
Un ulteriore miglioramento del sistema di coltura cellulare ALI, volto ad aumentare la rappresentazione accurata dei tessuti, include la cocoltura di ulteriori tipi cellulari come leucociti, fibroblasti o cellule endoteliali46,47,48. È stato osservato che la co-coltura di ALI-PBEC con il fattore stimolante le colonie di granulociti-macrofagi (GM-CSF) o i macrofagi differenziati M-CSF influenza marcatamente le risposte epiteliali innate e la riparazione48. È importante notare che in tali modelli di cocultura, la compatibilità media può essere un problema. Poiché il mezzo utilizzato per la coltura di cellule epiteliali delle vie aeree è sviluppato specificamente per i PBEC e potrebbe non essere adatto in modo ottimale per altri tipi di cellule, è necessaria un'ottimizzazione. Un altro tipo di progresso osservato nel campo della biologia delle vie aeree per il quale possono essere utilizzati PBEC isolati è l'uso della tecnologia Organs-on-Chips (OoC)49,50. Utilizzando questa tecnologia, l'influenza delle forze meccaniche della respirazione e del flusso sanguigno, come l'allungamento, l'aria e il flusso medio, può essere studiata 29.
La variabilità tra donatori può essere significativa quando si utilizzano PBEC di vari donatori e pertanto è importante considerare l'utilizzo di cellule di diversi donatori per tenere conto di questa variabilità negli studi di coltura di cellule epiteliali. Poiché la coltura di ALI-PBEC richiede molto tempo e comporta costi considerevoli, viene esaminata l'opzione di stabilire colture ALI-PBEC mescolando cellule di donatori diversi in un inserto di coltura cellulare. In questo modo, gli esperimenti pilota possono essere facilmente eseguiti utilizzando cellule primarie, prima di analizzare le risposte delle colture derivate da vari singoli donatori. Inoltre, i donatori con caratteristiche diverse (ad esempio, diversa categoria di età o sesso) possono essere raggruppati per studi esplorativi. Quando si utilizzano miscele di donatori, è importante assicurarsi che siano presenti numeri di cellule uguali di donatori diversi, per evitare la possibilità che un donatore domini i risultati a causa di un tasso di proliferazione più elevato. Pertanto, le cellule dei singoli donatori vengono espanse separatamente e seminate a una densità più elevata nell'inserto rispetto alle cellule di semina di un singolo donatore, per ridurre al minimo la proliferazione nell'inserto prima della transizione all'ALI. Le risposte dei mix di donatori e dei singoli donatori corrispondenti sono state confrontate studiando la cinetica di infezione di SARS-CoV-2. Utilizzando RT-qPCR e colorazione a immunofluorescenza, è stato osservato che il mix di donatori ha fornito una buona rappresentazione dei vari singoli donatori, mostrando un numero simile di particelle virali prodotte e un numero simile di cellule infette28.
Per diventare un'alternativa accettabile per i modelli animali, l'editing genetico di cellule epiteliali bronchiali in coltura dovrebbe essere fattibile51. Viene esaminata la tecnologia di interferenza dell'RNA utilizzando piccoli RNA interferenti (siRNA) negli ALI-PBEC, tuttavia poiché le cellule devono essere trasfettate con siRNA durante la fase sommersa della coltura, il knockdown non è sufficientemente mantenuto durante la coltura ALI a causa della lunga durata della coltura, a meno che la trasfezione di siRNA non venga frequentemente ripetuta durante la coltura52. Tuttavia, i siRNA possono essere utilizzati con successo per modificare l'espressione genica nelle cellule basali sommerse. Altri hanno utilizzato con successo la tecnologia CRISPR / Cas9 per ottenere l'editing genetico in colture primarie di cellule epiteliali delle vie aeree ALI con rilascio di ribonucleoproteina (RNP) 53. Quando si utilizzano tali tecniche, è essenziale che le cellule mantengano la loro piena capacità di differenziazione. Poiché le colture cellulari primarie delle vie aeree non possono essere passate indefinitamente, l'espansione clonale delle cellule geneticamente modificate non è facile e l'aggiunta di terreno per selezionare le cellule trasfettate è ingombrante. Pertanto, è difficile ottenere il knockdown desiderabile in tutte le cellule coltivate. Un'alternativa per generare cloni knockout è l'uso di strategie knock-out in hiPSCs54 e l'uso di queste cellule per generare cellule epiteliali delle vie aeree. Un'altra alternativa, anche se non ottimale, è stabilire una linea PBEC immortalata per espandere clonalmente le cellule geneticamente modificate55.
Il protocollo presentato qui è un modo per generare un ALI-PBEC pseudostratificato ben differenziato, ma sono stati trovati anche altri protocolli per stabilire una tale cultura, con differenze sempre più piccole rispetto al protocollo presentato. A nostro avviso, attraverso la validazione in laboratorio dei metodi di coltura e un rigoroso controllo di qualità sono essenziali affinché il sistema ALI-PBEC e simili sistemi di coltura di cellule epiteliali delle vie aeree, diventino una valida alternativa per gli esperimenti sugli animali.

Il ruolo dell'epitelio delle vie aeree in una varietà di malattie polmonari acute e croniche è stato descritto in varie revisioni 1,2,3,4,5,6,7. Colture ben differenziate di cellule epiteliali delle vie aeree sono uno strumento importante per svelare il ruolo dell'epitelio delle vie aeree. La coltura di cellule epiteliali delle vie aeree con interfaccia aria-liquido (ALI) è ampiamente applicata per promuovere la differenziazione delle cellule epiteliali basali delle vie aeree e quindi studiare l'epitelio delle vie aeree in modo affidabile in vitro 8,9. Negli ultimi anni, l'uso di tali modelli è aumentato ulteriormente a seguito di nuove iniziative di ricerca legate alla pandemia di COVID-19 e di una transizione mondiale verso la ricerca senza animali. Pertanto, l'aumento dell'uso di questa linea cellulare modello sottolinea la necessità di condividere procedure ed esperienze per ottenere risultati solidi. Ciò consentirà anche il confronto dei risultati tra gruppi di ricerca. La robustezza della procedura è la caratteristica chiave e quindi deve essere sottoposta a controllo di qualità. Diversi laboratori hanno investito nello sviluppo di protocolli per la coltura di cellule epiteliali primarie delle vie aeree presso l'ALI. Il tempo, l'impegno e il budget richiesto possono essere ridotti quando queste procedure sono condivise in dettaglio. Questi dettagli includono, ad esempio, la scelta di plastiche e terreni di coltura cellulare forniti da vari produttori, poiché si è scoperto che ciò influenza le caratteristiche delle colture ottenute10,11,12. Ciò sottolinea l'importanza di condividere esperienze e dettagli delle procedure colturali, poiché in assenza di tali approfondimenti, i risultati possono essere influenzati e / o gli sforzi di convalida tra i vari laboratori possono essere ostacolati.
L'epitelio polmonare umano comprende vari tipi di cellule, compresi i tipi principali come cellule basali, cellule ciliate, cellule caliciformi e cellule club. Al fine di imitare in modo affidabile lo strato cellulare epiteliale nelle vie aeree in vitro, questi tipi di cellule devono essere rappresentati nei modelli di coltura e la loro polarizzazione e funzione mantenute13,14,15,16. La consapevolezza che le caratteristiche del donatore (incluso lo stato di malattia) e l'origine anatomica delle cellule (cioè vie aeree nasali, tracheali, grandi e piccole) possono influenzare la composizione cellulare e le risposte funzionali della coltura cellulare è altrettanto importante. Le competenze e le pratiche pertinenti sono un prerequisito per coltivare con successo cellule epiteliali primarie delle vie aeree e valutare la qualità della coltura sia intuitivamente (mediante ispezione visiva durante la coltura) che quantificabile. Lo scopo di questo contributo è quello di fornire un metodo economico e tempestivo per l'isolamento e la coltura di cellule epiteliali bronchiali umane primarie (PBEC) che può essere applicato anche alla coltura di cellule epiteliali tracheali e delle piccole vie aeree. Oltre a descrivere un metodo per isolare tali cellule dal tessuto polmonare resecato, viene presentato e discusso un metodo per l'espansione e il biobanking e, infine, per la creazione e la caratterizzazione di una coltura ALI ben differenziata entro un ragionevole costo e periodo di tempo.

<table><tbody><tr><td>Resistore di prova da 1.000 ohm</td><td>World Precision Instruments</td><td>N/A</td><td>Utilizzato per calibrare il voltohmmetro epiteliale EVOM2</td></tr><tr><td>Acido 4-[2-(5,6,7,8-Tetraidro-5,5,8,8-tetrametil-2-naftalenil)etinil)-benzoico (EC 23)</td><td>Tocris</td><td>4011</td><td>Utilizzato in cBD medium</td></tr><tr><td>Piastre a pozzetti multipli trasparenti trattate con TC a 6 pozzetti</td><td>Corning</td><td>3506</td><td>Utilizzato nella prima fase per far crescere le cellule isolate dai bronchi squillo&nbsp;</td></tr><tr><td>Kit di terreno per la crescita delle cellule epiteliali delle vie aeree</td><td>PromoCell</td><td>C-21160</td><td>Utilizzato per il confronto con il cBD medium</td></tr><tr><td>Bead Bath 20 litri</td><td>Lab Armor</td><td>74220-720</td><td>Utilizzato per preriscaldare le soluzioni di coltura cellulare</td></tr><tr><td>BEGM BulletKit del terreno per la crescita delle cellule epiteliali bronchiali LONZA</td><td></td><td>CC-3170</td><td>Utilizzato per il confronto con il cBD medium</td></tr><tr><td>Frazione di albumina bovina V (BSA)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15260037</td><td>Utilizzato nella soluzione di rivestimento</td></tr><tr><td>Estratto ipofisario bovino (BPE)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>37000-015</td><td>Utilizzato in c-KSFM</td></tr><tr><td>Integratore per la crescita delle cellule epiteliali bronchiali (BEpiCGS)</td><td>ScienCell Research Laboratories</td><td>3262</td><td>Utilizzato in cBD medio</td></tr><tr><td>Cellule epiteliali bronchiali medio-basali (BEpiCM-b)</td><td>ScienCell Research Laboratories</td><td>SCC3211-b</td><td>Utilizzato in cBD medio</td></tr><tr><td>Inserti per colture cellulari; Pozzetto da 12 mm con 0,4 &micro; inserto a membrana in poliestere a poro</td><td>m Corning</td><td>3460</td><td>Inserti per colture cellulari utilizzati nel protocollo</td></tr><tr><td>Inserti per colture cellulari; inserti a 12 pozzetti, 0,4 &micro; m PET trasparente</td><td>CellQART prodotto da SABEU</td><td>9310412</td><td>Inserti per colture cellulari utilizzati per il confronto con gli inserti per colture cellulari Corning</td></tr><tr><td>Inserti per colture cellulari; Inserti per colture tissutali ThinCert a 12 pozzetti</td><td>Greiner Bio-One</td><td>82050-032</td><td>Inserti per colture cellulari utilizzati per il confronto con gli inserti per colture cellulari Corning</td></tr><tr><td>Pallone CELLSTAR, TC, PS, 250 ml, 75 cm2</td><td>Greiner Bio-One</td><td>658170</td><td>Utilizzato per espandere il numero di cellule</td></tr><tr><td>CFX Maestro 1.0</td><td>Bio-Rad</td><td>N/A</td><td>Programma software per l'analisi dei dati qPCR generati con il sistema CFX384</td></tr><tr><td>Sistema di rilevamento PCR in tempo reale CFX384 Touch Sistema di rilevamento</td><td>Bio-Rad</td><td>1855484</td><td>qPCR</td></tr><tr><td>Set di elettrodi a bacchetta World</td><td>Precision Instruments</td><td>STX2</td><td>Utilizzato per misurare la resistenza elettrica in ALI-PBEC</td></tr><tr><td>CO2-Incubator</td><td>PHCbi</td><td>MCO-170AICUV-PE</td><td>Incubatore per colture cellulari prive</td></tr> di <tr><td>micoplasma CO2-Incubatore</td><td>Hereaus</td><td>Heracell 150</td><td>Incubatore per colture cellulari utilizzato per colture cellulari potenzialmente infette da micoplasma</td></tr><tr><td>Coolcell Container</td><td>Corning</td><td>432006</td><td>Utilizzato per crioconservare le cellule a -80 &deg; C prima del trasferimento al liquido N2</td></tr><tr><td>Countess 3 Contatore di cellule automatizzato</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AMQAX2000</td><td>Utilizzato per contare le cellule e determinare la concentrazione cellulare</td></tr><tr><td>Cryovials</td><td>Nalgene</td><td>479-3224</td><td>Utilizzato per crioconservare le cellule in</td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Avantor VWR BDH CHEMICALS</td><td>101174Y</td><td>Utilizzato in tripsina morbida</td></tr><tr><td>dimetil solfossido (DMSO)</td><td>Avantor VWR</td><td>0231</td><td>Utilizzato nel terreno di congelamento cellulare</td></tr><tr><td>dNTP (10 mM)</td><td>Promega</td><td>U1515</td><td>Utilizzato nella sintesi del cDNA</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) + 4500 mg/l D-glucosio</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>36250</td><td>Utilizzato in cBD</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) 4,5 g/l di glucosio con l-glutammina</td><td></td><td>LONZA LOBE12-604F</td><td>Utilizzato nel mezzo cBD per il confronto con DMEM di altri produttori&nbsp;</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), alto glucosio, piruvato</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>41966029</td><td>Utilizzato nel terreno cBD per confrontare con DMEM di altri produttori&nbsp;</td></tr><tr><td>Fattore di crescita epidermico (EGF)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>37000-015</td><td>Utilizzato in c-KSFM</td></tr><tr><td>Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)</td><td>Avantor VWR BDH CHEMICALS</td><td>443885J</td><td>Utilizzato in tripsina morbida</td></tr><tr><td>EVOM2 Voltohmmetro epiteliale</td><td>World Precision Instruments</td><td>91799</td><td>Utilizzato con il set di elettrodi a bacchetta per misurare la resistenza elettrica in soluzione di</td></tr><tr><td>fibronectina ALI-PBEC, umano&nbsp;</td><td>PromoCell</td><td>C-43060</td><td>Utilizzato nella soluzione di rivestimento</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050038</td><td>Utilizzato in cBD medium</td></tr><tr><td>Hanks soluzione salina bilanciata (HBSS)</td><td>ScienCell Research Laboratories</td><td>SCC0313</td><td>Utilizzato per sciogliere la proteasi XIV&nbsp;</td></tr><tr><td>IQ SYBR Green Super mix</td><td>Bio-Rad</td><td>170887</td><td>reagente qPCR</td></tr><tr><td>Isoproterenolo cloridrato, (-)-</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I-6504</td><td>Utilizzato in c-KSFM</td></tr><tr><td>Cheratinocita-SFM (KSFM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17005-034</td><td>Utilizzato in c-KSFM</td></tr><tr><td>Maxwell RSC Instrument</td><td>Promega</td><td>AS4500</td><td>Sistema automatizzato di isolamento dell'RNA</td></tr><tr><td>Maxwell RSC simplyRNA Tissue Kit</td><td>Promega</td><td>AS1340</td><td>Utilizzato per isolare l'RNA totale con lo strumento Maxwell RSC</td></tr><tr><td>M-MLV Trascrittasi inversa</td><td>Promega</td><td>M5301</td><td>Utilizzato nella sintesi del cDNA</td></tr><tr><td>M-MLV Trascrittasi inversa 5X tampone di reazione</td><td>Promega</td><td>M531A</td><td>Utilizzato nella sintesi del cDNA</td></tr><tr><td>MycoStrip</td><td>InvivoGen</td><td>rep-mys-10</td><td>Utilizzato per rilevare la presenza di micoplasma in campioni di coltura cellulare</td></tr><tr><td>N-2-idrossietilpiperazina-N-2-etano acido solfonico (HEPES)</td><td>Thermo Fisher Scientific 15630056</td><td></td><td>Utilizzato nel mezzo cBD</td></tr><tr><td>Oligo(dT)15</td><td>Qiagen</td><td>79237</td><td>Utilizzato nella sintesi della soluzione cDNA</td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina (Pen/Strep)</td><td>ScienCell Research Laboratories</td><td>SCC0513</td><td>Utilizzato come antibiotico nel c-KSFM e nel mezzo cBD</td></tr><tr><td>Fosfato tamponato soluzione salina (PBS)</td><td>LUMC farmacia</td><td>N/A</td><td>Utilizzato in diverse fasi del protocollo</td></tr><tr><td>Pneumacult-ALI Medium</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>05002</td><td>Utilizzato per far crescere cellule nella fase di differenziazione da confrontare con il mezzo cBD</td></tr><tr><td>Pneumacult-Ex Plus Medium</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>05040</td><td>Utilizzato per far crescere cellule in fase sommersa da confrontare con il mezzo cBD</td></tr><tr><td>Primer, ATP5B,</td><td>forward Integrated DNA Tecnologie</td><td>N/A</td><td>Sequenza nucleotidica: TCACCCAGGCTGGTTCAGA</td></tr><tr><td>Primer, ATP5B, reverse</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td>Sequenza nucleotidica: AGTGGCCAGGGTAGGCTGAT</td></tr><tr><td>Primer, FOXJ1, forward</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td>Sequenza nucleotidica: GGAGGGGACGTAAATCCCTA</td></tr><tr><td>Primer, FOXJ1, reverse</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td>Sequenza nucleotidica: TTGGTCCCAGTAGTTCCAGC</td></tr><tr><td>Primer, MUC5AC, forward</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td>Sequenza nucleotidica: CCTTCGACGGACAGAGCTAC</td></tr><tr><td>Primer, MUC5AC, reverse</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td>Sequenza nucleotidica: TCTCGGTGACAACACGAAAG</td></tr><tr><td>Primer, MUC5B, forward</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td>Sequenza nucleotidica: GGGCTTTGACAAGAGAGT</td></tr><tr><td>Primer, MUC5B, inverso</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td>Sequenza nucleotidica: AGGATGGTCGTGTTGATGCG</td></tr><tr><td>Primer, RPL13A, forward</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td>Sequenza nucleotidica: AAGGTGGTGGTCGTACGCTGTG</td></tr><tr><td>Primer, RPL13A, reverse</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td>Sequenza nucleotidica: CGGGAAGGGTTGGTGTTCATCC</td></tr><tr><td>Primer, SCGB1A1, forward</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td>Sequenza nucleotidica: ACATGAGGGAGGCAGGGGCTC</td></tr><tr><td>Primer, SCGB1A1, reverse</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td>Sequenza nucleotidica: ACTCAAAGCATGGCAGCGGCA</td></tr><tr><td>Primer, TP63, forward</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td>Sequenza nucleotidica: CCACCTGGACGTATTCCACTG</td></tr><tr><td>Primer, TP63, reverse</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td>Sequenza nucleotidica: TCGAATCAAATGACTAGGAGGGG</td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pm-2</td><td>Utilizzato come agente antimicrobico contro batteri, micoplasmi e funghi nel mezzo c-KSFM</td></tr><tr><td>Proteasi XIV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5147</td><td>Utilizzato per il trattamento enzimatico dell'RNAsina dell'anello bronchiale</td></tr><tr><td>Inibitore ribonucleasi ricombinante</td><td>Promega</td><td>N2515</td><td>Utilizzato nella sintesi del cDNA</td></tr><tr><td>Inibitore della tripsina di soia ( SBTI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9128</td><td>Utilizzato per inibire l'azione della tripsina morbida</td></tr><tr><td>T100 Termociclatore</td><td>Bio-Rad</td><td>1861096</td><td>Utilizzato nella sintesi di cDNA</td></tr><tr><td>TissueSAFE plus</td><td>MILESTONE MEDICAL</td><td>N/A</td><td>Sistema di trasferimento sottovuoto per campioni biologici</td></tr><tr><td>Soluzione di tripano Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>15250061</td><td>Utilizzato per contare cellule vive e morte&nbsp;</td></tr><tr><td>Tripsina 1:250</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>27250-018</td><td>Utilizzato in soluzione di collagene di tripsina morbida</td></tr><tr><td>di tipo I (PureCol)</td><td>Advanced BioMatrix</td><td>5005-B</td><td>Utilizzato in soluzione di rivestimento</td></tr><tr><td>Contenitore universale, PP, con tappo a vite in PE</td><td>Avantor VWR</td><td>216-2053</td><td>Utilizzato nel protocollo per il trattamento della proteasi XIV dell'anello bronchiale</td></tr></tbody></table>

isolare le cellule epiteliali bronchiali dal tessuto polmonare resecato per il biobanking e stabilire colture di interfaccia aria-liquido ben differenziate

Isolating Bronchial Epithelial Cells from Resected Lung Tissue for Biobanking and Establishing Well-Differentiated Air-Liquid Interface Cultures

Lo strato di cellule epiteliali delle vie aeree costituisce la prima barriera tra il tessuto polmonare e l'ambiente esterno ed è quindi costantemente esposto a sostanze inalate, compresi agenti infettivi e inquinanti atmosferici. Lo strato epiteliale delle vie aeree svolge un ruolo centrale in una grande varietà di malattie polmonari acute e croniche e vari trattamenti mirati a questo epitelio vengono somministrati per inalazione. Comprendere il ruolo dell'epitelio nella patogenesi e come può essere mirato alla terapia richiede modelli robusti e rappresentativi. I modelli di coltura epiteliale in vitro sono sempre più utilizzati e offrono il vantaggio di eseguire esperimenti in un ambiente controllato, esponendo le cellule a diversi tipi di stimoli, tossici o agenti infettivi. L'uso di cellule primarie al posto di linee cellulari immortalizzate o tumorali ha il vantaggio che queste cellule si differenziano in coltura per uno strato cellulare epiteliale polarizzato pseudostratificato con una migliore rappresentazione dell'epitelio rispetto alle linee cellulari.
Qui è presentato un protocollo robusto, che è stato ottimizzato negli ultimi decenni, per l'isolamento e la coltura di cellule epiteliali delle vie aeree dal tessuto polmonare. Questa procedura consente di isolare, espandere, coltivare e differenziare mucociliare con successo le cellule epiteliali bronchiali primarie (PBEC) mediante coltura all'interfaccia aria-liquido (ALI) e include un protocollo per il biobanking. Inoltre, viene descritta la caratterizzazione di queste colture utilizzando geni marcatori cellula-specifici. Queste colture ALI-PBEC possono essere utilizzate per una vasta gamma di applicazioni, tra cui l'esposizione al fumo di sigaretta intero o ai mediatori infiammatori e la co-coltura / infezione con virus o batteri. 
Il protocollo fornito in questo manoscritto, che illustra la procedura in modo graduale, dovrebbe fornire una base e / o un riferimento per coloro che sono interessati a implementare o adattare tali sistemi di coltura nel loro laboratorio.

Espansione mediante coltura sommersa Utilizzando il metodo qui presentato, una media di otto crioviali con 400.000 cellule/crioviale può essere ottenuta da una piastra a 6 pozzetti per la conservazione a lungo termine in azoto liquido (Figura 2A). Per raggiungere questo obiettivo, i PBEC isolati vengono coltivati in piastre a 6 pozzetti per un minimo di 7 giorni e un massimo di 14 giorni (Figura 2B) in presenza di Primocina per escludere la contaminazione microbica (in particolare micoplasma). La figura 2A,B fornisce informazioni sul numero di cellule ottenute e sul tempo di coltura richiesto tra i diversi isolamenti da vari donatori. Prima di raccogliere le cellule mediante tripsinizzazione per la conservazione in azoto liquido, la confluenza deve essere superiore all'80%. Se questo non viene raggiunto entro 14 giorni, le cellule non devono essere crioconservate. È importante sottolineare che, durante la raccolta per lo stoccaggio e il passaggio, la confluenza dello strato cellulare non deve superare ~ 95% (Figura 2C). Dopo lo stoccaggio in azoto liquido, le cellule possono essere scongelate e coltivate per l'espansione fino a ottenere un numero sufficiente di cellule per le colture di ALI. Il mezzo utilizzato per l'espansione delle cellule in questa fase è c-KSFM, simile a quello della coltura iniziale dopo il prelievo dall'anello bronchiale18. Non vi è tuttavia alcuna necessità di Primocin in questa fase, perché il rischio di ulteriore contaminazione microbica proveniente dal tessuto polmonare è assente, e quindi Primocin può essere cambiato per penicillina / streptomicina. Questo mezzo favorisce le cellule epiteliali rispetto ai fibroblasti e quindi previene la possibile crescita eccessiva della coltura con una proliferazione più rapida dei fibroblasti 19,20,21. Utilizzando il mezzo c-KSFM, le cellule sono distribuite nel pallone e non si collegano tra loro, il che è marcatamente diverso dalla morfologia delle cellule in coltura immerse in questa fase nel mezzo cBD (Figura 2D,E). Dopo 5 o 6 giorni di coltura delle cellule scongelate in un pallone T75, lo strato cellulare dovrebbe essere confluente all'80% -95%, il che si traduce in circa 3 x 106 cellule in totale (Figura 2F). Da questo, è possibile generare circa 75 inserti (dimensioni della piastra a 12 pozzetti) per la coltura ALI.
Il metodo per l'isolamento e la coltura descritto in questo contributo può anche essere adattato per l'uso con biopsie bronchiali o spazzole bronchiali come materiale di partenza.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65102/65102fig02.jpg"> Figura 2: Espansione delle cellule basali prima e dopo la crioconservazione. Le cellule sono state isolate secondo il protocollo descritto e coltivate utilizzando c-KSFM. Il numero di cellule generate per donatore è stato monitorato, i conteggi delle cellule vive sono stati eseguiti utilizzando un contatore automatico delle cellule (A) durante la raccolta delle cellule di passaggio 0 (P0) dalle piastre a 6 pozzetti (fase 2 del protocollo), n = 123 donatori, il conteggio delle cellule è stato presentato come il numero di cellule raccolte per pozzetto; Ogni punto rappresenta un donatore e la mediana è indicata da una barra orizzontale. (B) Come parte del controllo di qualità, il tempo richiesto dalle cellule P0 per raggiungere l'80% al 90% di confluenza nelle piastre a 6 pozzetti è stato monitorato e mostrato come giorni dopo l'inizio della coltura sommersa in c-KSFM (n = 127 donatori diversi). Ogni singolo donatore è indicato da un punto, tutti i punti appartenenti a 1 giorno si fondono in una linea; più ampia è la linea, più donatori rappresenta; Il numero mediano di giorni in cui le cellule sono in coltura è indicato da una barra orizzontale più sottile. (C) Immagine rappresentativa in campo chiaro delle cellule P0 cresciute sommerse in c-KSFM nel momento in cui le cellule sono state raccolte per la crioconservazione a lungo termine. (D) Immagine rappresentativa in campo chiaro delle cellule P1 cresciute sommerse in c-KSFM nel momento in cui le cellule sono state raccolte e trasferite in inserti e (E) cellule P1 cresciute immerse in mezzo cBD. (F) Il numero di cellule vive generate per donatore è stato monitorato utilizzando un contatore automatico di cellule al momento del prelievo di cellule P1 dal matraccio T75 (sezione 4 del protocollo), n = 63 donatori diversi; la conta cellulare è presentata come il numero di cellule per pallone T75, ogni donatore è indicato da un punto e la conta cellulare mediana è indicata da una barra orizzontale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65102/65102fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
Coltura dell'interfaccia aria-liquido (ALI) A 7 giorni dall'inizio della coltura di ALI, viene misurata la resistenza elettrica dello strato cellulare e dovrebbe essere superiore a 300 Ω (Figura 3A); Se ciò non viene raggiunto, la cultura è considerata fallita a causa di una possibile mancanza di formazione di giunzioni strette. Si raccomanda di escludere la possibilità di ottenere bassi valori di TEER causati da danni allo strato epiteliale in singoli inserti derivanti, ad esempio, da danni allo strato cellulare durante il lavaggio e l'aspirazione. Questo può essere verificato mediante ispezione visiva microscopica degli inserti di coltura. Nella nostra esperienza, la variabilità inter-donatore nella resistenza elettrica può essere significativa (Figura 3B), che è anche riportata nella letteratura14, e come osservato è anche marcatamente influenzata dall'origine del mezzo di aquila modificato di Dulbecco (DMEM) utilizzato (Figura 3C).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65102/65102fig03.jpg"> Figura 3: Resistenza elettrica transepiteliale come controllo di qualità delle colture ALI-PBEC. I PBEC sono stati isolati ed ampliati e sono state stabilite colture ALI-PBEC ben differenziate. In diversi momenti durante la coltura è stata misurata la resistenza elettrica e successivamente è stato calcolato il TEER (Ω·cm2). (A) La resistenza elettrica è stata misurata nel corso di 14 giorni post-ALI. n = 4 donatori diversi. I dati sono rappresentati come il valore medio ± deviazione standard (SD). (B) Nell'ambito del controllo di qualità della coltura cellulare ALI-PBEC, la resistenza elettrica è stata misurata al giorno 7 (n = 50) e al giorno 14 post-ALI (n = 25); ogni punto rappresenta un donatore e il TEER mediano (Ω·cm2) è indicato da una barra orizzontale. I dati sono stati testati per la significatività utilizzando un test di Mann-Whitney non parametrico e non è stata trovata alcuna differenza significativa. (C) I media di tre diversi fornitori di DMEM sono stati testati per valutare l'influenza sulla formazione di TEER. n = 4 donatori diversi; i valori medi sono rappresentati ± SD. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65102/65102fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
Mentre si stabilisce una coltura ALI-PBEC ben differenziata, dall'inizio dell'esposizione all'aria, la concentrazione di RA aumentadi 22. In questo modo, le cellule passano dalla proliferazione alla differenziazione mucociliare, che è visibile già da 9 giorni (dipendente dal donatore) dopo l'esposizione all'aria utilizzando la microscopia a campo chiaro. Il movimento delle prime ciglia è visibile a questo punto, e un po 'prima quando si basa sull'espressione genica dei marcatori delle cellule luminali differenziate23 (Figura 4).
Come descritto nel protocollo, la produzione di muco può essere osservata anche durante il risciacquo della superficie apicale durante il cambio del mezzo. L'AR è molto sensibile alla luce, il che porta ad un'attività altamente variabile alla stessa concentrazione di stock. Per questo motivo, RA è sostituito dall'analogo sintetico RA EC 23 e utilizzato nella stessa concentrazione, con risultati simili a quelli determinati sperimentalmente. Per questo motivo e per evitare di modificare la procedura, la concentrazione EC 23 selezionata è stata mantenuta uguale alla concentrazione RA (cioè 50 nM) precedentemente utilizzata24,25 (Figura 5). La figura 5A mostra i valori TEER raggiunti quando si utilizzano diverse concentrazioni di EC 23, mostrando un TEER massimo a 50 nM all'interno di questo intervallo di concentrazioni testate. I risultati mostrati nella Figura 5B confermano che l'espressione genica dei marcatori per le cellule ciliate e caliciformi è simile quando si utilizza 50 nM EC 23 o RA. EC 23 è richiesto anche durante la coltura allo stadio sommerso (anche se ad una concentrazione molto più bassa), poiché ometterlo in questo stadio sommerso e aggiungerlo solo allo stadio ALI si ottiene una coltura che non raggiunge mai la piena confluenza. Il tempo necessario per generare una coltura ALI-PBEC ben differenziata con attività di battitura ciliare visibile e produzione di muco è di circa 14 giorni, e la maggior parte degli esperimenti sono quindi iniziati tra colture ALI di 14-21 giorni (Figura 4). Tutti i principali tipi di cellule diverse (basale, ciliata, calice e cellule club) sono osservati dopo 14 giorni di coltura ALI, sebbene i livelli di espressione siano altamente dipendenti dal donatore. Ciò è dimostrato valutando l'espressione genica di TP63, FOXJ1, MUC5AC e SCGB1A1 mediante RT-qPCR, o l'espressione proteica utilizzando anticorpi diretti contro p63, α-tubulina, Muc5AC e CC-16 mediante colorazione a fluorescenza immunitaria (IF), per rilevare marcatori per cellule basali, ciliate, caliciforme e club, rispettivamente25,26. Tuttavia, mentre 14-21 giorni possono essere considerati una regola empirica per la maggior parte degli esperimenti, per esperimenti selezionati, può essere presa in considerazione una durata più lunga della differenziazione, come riscontrato per il metabolismo xenobiotico, l'infezione da SARS-CoV-2 e la valutazione della clearance mucociliare27,28,29.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65102/65102fig04.jpg"> Figura 4: Coltura dell'interfaccia aria-liquido (ALI). I PBEC sono stati isolati ed ampliati e sono state stabilite colture ALI-PBEC ben differenziate. Le colture ALI-PBEC sono state monitorate nel corso di 14 giorni post-ALI. Le colture cellulari sono state lisate per l'isolamento dell'RNA nei giorni 0, 7 e 14 post-ALI. Vengono mostrati i dati di due donatori diversi, ogni punto rappresenta un singolo donatore monitorato nel tempo e la mediana è indicata da una barra orizzontale. L'espressione genica dei marcatori basali, ciliati, calici e delle cellule club (TP63, FOXJ1, MUC5B e SCGB1A1, rispettivamente) è stata misurata mediante qPCR e normalizzata per l'espressione genica di RPL13A e ATP5B (vedere riferimento 23 per i dettagli). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65102/65102fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65102/65102fig05.jpg"> Figura 5: Confronto tra l'acido retinoico (RA) e il suo analogo sintetico EC 23. I PBEC sono stati isolati ed ampliati e sono state stabilite colture ALI-PBEC ben differenziate. All'inizio dell'esposizione all'aria delle colture PBEC, RA (50 nM) è stato sostituito da varie concentrazioni di EC 23. (A) La resistenza elettrica è stata misurata al giorno 14 post-ALI e successivamente è stato calcolato il TEER (Ω·cm 2), n =2 donatori, le barre rappresentano il valore medio ± SD. (B) Al giorno 14 post-ALI, le colture cellulari sono state lisate per l'isolamento dell'RNA e la successiva analisi dell'espressione genica di marcatori cellulari rispettivamente per cellule ciliate e caliciformi (FOXJ1, MUC5AC) utilizzando qPCR, e normalizzato per RPL13A (n = 3 donatori). Un aumento di piega è mostrato rispetto ad ALI-PBEC coltivato con 50 nM RA e rappresentato come valore medio ± SD. (Vedi riferimento 23 per i dettagli) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65102/65102fig05large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
Negli ultimi anni sono state esaminate le prestazioni di prodotti alternativi nel sistema di coltura, come i terreni e le materie plastiche di coltura. Tali valutazioni hanno avuto varie ragioni, tra cui cambiamenti nella composizione del mezzo da parte dei produttori, nuovi media introdotti e una carenza di prodotti durante la pandemia di COVID-19 (2020-2022). È stato osservato che prodotti simili di fornitori diversi danno luogo a colture cellulari epiteliali differenziate basate sulla valutazione dei marcatori dei tipi di cellule epiteliali, sebbene la composizione cellulare finale possa variare sostanzialmente (Figura 6A), mentre le differenze nel TEER erano meno pronunciate (Figura 6B). D'altra parte, i terreni di diversi fornitori hanno comportato differenze sostanziali nella composizione cellulare; quando si utilizzavano inserti di marche diverse, tali differenze erano limitate (Figura 6C). In particolare, quando si utilizza il terreno di coltura cellulare epiteliale delle vie aeree PneumaCult di STEMCELL Technologies, è stata osservata una morfologia diversa e una formazione più rapida dell'attività ciliare visibile. Oltre a queste osservazioni, è stata notata anche una differenza nei valori di TEER e una differenza nella composizione cellulare dell'ALI-PBEC rispetto al mezzo cBD (Figura 6D).
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65102/65102fig06.jpg"> Figura 6: Confronto tra diversi fornitori di terreno cellulare epiteliale e inserti di coltura cellulare. Le PBEC sono state isolate, espanse e sono state stabilite culture ALI-PBEC ben differenziate. (A) GLI ALI-BBEC sono stati coltivati per 14 giorni, quindi gli strati cellulari sono stati lisati per l'isolamento dell'RNA. L'espressione genica dei marcatori basali, ciliati, calici e delle cellule club (TP63, FOXJ1, MUC5AC e SCGB1A1, rispettivamente) è stata misurata mediante qPCR e normalizzata per RPL13A e ATP5B. n = 2 donatori; le barre rappresentano il valore medio ± SD. (B) Nel corso di 9 giorni post-ALI, è stata misurata la resistenza elettrica e successivamente è stato calcolato il TEER (Ω·cm2). n = 3 donatori diversi; I valori medi sono rappresentati ± SD. (C) ALI-PBEC sono stati coltivati per 14 giorni utilizzando inserti di coltura cellulare acquistati da tre diversi fornitori, quindi gli strati cellulari sono stati lisati per l'isolamento dell'RNA. L'espressione genica dei marcatori ciliati, calici e delle cellule club (FOXJ1, MUC5AC e SCGB1A1, rispettivamente) è stata misurata mediante qPCR e normalizzata per RPL13A. n = 18 donatori diversi, le barre rappresentano il valore medio ± SD. I dati sono stati testati per la significatività utilizzando un test di Kruskal-Wallis non parametrico ANOVA unidirezionale e non è stata trovata alcuna differenza significativa. (D) Gli ALI-PBEC sono stati coltivati in mezzo cBD o in mezzo PneumaCult (tecnologie STEMMCELL) per 14 giorni post-ALI, e poi gli strati cellulari sono stati lisati per l'isolamento dell'RNA. L'espressione genica dei marcatori basali, ciliati, calici e delle cellule club (TP63, FOXJ1, MUC5B e SCGB1A1, rispettivamente) è stata misurata mediante qPCR e normalizzata per RPL13A (le barre rappresentano il valore medio ± SD), e la resistenza elettrica è stata misurata ai giorni 5 e 12 post-ALI e utilizzata per calcolare il TEER (Ω·cm2). n = 2; il valore medio è rappresentato ± SD (vedere riferimento 23 per i dettagli). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65102/65102fig06large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
Tabella supplementare 1: Composizione delle soluzioni e dei mezzi utilizzati nel protocollo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65102/Supplementary%20Table%201.xlsx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>

Presentato qui è un metodo riproducibile, economico e robusto per l'isolamento e l'espansione delle cellule epiteliali bronchiali primarie per il biobanking a lungo termine e la generazione di cellule epiteliali differenziate mediante coltura all'interfaccia aria-liquido.

Isolare le cellule epiteliali bronchiali dal tessuto polmonare resecato per il biobanking e stabilire colture di interfaccia aria-liquido ben differenziate

The airway epithelial cell layer forms the first barrier between lung tissue and the outside environment and is thereby constantly exposed to inhaled ...

Questo protocollo è un metodo robusto ed economico che può essere utilizzato per affrontare una varietà di domande di ricerca relative alla funzione e al ruolo delle cellule epiteliali delle vie aeree nella salute e nella malattia. Il vantaggio principale di questa tecnica è che si traduce in uno strato cellulare che è una buona rappresentazione dello strato cellulare epiteliale umano, compresa la produzione di muco e l'attività ciliare. Questa tecnica è versatile e può essere utilizzata per studiare insulti o terapie correlati alla malattia.Per iniziare, sciacquare l'anello bronchiale isolato dal tessuto polmonare umano con 10 millilitri di PBS sterile in una capsula di Petri di 10 centimetri. Mentre si tiene l'anello con una pinzetta, utilizzare piccole forbici per rimuovere eventuali residui di tessuto connettivo e sangue in eccesso. Tagliare l'anello in due e immergere due metà in 10 millilitri di soluzione preriscaldata di proteasi 14 in HBSS contenente Primocin in un contenitore sterile chiuso.Incubare i pezzi dell'anello bronchiale a 37 gradi Celsius per due ore. Dopo l'incubazione, trasferire i pezzi in una capsula di Petri contenente 10 millilitri di PBS caldo e, utilizzando una pinzetta piegata, raschiare l'interno dell'anello per ottenere una soluzione cellulare. Scartare l'anello.Trasferire la soluzione cellulare in un tubo da 50 millilitri e aggiungere PBS caldo per ottenere un volume finale di 50 millilitri. Centrifugare la soluzione cellulare e aspirare il surnatante prima di risospendere il pellet in 10 millilitri di PBS caldo. Portare il volume a 50 millilitri con PBS e ripetere la centrifugazione.Risospendere il pellet in KSFM completo caldo contenente Primocin. Quindi, sostituire la soluzione di rivestimento dalla piastra a sei pozzetti con due millilitri di sospensione cellulare per pozzetto. Lasciare che le cellule crescano fino a raggiungere l'80-90% di confluenza, Per la crioconservazione dei PBEC, aspirare il mezzo dai pozzetti e lavare le cellule una volta con due millilitri di PBS caldo per pozzetto.Tripsinizzare le cellule aggiungendo 500 microlitri di tripsina morbida per pozzetto e incubare per cinque a 10 minuti a 37 gradi Celsius. Ruotare la soluzione di tripsina e rilasciare le cellule picchiettando delicatamente la piastra. Trasferire le cellule staccate in una provetta da centrifuga da 50 millilitri contenente inibitore della tripsina della soia.Centrifugare la sospensione e scartare il surnatante prima di sospendere nuovamente il pellet in 10 millilitri di KSFM contenente penicillina e streptomicina. Dopo aver contato le cellule su un contatore automatico delle cellule, risospendere le cellule a una concentrazione di 400.000 cellule per millilitro in un mezzo di congelamento e aggiungere un millilitro di questa sospensione in un crioviale. Trasferire i flaconcini in un contenitore di celle fredde e posizionarlo a meno 80 gradi Celsius.Dopo 24 ore, trasferire i flaconcini a meno 196 gradi Celsius azoto liquido per la conservazione a lungo termine. Per rivestire un pallone di coltura cellulare T75, aggiungere 10 millilitri di soluzione di rivestimento in PBS e chiudere bene il coperchio prima di posizionare il pallone in un incubatore a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica. Il giorno successivo, sostituire la soluzione di rivestimento dal pallone con 10 millilitri di KSFM completo.Lasciare riscaldare il mezzo a 37 gradi Celsius nell'incubatore con un coperchio leggermente aperto per far entrare l'incubatrice. Scongelare rapidamente i PBEC crioconservati in un bagno di perline a 37 gradi Celsius. Aggiungere l'intero contenuto al crioviale al pallone T75 preriscaldato e distribuire uniformemente le cellule.Dopo essersi assicurati che le cellule siano saldamente attaccate, sostituire il mezzo con 10 millilitri di KSFM completo fresco e caldo e farli crescere fino a raggiungere l'80-90% di confluenza. Rivestire gli inserti di coltura cellulare aggiungendo 400 microlitri di soluzione di rivestimento per inserto e incubare durante la notte a 37 gradi Celsius. Tripsinizzare i PBEC nel pallone aggiungendo due millilitri di tripsina morbida e incubare per cinque a 10 minuti.Facilitare il distacco delle cellule ruotando e picchiettando delicatamente il pallone. Quindi, aggiungere quattro millilitri di inibitore della tripsina di soia al pallone e trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 25 millilitri. Centrifugare la sospensione e risospendere il pellet in sei millilitri di mezzo BD completo.Contare le celle su un contatore di celle automatico. Dopo il rivestimento, rimuovere la soluzione di rivestimento dagli inserti. Diluire la sospensione cellulare con mezzo BD completo integrato con una nanomole EC 23 e aggiungere 500 microlitri sulla parte superiore della membrana degli inserti.Aggiungere 1,5 millilitri di mezzo BD completo al pozzetto sotto l'inserto. Quando le celle sono pronte per il trasferimento all'interfaccia aria-liquido, o ALI, rimuovere il mezzo dagli inserti e dal pozzetto e aggiungere nuovo mezzo BD completo integrato con 50 nanomolari EC 23 solo al pozzo. Cambia il mezzo nei pozzetti tre volte a settimana.Per rimuovere il muco in eccesso e i detriti cellulari, aggiungere delicatamente 200 microlitri di PBS caldo sul lato apicale dello strato cellulare all'interno dell'inserto e incubare a 37 gradi Celsius per 10 minuti. Dopo l'incubazione, aspirare il PBS contenente muco in eccesso e detriti cellulari. TEER è stato misurato per valutare la qualità delle colture ALI PBEC.A sette giorni, la resistenza elettrica dello strato cellulare superiore a 300 ohm è considerata una coltura di successo. Inoltre, la variabilità inter-donatore nella resistenza elettrica si è ridotta nel tempo tra il settimo giorno e il giorno 14 della coltura presso l'interfaccia aria-liquido ed è marcatamente influenzata dall'origine del DMEM utilizzato. Tutti i principali tipi di cellule, come basali, ciliate, calici e cellule club, sono stati osservati dopo 14 giorni di coltura ALI e i livelli di espressione erano dipendenti dal donatore.Tra le diverse concentrazioni di EC 23 testate, è stato osservato un TEER massimo a 50 nanomolari. Un confronto tra l'acido retinoico e il suo analogo sintetico, EC 23, conferma che l'espressione genica dei marcatori per le cellule ciliate e caliciformi era simile tra 50 nanomolari EC 23 e acido retinoico. L'utilizzo di terreni di diversi fornitori ha comportato differenze sostanziali nella composizione cellulare, mentre le differenze nel TEER erano meno pronunciate.D'altra parte, l'utilizzo di inserti di fornitori diversi non ha comportato differenze sostanziali nella decomposizione cellulare. Inoltre, è stata osservata anche una differenza nei valori di TEER e nella composizione cellulare del mezzo ALI PBEC e PneumaCult rispetto al mezzo BD completo. Quando le cellule sono pronte per il trasferimento in ALI, aumentare le concentrazioni di EC 23.Inoltre, non centrifugare le cellule dopo lo scongelamento e rimuovere rapidamente le cellule dalla plastica di coltura cellulare dopo l'aggiunta di SBTI. Utilizzando colture di cellule epiteliali delle vie aeree nel modo previsto in questo protocollo, è possibile seguirlo utilizzando una varietà di metodi di analisi per esaminare, ad esempio, la funzione, l'espressione genica, la produzione di mediatori delle cellule epiteliali delle vie aeree e quindi, ad esempio, ottenere informazioni sulle conseguenze dell'esposizione, ad esempio, al fumo di sigaretta. I prossimi passi per questo protocollo di coltura cellulare è l'integrazione di ulteriori tipi di cellule, come le cellule immunitarie o le cellule vascolari, e questo contribuirà ad aumentare la rappresentazione tissutale.

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Impara a isolare cellule epiteliali bronchiali da tessuto polmonare umano per biobanking e colture ALI differenziate. Questo metodo robusto consente di studiare funzioni cellulari e risposte a stimoli in patologie respiratorie.

Isolare le cellule epiteliali bronchiali dal tessuto polmonare resecato per il biobanking e stabilire colture di interfaccia aria-liquido ben differenziate (Video) | JoVE Journal

Isolare le cellule epiteliali bronchiali dal tessuto polmonare resecato per il biobanking e stabilire colture di interfaccia aria-liquido ben differenziate

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