Name: Produzione di neuroni umani 2-inducibili in un bioreattore tridimensionale a sospensione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-17T12:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: Scopri la differenziazione neuronale rapida di cellule staminali pluripotenti umane in un bioreattore 3D a sospensione. Questo metodo garantisce alta resa cellulare e bassa variabilità tra i lotti per applicazioni su larga scala.

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Il progetto EBiSC2 ha ricevuto finanziamenti dall'impresa comune (JU) Innovative Medicines Initiative 2 nell'ambito della convenzione di sovvenzione n. 821362. L'impresa comune riceve sostegno dal programma di ricerca e innovazione Horizon 2020 dell'Unione europea e dall'EFPIA. Ringraziamo Nadine J. Smandzich, Helene D. M. Hemmer, Johnn-Majd Balsters e Vanessa M. Nalewaja per la loro assistenza nelle analisi immunocitochimiche e di espressione genica, nonché Heike Arthen per il suo eccellente supporto tecnico. Inoltre, ringraziamo Stephanie Bur per l'istituzione del programma di bioreattori. La Figura 2A è stata creata con BioRender.com.

Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.

L'espressione ectopica del fattore di trascrizione neuronale NGN2 ha precedentemente dimostrato di accelerare le prime fasi della differenziazione neuronale e indurre l'impegno della linea neuronale nelle hiPSC entro 1 settimana dalla coltivazione12,13,20. Questo lavoro descrive un protocollo dettagliato per la differenziazione di bioni010-C-13 hiPSCs geneticamente modificati in neuroni iNGN2 utilizzando un bioreattore da banco.
Il bioreattore 3D CERO è un bioreattore a basso volume con quattro slot per tubi specializzati, ciascuno con una capacità massima di 50 ml. I livelli di temperatura e CO2 sono continuamente controllati e i parametri di coltivazione (ad esempio, velocità e tempo di rotazione) sono regolati per ogni tubo, consentendo agli utenti di eseguire diversi approcci di differenziazione in parallelo. Gli interruttori d'onda integrati sulla parete del tubo interno consentono una perturbazione del fluido con un basso sforzo di taglio e mantengono gli aggregati 3D in sospensione durante la rotazione controllata. L'accesso limitato ai nutrienti, così come le interazioni forzate cellula-cellula 3D e cellula-matrice extracellulare (ECM), possono influenzare significativamente la differenziazione cellulare e il comportamento24,25,26,27.
La coltura di cellule come aggregati 3D in sospensione aumenta queste interazioni cellulari, imitando così più da vicino l'ambiente in vivo di tessuti o organi28. La perturbazione concomitante del mezzo regola la dimensione dell'aggregato a causa dell'attrito meccanico, migliora lo scambio di gas e riduce il gradiente di nutrienti e rifiuti nel tubo, preservando i gradienti fisiologici rilevanti all'interno degli aggregati 29,30,31,32,33,34. Sebbene le modifiche del mezzo vengano eseguite manualmente, il bioreattore da banco riduce i costi di manodopera e operativi rispetto ai palloni di coltura statici. Il bioreattore offre anche diversi vantaggi rispetto ai bioreattori completamente automatizzati con serbatoio di agitazione, poiché il design senza girante riduce lo sforzo di taglio idrodinamico sulla superficie aggregata, migliorando così non solo la sopravvivenza cellulare, ma anche limitando gli effetti dello stress di taglio sulle iPSC sensibili, sulla differenziazione cellulare e sulla funzione35,36,37,38.
I bioreattori a ruota verticale, in cui le cellule sono agitate da una grande girante verticale, così come i bioreattori a movimento oscillante che utilizzano sacchetti di coltura gonfiati attaccati a una piattaforma motorizzata, rappresentano piattaforme di sospensione 3D alternative. Sebbene eccessivamente testati per la coltivazione di hiPSCs 17,18,19,39,40, si sa poco sulla loro applicabilità negli approcci di differenziazione neuronale e i rapporti sono limitati all'espansione riuscita di cellule precursori neurali di mammiferi e umani nei bioreattori stir-tank 41,42,43,44, con un raro numero di studi incentrati su maturazione44,45. In generale, le piattaforme di sospensione 3D automatizzate offrono il vantaggio di cambi di mezzo completamente automatizzati e controllati da computer, riducendo così le variazioni nella manipolazione e minimizzando il rischio di contaminazione. Inoltre, i parametri nutrizionali come la concentrazione di lattato e glucosio possono essere monitorati continuamente. Tuttavia, la creazione di questi sistemi richiede spesso un investimento iniziale significativo, spazi di laboratorio e la formazione di personale qualificato. Il bioreattore da banco rappresenta un'alternativa compatta e facile da usare per la coltura di cellule in sospensione, ma non fornisce un monitoraggio simultaneo dei nutrienti.
Come nella maggior parte dei protocolli utilizzati per la coltivazione di cellule in piattaforme di sospensione 3D, la formazione iniziale di aggregati rappresenta un passaggio critico. Le hiPSC vengono coltivate come monostrati aderenti e successivamente trasferite come sospensioni a cella singola in un ambiente 3D. Per ridurre al minimo la perdita di cellule in quella fase, è necessario considerare diversi aspetti. Il design dei tubi con gli interruttori d'onda integrati significa che è necessario un volume di coltura minimo di 10 ml per tubo per garantire una perturbazione ottimale del fluido. Il volume critico non dovrebbe quindi essere sottovalutato a lungo termine. Inoltre, una densità di semina iniziale di 7,5 milioni di cellule per 10 ml di volume di coltura e una velocità di rotazione di 60 rpm sono altamente raccomandate per formare aggregati stabili a breve termine, anche se potrebbero essere necessari adattamenti a seconda della linea cellulare.
Dopo aver trasferito le hiPSC in sospensione, gli aggregati dovrebbero formarsi entro 24 ore. Il primo cambiamento del mezzo è critico, poiché gli aggregati sono piccoli e potrebbero non stabilizzarsi correttamente. Il tempo per la sedimentazione degli aggregati può essere prolungato ma non deve superare i 10 minuti, poiché gli aggregati possono iniziare ad aggregarsi e crescere in modo eterogeneo. Durante l'aspirazione, un volume di coltura minimo di 5 ml deve essere lasciato nel tubo e qualsiasi perturbazione del mezzo deve essere evitata. Tuttavia, è prevedibile una perdita di cellule e aggregati durante le fasi iniziali. La conta cellulare indica una resa cellulare costante nei primi 2 giorni di coltura, indicando che l'elevata capacità proliferativa delle hiPSC compensa la perdita cellulare iniziale. Una volta in sospensione, la coltivazione delicata e la perturbazione portano ad aggregati di dimensioni omogenee che iniziano a crescere nel tempo.
La differenziazione neuronale è stata eseguita secondo un protocollo precedentemente pubblicato basato sulla sovraespressione13 di NGN2 indotta dalla doxiciclina e le singole fasi sono state ottimizzate per una coltivazione 3D. Il fattore di trascrizione neuronale NGN2 è un driver ben descritto nella differenziazione neuronale e accelera significativamente l'induzione neuronale11,13,46. Mentre il pattern convenzionale con fattori di crescita definiti richiede da diverse settimane a mesi 7,8,9, l'espressione di NGN2 induce il destino delle cellule neuronali in pochi giorni. Oltre al tempo di coltivazione ridotto, il protocollo non dipende né da costosi fattori di crescita né da matrici di rivestimento per la coltura di sospensione iniziale, riducendo così ulteriormente i costi di coltivazione.
Inoltre, un confronto diretto della generazione guidata da NGN2 di neuroni immaturi in colture aderenti e in sospensione ha rivelato un aumento di 1,36 volte delle cellule dopo 4 giorni in coltura utilizzando il bioreattore da banco20, mentre il volume di mezzo richiesto per la generazione di 1 milione di cellule dovrebbe essere dimezzato. L'impiego del bioreattore da banco per la generazione di neuroni iNGN2 può quindi essere utile, poiché è possibile produrre un numero maggiore di cellule con tempi e costi di gestione inferiori. In linea con i rapporti precedenti, l'impegno della linea neuronale è stato osservato precocemente. Dopo 2 giorni di induzione di NGN2, era evidente una profonda espressione di marcatori neuronali classici come TUBB3, MAP2 e MAPT, a sostegno dell'applicabilità del bioreattore da banco per l'induzione neuronale. Seguendo questo protocollo, circa 6,2 milioni di neuroni iNGN2 immaturi possono essere ottenuti da 1 milione di hiPSC entro 4 giorni dalla coltura. Tuttavia, la capacità di produzione può variare tra i lotti e dipendere dal volume della coltura in sospensione durante la semina.
Per aumentare ulteriormente la resa, il tempo di coltivazione è stato esteso per ulteriori 3 giorni; Tuttavia, sebbene gli aggregati diventassero più grandi, diventavano anche altamente compatti e non potevano essere correttamente dissociati per la crioconservazione o la riplaccatura. Nonostante i progressi negli approcci di coltura 3D, le colture neuronali 2D aderenti sono ancora il gold standard per le analisi funzionali come array di microelettrodi o imaging del calcio. La singolarizzazione cellulare è quindi un prerequisito importante per un monostrato neuronale omogeneamente distribuito e una rete neuritica. Un distacco meccanico più forte delle cellule o reagenti di dissociazione duri possono essere utilizzati per garantire la singolarizzazione, ma con potenziali effetti sulla vitalità cellulare, sulla fisiologia e sulla capacità di riattaccamento47,48. Per quanto riguarda la necessità di singole cellule per ulteriori analisi e maturazione, gli aggregati sono stati dissociati dopo 4 giorni di sospensione e i neuroni iNGN2 (giorno 2) crioconservati. La differenziazione post-disgelo e la caratterizzazione dei neuroni iNGN2 hanno confermato una crescente maturità delle colture neuronali e la formazione di una fitta rete neuritica.
Il protocollo fornito produce un numero elevato di neuroni iNGN2. Tuttavia, è necessario considerare diverse limitazioni. Come per la maggior parte delle piattaforme di coltura in sospensione, il trasferimento di hiPSC da una coltura aderente 2D a un ambiente 3D è fondamentale e spesso associato a una profonda perdita cellulare. Ulteriori perdite significative di cellule e aggregati sono attese durante i cambiamenti dei media. Rispetto alle piattaforme automatizzate, il tempo di gestione e il rischio di contaminazione utilizzando il bioreattore da banco sono aumentati, poiché le modifiche del mezzo devono essere eseguite manualmente. A parte la mancanza di automazione, il bioreattore da banco non offre la possibilità di monitorare i nutrienti e la capacità massima di 50 ml per tubo limita il potenziale di upscaling del protocollo. Infine, è importante notare che, sebbene NGN2 acceleri l'impegno della linea neuronale, la durata della maturazione terminale non è ridotta e richiede ancora una coltura a lungo termine per diverse settimane. Data l'importanza del supporto astrocitico per la funzione neuronale, l'attaccamento e la sopravvivenza 49,50,51, gli approcci di co-coltura dovrebbero essere considerati, e potrebbero anche essere essenziali per la coltivazione a lungo termine.
In sintesi, un protocollo di differenziazione 2D è stato tradotto con successo in un ambiente 3D per la generazione rapida e riproducibile di neuroni iNGN2 implementando un bioreattore da banco. Il protocollo descritto produce elevate quantità di neuroni derivati da iPSC di buona qualità, che possono servire come punto di partenza per test di modelli complessi, screening di farmaci ad alto rendimento e saggi di tossicità su larga scala.

I disturbi neurologici sono la principale causa di disabilità in tutto il mondo1. Una persona su sei ne è affetta e l'incidenza continua ad aumentare. L'onere finanziario associato alle società e ai loro sistemi sanitari è enorme. Una valutazione di 30 paesi europei nel 2010 ha stimato costi annuali di 800 miliardi di euro relativi ai disturbi mentali e neurologici2. Il crescente onere socioeconomico richiede strategie di trattamento efficaci e, sebbene la nostra comprensione della fisiopatologia della malattia sia aumentata notevolmente, la traduzione in clinica è spesso insufficiente. In generale, solo il 12% dei farmaci entra in studi clinici, di cui oltre l'80% fallisce durante le fasi successive, principalmente a causa di inefficacia o tossicità imprevista 3,4. Le ragioni sono varie, ma la limitata trasferibilità dalla sperimentazione animale nelle fasi precliniche alla sperimentazione umana è venuta sempre più alla ribalta5. I modelli cellulari e tissutali umani in vitro possono colmare il divario della traduzione interspecie e i progressi nella tecnologia delle cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (hiPSC) possiedono un grande potenziale in questo senso. Le hiPSC sono ampiamente utilizzate nella ricerca di base e condividono caratteristiche essenziali con le cellule staminali embrionali (hESC), come una capacità di auto-rinnovamento quasi illimitata e la capacità di differenziarsi in tutti e tre gli strati germinali6, aggirando le preoccupazioni etiche associate alla distruzione degli embrioni.
La derivazione di cellule neuronali da hESC, e successivamente da hiPSC, ha segnato una pietra miliare nella ricerca sul cervello. I protocolli di differenziazione iniziale erano basati sull'applicazione di fattori di crescita che imitavano passaggi critici durante l'embriogenesi, la maggior parte dei quali coinvolgeva la doppia inibizione della SMAD in sospensione o in colture aderenti 7,8,9. I neuroni maturi sono stati generati con successo, ma diversi inconvenienti di questi protocolli ostacolano ancora il loro ampio uso nello sviluppo di farmaci, come la bassa resa e l'elevata variabilità da lotto a lotto dei neuroni generati, nonché l'ampio carico di lavoro legato ai lunghi tempi di coltura. I miglioramenti sono stati ottenuti grazie all'espressione forzata di fattori di trascrizione criticamente coinvolti nella neurogenesi e i membri della famiglia delle neurogenine (NGN), in particolare NGN2, sono stati identificati come driver efficaci10. L'espressione ectopica lentiviral-mediata di NGN2 nelle hiPSC ha accelerato significativamente le prime fasi della differenziazione neuronale e ha indotto il destino delle cellule neuronali entro solo 1 settimana11. La successiva maturazione terminale in co-colture con astrociti ha prodotto neuroni funzionali in elevata purezza e quantità con proprietà riproducibili. L'editing genetico diretto dal sito del locus safe-harbor del sito di integrazione del virus adeno-associato 1 (AAVS1) è stato quindi applicato per creare linee hiPSC con una cassetta di espressione stabile e inducibile dalla doxiciclina per NGN212,13, riducendo così al minimo gli effetti collaterali indesiderati della consegna lentivirale.
La differenziazione robusta ed efficiente dei neuroni della neurogenina 2 inducibile dalla doxiciclina 2 (iNGN2) ha un grande potenziale per screening fenotipici di farmaci ad alto rendimento e saggi di tossicità10,14,15; e progressi sostanziali nel bioprocessing sono stati fatti durante l'ultimo decennio implementando bioreattori per un'espansione e differenziazione cellulare scalabile16,17,18,19. Tuttavia, la maggior parte dei protocolli di differenziazione sono ottimizzati per le culture aderenti e la traduzione in un ambiente tridimensionale (3D) richiede spesso modifiche essenziali. Recentemente, l'uso di successo di un bioreattore 3D da banco con caratteristiche di stress di taglio ridotte è stato riportato per l'espansione di hiPSCs e per la differenziazione riproducibile in epatociti, cardiomiociti e neuroni20. Qui, viene fornito un protocollo dettagliato per la generazione e la caratterizzazione dei neuroni iNGN2 utilizzando l'identico bioreattore 3D da banco.

<table><tbody><tr><td>2-Mercaptoetanolo 50 mM</td><td>Gibco</td><td></td><td></td>11528926</tr><tr><td>60 mm Nunclon Delta Surface</td><td>Nunc</td><td>734-2040</td><td></td></tr><tr><td>Anti-beta III Tubulina anticorpo [TU-20] (diluizione 1:1.000)</td><td>Abcam&nbsp; &nbsp;</td><td>ab7751&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Biosistemi applicati&nbsp; Kit di trascrizione inversa di cDNA ad alta capacità</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp; &nbsp;</td><td></td><td></td>10400745</tr><tr><td>Supplemento B-27 (50x)&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11530536</td><td>integratore senza siero (50x)</td></tr><tr><td>BIONi010-C-13 linea hiPSC</td><td>Banca Europea per le cellule staminali pluripotenti indotte (EBiSC), BIONEER come depositante</td><td>SAMEA103988285</td><td>Bioneer è depositante in EBiSC e proprietario della linea hiPSC.</td></tr><tr><td>Biorender&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td>Biorender.com</tr><tr><td>BSA Grado di coltura cellulare</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp; &nbsp;</td><td></td><td></td>12330023</tr><tr><td>Incubatore 3D CERO & Bioreattore</td><td>OLS OMNI Life Science</td><td>2800000</td><td></td></tr><tr><td>CEROtubes Provette per colture cellulari 50 mL</td><td>OLS OMNI Life Science</td><td>2800005</td><td></td></tr><tr><td>Citavi 6</td><td>Software</td><td></td><td></td>accademico svizzero</tr><tr><td>CryoStor CS10</td><td>Stemcell</td><td>7930</td><td>terreno di congelamento contenente il 10% di DMSO</td></tr><tr><td>Soluzione di fissazione Cytofix</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td>554655</td><td>soluzione di fissazione contenente il 4% di paraformaldeide</td></tr><tr><td>DAPI (COLORAZIONE CELLULARE FISSA NUCBLUE)</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp; &nbsp;</td><td></td><td></td>12333553</tr><tr><td>Doxiciclina cloridrato (DOX)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D3447</td><td></td></tr><tr><td>DPBS senza calcio e magnesio (DPBS -/-)&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>DPBS con calcio e magnesio (DPBS +/+)&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11580456</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 (-/-)</td><td>Gibco</td><td>21331-020</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, GlutaMAX Supplement</td><td>Gibco</td><td>31331-028</td><td></td></tr><tr><td>EVOS XL Core Cell Imaging System</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Capra anti-topo IgG (H+L) Anticorpo secondario altamente adsorbito di capra, Alexa Fluor 555</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp; &nbsp;</td><td>A21424</td><td></td></tr><tr><td>Integratore GlutaMAX&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>35050-038</td><td>L-alanil-L-glutammina dipeptid stabilizzato</td></tr><tr><td>ImageJ 1.51v&nbsp;</td><td>National Institute of Health</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di insulina umana</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9278l</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Merck</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>MACSQuant Analyzer</td><td>Miltenyi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MAP2 Anticorpo monoclonale (diluizione 1: 300)</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp; &nbsp;</td><td>13-1500&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Fattore di crescita ridotto, senza rosso fenolo&nbsp;</td><td>Corning Scienze della vita&nbsp;</td><td>356231</td><td>matrice di membrana basale</td></tr><tr><td>MEM Soluzione di aminoacidi non essenziali (100x)</td><td>Gibco&nbsp;</td><td></td><td>Kit di</td></tr><tr><td>pellicole adesive ottiche 11140035 MicroAmp&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp; &nbsp;</td><td></td><td></td>10095714</tr><tr><td>mTeSR1</td><td>Stemcell</td><td>85850</td><td>mezzo di manutenzione iPSC senza alimentatore&nbsp;</td></tr><tr><td>N-2 Integratore (100x)</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td>senza siero Integratore a base di Bottenstein' s Formulazione N-1</td></tr><tr><td>Neurobasal Medium</td><td>Gibco</td><td>11570556</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse TS2</td><td>Nikon Instruments Europe B.V.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NucleoCounter-NC200</td><td>ChemoMetec A/S</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Origin 2021</td><td>OriginLab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td>Gibco</td><td>11548876</td><td></td></tr><tr><td>tampone di perm/lavaggio&nbsp;</td><td>BD Bioscienze&nbsp;</td><td></td><td></td>554723</tr><tr><td>Primer test TUBB3(Hs00801390_s1)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11620099</td><td></td></tr><tr><td>Primer assay GAPDH (Hs99999905_m1)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11620099</td><td></td></tr><tr><td>Primer assay GUSB (Hs99999908_m1)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11620099</td><td></td></tr><tr><td>Primer assay HPRT1 (Hs99999909_m1)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11620099</td><td></td></tr><tr><td>Primer test MAP2 (Hs00258900_m1)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11620099</td><td></td></tr><tr><td>Primer test MAPT (Hs00902194_m1)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11620099</td><td></td></tr><tr><td>Primer test POU5F1 (Hs04260367_gH)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11620099</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-ornitina 0,01%</td><td>Merck</td><td>P4957</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Plus Micro Kit (50)-Kit</td><td>Qiagen</td><td>74034</td><td>kit di isolamento dell'RNA basato su colonna</td></tr><tr><td>RLT Tampone</td><td>Qiagen</td><td>79216</td><td>tampone per lisi cellulare</td></tr><tr><td>Sodium Pyruvat (100 mM)</td><td>Gibco</td><td>12539059</td><td></td></tr><tr><td>StemPro Accutase</td><td>Gibco</td><td>11599686</td><td>enzima di dissociazione cellulare</td></tr><tr><td>TAQMAN FAST ADVANCED MASTER MIX</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp; &nbsp;</td><td>11380912</td><td>master mix qPCR</td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Select Enzym</td><td>Gibco</td><td>12563-011</td><td>Soluzione di tripsina-EDTA</td></tr><tr><td>UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>Via1-Cassette</td><td>ChemoMetec A/S</td><td>941-0012</td><td></td></tr><tr><td>Puntali per pipette filtrati a foro largo</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10088880</td><td></td></tr><tr><td>X20 PIASTRE DI REAZIONE OTTICHE A 96 WELL FAST CLEAR&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15206343</td><td></td></tr><tr><td>dicloridrato di Y-27632, inibitore della chinasi Rho (inibitore ROCK)</td><td>Abcam</td><td>ab120129</td><td></td></tr></tbody></table>

produzione di neuroni umani 2-inducibili in un bioreattore tridimensionale a sospensione

Production of Human Neurogenin 2-Inducible Neurons in a Three-Dimensional Suspension Bioreactor

La derivazione di cellule del lignaggio neuronale da cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC) ha segnato una pietra miliare nella ricerca sul cervello. Fin dal loro primo avvento, i protocolli sono stati continuamente ottimizzati e sono ora ampiamente utilizzati nella ricerca e nello sviluppo di farmaci. Tuttavia, la lunghissima durata di questi protocolli convenzionali di differenziazione e maturazione e la crescente domanda di hiPSC di alta qualità e dei loro derivati neurali aumentano la necessità di adottare, ottimizzare e standardizzare questi protocolli per la produzione su larga scala. Questo lavoro presenta un protocollo rapido ed efficiente per la differenziazione di neurogenina 2 (iNGN2) geneticamente modificata, inducibile dalla doxiciclina che esprime hiPSC in neuroni utilizzando un bioreattore a sospensione tridimensionale (3D) da banco.
In breve, le sospensioni monocellulari di iNGN2-hiPSCs sono state autorizzate a formare aggregati entro 24 ore e l'impegno della linea neuronale è stato indotto dall'aggiunta di doxiciclina. Gli aggregati sono stati dissociati dopo 2 giorni di induzione e le cellule sono state crioconservate o riplaccate per la maturazione terminale. I neuroni iNGN2 generati hanno espresso marcatori neuronali classici nella fase iniziale e hanno formato reti neuritiche complesse entro 1 settimana dalla riplaccatura, indicando una crescente maturità delle colture neuronali. In sintesi, viene fornito un protocollo dettagliato passo-passo per la generazione rapida di neuroni derivati dall'hiPSC in un ambiente 3D che ha un grande potenziale come punto di partenza per la modellazione della malattia, screening fenotipici di farmaci ad alto rendimento e test di tossicità su larga scala.

Durante le fasi iniziali, le colture aderenti di hiPSC vengono staccate, singolarizzate, e trasferite in sospensione (Figura 2). Gli aggregati si formano entro 24 ore e crescono continuamente di dimensioni. Dopo 2 giorni di induzione del transgene, i primi neuroni possono essere crioconservati per esperimenti successivi.
La proliferazione persistente durante i primi giorni in sospensione produce un aumento del numero di cellule, raggiungendo il suo picco dopo 2 giorni di induzione (Figura 3A,B). Insieme alla proliferazione, gli aggregati iniziano a crescere. Rispetto al giorno 0, il diametro mostra un aumento del 50% al giorno 2 ed è quasi raddoppiato al giorno 5 (Figura 3D). Sebbene un diametro crescente limiti l'apporto di nutrienti all'interno degli aggregati, la vitalità delle cellule non è influenzata al giorno 2 o al giorno 5 della differenziazione (Figura 3C). Tuttavia, una coltivazione prolungata per più di 4 giorni in sospensione non migliora ulteriormente la resa cellulare, poiché gli aggregati diventano sempre più resistenti alla singolarizzazione enzimatica (Figura 3B).
Dopo la crioconservazione, le cellule del giorno 2 vengono scongelate e placcate su piatti rivestiti di poli-L-ornitina (PLO)-laminina per la maturazione terminale. In generale, le cellule si attaccano molto bene dopo lo scongelamento e iniziano presto ad estendere i neuriti. Il profilo di espressione genica temporale, così come la colorazione immunocitochimica per i marcatori neuronali TUBB3 e MAP2, conferma l'identità delle cellule neuronali (Figura 4A,B). Oltre all'aumento dei livelli di TUBB3 e MAP2, le colture neuronali sono arricchite in trascritti tau della proteina associati ai microtubuli (MAPT), che codificano per una proteina neuronale coinvolta nella stabilizzazione degli assoni, e mostrano un concomitante declino nell'espressione del fattore di trascrizione che regola la pluripotenza POU5F1. Inoltre, una fitta rete neuritica si forma entro la prima settimana dopo lo scongelamento (Figura 4C). Questi cambiamenti morfologici, in combinazione con il profilo trascrizionale, suggeriscono una crescente maturazione delle colture neuronali.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65085/65085fig02.jpg"> Figura 2: Generazione di neuroni iNGN2 derivati da hiPSC utilizzando un bioreattore da banco. (A) Panoramica schematica del paradigma di differenziazione, evidenziando le fasi chiave della coltura cellulare. (B-F) Le immagini in campo chiaro visualizzano (B) le hiPSC e (C,D) la formazione di aggregati nel bioreattore da banco. (E,F) I neuroni iNGN2 estendono i neuriti e subiscono cambiamenti morfologici durante la differenziazione. Barra di scala = 100 μm. Abbreviazioni: BMM = matrice di membrana basale; iPSC-MM = mezzo di manutenzione iPSC; PLO = poli-L-ornitina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65085/65085fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65085/65085fig03.jpg"> Figura 3: Resa cellulare e vitalità durante la formazione e la crescita degli aggregati. (A) Le immagini in campo chiaro mostrano la formazione di aggregati entro 2 giorni dalla coltura nel bioreattore da banco, nonché l'aumento delle dimensioni dell'aggregato nel tempo. Barra di scala = 500 μm. (B) Quantificazione della resa cellulare e (C) vitalità nel corso del differenziamento. I grafici a barre rappresentano la media + SD di quattro esperimenti indipendenti. (D) Il diametro, indicativo della dimensione degli aggregati, è stato determinato in modo semi-automatico utilizzando il software open source ImageJ (versione 1.53). In primo luogo, le immagini in campo chiaro sono state convertite in immagini binarie e quindi ulteriormente valutate utilizzando lo strumento di analisi delle particelle, applicando i seguenti parametri: dimensione &gt; 2.500 μm 2, circolarità 0,45-1, escludere i bordi e includere i fori. Le linee orizzontali indicano la media ± SD di cinque differenziazioni indipendenti. I singoli punti rappresentano la media degli esperimenti di differenziazione individuale con almeno 20 aggregati per punto temporale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65085/65085fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65085/65085fig04.jpg"> Figura 4: Caratterizzazione dei neuroni iNGN2 derivati da hiPSC. Profilo di espressione genica temporale per i geni neuronali TUBB3, MAP2 e MAPT, nonché per il gene associato alle cellule staminali pluripotenti POU5F1. I livelli di espressione relativa sono stati normalizzati ai geni di riferimento GAPDH, HPRT1 e GUSB. Le hiPSC indifferenziate (giorno-2) sono state scelte come calibratore. I simboli geometrici indicano la media ± SD di quattro differenziazioni indipendenti. (B) Immagini rappresentative dei neuroni iNGN2 al giorno 7 dopo lo scongelamento (giorno-2 + 7), colorate per beta-III-tubulina (TUBB3, magenta) e proteina 2 associata ai microtubuli (MAP2, ciano). I nuclei cellulari sono stati controcolorati con DAPI. Barre di scala = 100 μm. (C) Valutazione della rete neuritica in immagini in campo chiaro di colture neuronali dopo lo scongelamento. La lunghezza totale dei neuriti è stata determinata in un'area di 930,82 × 698,11 μm2 utilizzando ImageJ (versione 1.53). Dopo aver regolato la luminosità e il contrasto, le immagini sono state convertite in immagini a 8 bit e i colori sono stati invertiti. I neuriti sono stati successivamente scheletrati e quindi analizzati utilizzando rispettivamente i plugin ImageJ 'Skeletonize' e 'Analyze Skeleton'. La lunghezza totale dei neuriti è stata divisa per il numero di somi nella regione di interesse per ottenere la lunghezza media dei neuriti/cellula. I grafici a barre rappresentano la media + SD di tre esperimenti indipendenti. Abbreviazioni: DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindolo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65085/65085fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>

Questo articolo descrive un protocollo per la generazione di neuroni derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane in un bioreattore a sospensione 3D da banco.

Produzione di neuroni umani 2-inducibili in un bioreattore tridimensionale a sospensione

The derivation of neuronal lineage cells from human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) marked a milestone in brain research. Since their first ...

L'utilizzo di bioreattori per tradurre cellule staminali pluripotenti indotte o protocolli di coltura IPSC da 2D a 3D consente la generazione di cellule in numero elevato per applicazioni su larga scala come screening ad alto rendimento. Questo protocollo di differenziazione neuronale veloce in un ambiente fisiologico 3D migliora le interazioni delle cellule starter e offre un'elevata resa cellulare per una durata più breve con una bassa variazione batch-to=batch, riducendo così costi e tempi. La Banca europea delle cellule staminali pluripotenti indotte sta applicando approcci simili per la generazione rapida ed economica di cellule differenziate in più lineaggi, comprese altre cellule cerebrali e cardiomiociti.Iniziare la pre-coltivazione quando la cellula staminale pluripotente indotta dall'uomo, o coltura umana di iPSC, è dal 60 all'80% confluente. Aspirare completamente il mezzo dalle iPSC umane e sciacquare delicatamente le cellule con 1X DPBS due volte. Aggiungere due millilitri di soluzione di tripsina EDTA preriscaldata alla piastra di Petri di sei centimetri e incubare le cellule per tre minuti a 37 gradi Celsius in un'incubatrice.Quindi, picchiettare delicatamente i piatti per facilitare il distacco delle cellule o incubare per uno o due minuti in più se le cellule non si staccano. Quindi, risospendere le cellule in ogni piatto aggiungendo cinque millilitri di mezzo di mantenimento IPSC senza alimentatore con inibitore ROCK. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 15 millilitri o 50 millilitri e mescolare delicatamente mediante pipettaggio per garantire la singolarizzazione cellulare.Determinare il numero di celle in 100 microlitri di sospensione cellulare utilizzando un contatore automatico di celle e trasferire il volume desiderato di sospensione cellulare in un tubo da 50 millilitri. Centrifugare le cellule a 300 G per tre minuti. Quindi, aspirare il surnatante e risospendere le cellule in due millilitri di mezzo di mantenimento IPSC senza alimentatore con inibitore ROCK.Riempire ogni tubo da 50 millilitri con 18 millilitri del mezzo. Quindi, erogare 20 millilitri di sospensione cellulare in ciascun tubo del bioreattore. Posizionare i tubi nel sistema del bioreattore e impostare i parametri di coltivazione per una durata illimitata.Avviare il programma di pre-coltivazione tramite il display del bioreattore. Per cambiare il mezzo il giorno successivo, lasciare che l'aggregato si depositi nei tubi del bioreattore per circa cinque minuti prima di aspirare accuratamente il surnatante. Aggiungere 15 millilitri di terreno di mantenimento IPSC fresco senza alimentatore senza inibitore ROCK per provetta e continuare la coltivazione nel bioreattore da banco per 24 ore.Per iniziare la differenziazione neuronale, lasciare che l'aggregato si depositi nei tubi del bioreattore e aspirare con cura il surnatante dalle cellule, lasciando circa cinque millilitri di surnatante nel tubo. Quindi, aggiungere 35 millilitri di mezzo di induzione neurale costituito da mezzo neurobasale e due microgrammi per millilitro di doxiciclina. Rimetti i tubi nel bioreattore da banco e continua la coltivazione.Eseguire modifiche ai supporti ogni giorno per due giorni, come dimostrato in precedenza. Dopo aver aspirato il surnatante come mostrato in precedenza, trasferire gli aggregati in un tubo sterile da 15 millilitri o 50 millilitri e risciacquare delicatamente gli aggregati due volte con DPBS. Aspirare con attenzione il surnatante il più possibile senza disturbare gli aggregati.Quindi aggiungere da due a cinque millilitri di enzima di dissociazione cellulare preriscaldato al pellet, a seconda delle dimensioni del pellet, e incubare le cellule per circa 10 minuti a 37 gradi Celsius a bagnomaria. Risospendere delicatamente gli aggregati sedimentati ogni due minuti fino a quando gli aggregati non si dissociano. Aggiungere il mezzo neurobasale preriscaldato, tre volte il volume dell'enzima di dissociazione cellulare precedentemente aggiunto, e risospendere attentamente le cellule per garantire la singolarizzazione cellulare.Determinare il numero di cellule e trasferire il volume corrispondente di sospensione cellulare per la crioconservazione in un tubo da 15 millilitri o 50 millilitri. Centrifugare alle cellule a 300 G per tre minuti. Aspirare il surnatante e risospendere delicatamente il pellet cellulare nel volume corrispondente del mezzo di congelamento contenente il 10% di dimetilsolfossido.Aliquotare la sospensione cellulare in flaconcini idonei per la crioconservazione. Trasferire immediatamente i flaconcini in un contenitore di congelamento pre-raffreddato e a bassa velocità riempito con 2-propanolo e posizionare il contenitore a meno 80 gradi Celsius durante la notte. Posizionare i flaconcini a meno 150 gradi Celsius il giorno successivo per la conservazione a lungo termine.Dopo che le colture aderenti delle iPSC umane sono state staccate, singolarizzate, e trasferite in sospensione, gli aggregati si sono formati entro 24 ore e hanno continuato a crescere. Dopo due giorni di induzione del transgene, i primi neuroni potrebbero essere crioconservati per la successiva maturazione. È stata osservata una proliferazione persistente delle iPSC umane durante i primi giorni di sospensione e il numero di colture cellulari ha raggiunto il picco dopo due giorni di induzione.Tuttavia, la coltivazione prolungata per più di quattro giorni in sospensione non ha migliorato la resa cellulare, poiché gli aggregati sono diventati sempre più resistenti alla singolarizzazione enzimatica. Inoltre, rispetto al giorno zero, il diametro aggregato è aumentato del 50% il secondo giorno e quasi raddoppiato il quinto giorno. Sebbene l'aumento del diametro limiti l'apporto di nutrienti agli aggregati, la vitalità delle cellule non è stata influenzata il secondo o il quinto giorno di differenziazione.Il profilo di espressione genica temporale e la colorazione immunochimica per i marcatori neuronali beta tre tubulina e proteina associata ai microtubuli, o MAP2, hanno confermato l'identità cellulare neuronale delle cellule crioconservate del giorno due. Inoltre, le colture neuronali sono state arricchite in trascritti tau proteici associati ai microtubuli, o MAPT, e hanno mostrato un concomitante declino nell'espressione del fattore di trascrizione che regola la pluripotenza POU5F1 Una fitta rete neuritica si è formata entro la prima settimana dopo lo scongelamento, che ha anche suggerito una crescente maturazione delle colture neuronali. Questo protocollo pone le basi per la traduzione in bioreattori su larga scala e completamente automatizzati, che mostrano un ulteriore significativo aumento della capacità di produzione delle celle per future applicazioni su larga scala.Una volta dimostrato con la neurogenina 2, l'uso di fattori di trascrizione determinanti lineari per accelerare la differenziazione è stato applicato a molti diversi tipi di cellule e malattie per facilitare la modellazione iPSC.

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Abbiamo stabilito un protocollo per l'induzione di neuroblasti pluripotenti direttamente da cellule staminali embrionali umane conservati in condizioni definite con piccole molecole, che permette la derivazione di una grande quantità di progenitori neuronali umane e tipi di cellule neuronali nel sistema nervoso centrale per lo sviluppo neurale riparazione.

Derivazione efficiente di progenitori neuronali umane e Neuroni pluripotenti da cellule staminali embrionali umane con induzione piccole molecole

Qui si descrive l'uso di un auto-assemblaggio 3-dimensionale patibolo alla cultura cellule umane progenitrici neurali. Vi presentiamo un protocollo per liberare le cellule dai ponteggi da analizzare successivamente, ad esempio mediante citometria di flusso. Questo protocollo potrebbe essere adattato per altri tipi di cellule per effettuare studi dettagliati meccanicisticamente.

La coltivazione di cellule progenitrici neurali umane in un 3-dimensionale di auto-assemblaggio Peptide Hydrogel

Protocolli per la differenziazione neuronale di cellule staminali pluripotenti umane (hPSCs) sono spesso molto tempo e richiedono notevoli capacità di colture cellulari. Qui, abbiamo adattato una piccola molecola procedura basata differenziazione di un formato di piastra multititre, permettendo la generazione semplice, rapido, efficace e di neuroni umani in modo controllato.

Generazione rapida e efficiente di neuroni da cellule staminali umane pluripotenti in un formato piatto Multititre

Questo video dimostra la differenziazione delle cellule staminali embrionali umane (hESC) in neuroni dopaminergici, per fornire un modello per lo studio del morbo di Parkinson. Le hESC vengono coltivate in un mezzo di induzione neurale in una piastra a micropozzetti per formare neurosfere 3D. Questi vengono poi coltivati in un mezzo di induzione neurale per promuovere la differenziazione in neuroni progenitori dopaminergici. La maturazione finale dei neuroni avviene in un inserto di coltura in...

Generazione di organoidi neuronali dopaminergici da cellule staminali embrionali umane

Spine dendritiche di neuroni piramidali sono i siti di maggior sinapsi eccitatorie in mammiferi corteccia cerebrale. Il metodo descrive un'analisi quantitativa 3D di morfologie della colonna vertebrale nei neuroni piramidali glutamatergici corticali umane derivate da cellule staminali pluripotenti indotte.

Quantificazione tridimensionale di spine dendritiche da piramidale neuroni derivate da cellule staminali umane pluripotenti indotte

Riprogrammazione neuronale diretto genera neuroni che mantengono l'età della cellula somatica partenza. Qui, descriviamo un metodo basato su vettori per generare neuroni indotti dai fibroblasti cutanei ottenuti da donatori umani adulti.

Semplice generazione di una cultura ad alto rendimento dei neuroni indotti da fibroblasti umani della pelle adulta

In questo protocollo, ci proponiamo di descrivere un metodo riproducibile per combinare dissociato pluripotenti umane su cellule staminali neuroni e astrociti insieme in 3D sfera cocultures, mantenendo queste sfere in condizioni galleggiante libera e successivamente misurazione dell'attività sinaptica circuito delle sfere con immunoanalysis e registrazioni di matrice multielettrodo.

Microcircuito sinaptica modellazione con 3D Cocultures di astrociti e neuroni da cellule staminali pluripotenti umane

Questo studio introduce e descrive protocolli per derivare due organoidi neurali umani specifici come un modello rilevante e accurato per lo studio 1) lo sviluppo del glioblastoma umano all'interno di organoidi neurali umani esclusivamente negli esseri umani e 2) neuronergico differenziazione generando un organoide tridimensionale.

Organidi neurali umani per lo studio del cancro al cervello e delle malattie neurodegenerative

Questo protocollo fornisce una procedura completa per fabbricare organoide del nervo motorio derivato dalle cellule iPS umane attraverso l'assemblaggio spontaneo di un robusto fascio di assoni estesi da uno sferoide in un chip di coltura tissutale.

Generazione organoide nervosa motoria tridimensionale

Le interazioni neurone-glia nella neurodegenerazione non sono ben comprese a causa di strumenti e metodi inadeguati. Qui, descriviamo protocolli ottimizzati per ottenere neuroni indotti, cellule precursori degli oligodendrociti e oligodendrociti da cellule staminali pluripotenti umane e forniamo esempi dei valori di questi metodi nella comprensione dei contributi specifici del tipo di cellula nella malattia di Alzheimer.

Generazione di neuroni umani e oligodendrociti da cellule staminali pluripotenti per la modellazione delle interazioni neurone-oligodendrociti

Qui, presentiamo un protocollo per produrre cocolture biostampate in 3D di neuroni e astrociti derivati da iPSC. Questo modello di cocoltura, generato all'interno di un'impalcatura di idrogel in formati a 96 o 384 pozzetti, dimostra un'elevata vitalità post-stampa e la crescita dei neuriti entro 7 giorni e mostra l'espressione di marcatori di maturità per entrambi i tipi di cellule.

Bioprinting tridimensionale di cocolture neurone-astrociti derivate da iPSC umane per applicazioni di screening

Scopri la differenziazione neuronale rapida di cellule staminali pluripotenti umane in un bioreattore 3D a sospensione. Questo metodo garantisce alta resa cellulare e bassa variabilità tra i lotti per applicazioni su larga scala.

Produzione di neuroni umani 2-inducibili in un bioreattore tridimensionale a sospensione

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