Produzione di neuroni umani 2-inducibili in un bioreattore tridimensionale a sospensione

L'utilizzo di bioreattori per tradurre cellule staminali pluripotenti indotte o protocolli di coltura IPSC da 2D a 3D consente la generazione di cellule in numero elevato per applicazioni su larga scala come screening ad alto rendimento. Questo protocollo di differenziazione neuronale veloce in un ambiente fisiologico 3D migliora le interazioni delle cellule starter e offre un'elevata resa cellulare per una durata più breve con una bassa variazione batch-to=batch, riducendo così costi e tempi. La Banca europea delle cellule staminali pluripotenti indotte sta applicando approcci simili per la generazione rapida ed economica di cellule differenziate in più lineaggi, comprese altre cellule cerebrali e cardiomiociti.

Iniziare la pre-coltivazione quando la cellula staminale pluripotente indotta dall'uomo, o coltura umana di iPSC, è dal 60 all'80% confluente. Aspirare completamente il mezzo dalle iPSC umane e sciacquare delicatamente le cellule con 1X DPBS due volte. Aggiungere due millilitri di soluzione di tripsina EDTA preriscaldata alla piastra di Petri di sei centimetri e incubare le cellule per tre minuti a 37 gradi Celsius in un'incubatrice.

Quindi, picchiettare delicatamente i piatti per facilitare il distacco delle cellule o incubare per uno o due minuti in più se le cellule non si staccano. Quindi, risospendere le cellule in ogni piatto aggiungendo cinque millilitri di mezzo di mantenimento IPSC senza alimentatore con inibitore ROCK. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 15 millilitri o 50 millilitri e mescolare delicatamente mediante pipettaggio per garantire la singolarizzazione cellulare.

Determinare il numero di celle in 100 microlitri di sospensione cellulare utilizzando un contatore automatico di celle e trasferire il volume desiderato di sospensione cellulare in un tubo da 50 millilitri. Centrifugare le cellule a 300 G per tre minuti. Quindi, aspirare il surnatante e risospendere le cellule in due millilitri di mezzo di mantenimento IPSC senza alimentatore con inibitore ROCK.

Riempire ogni tubo da 50 millilitri con 18 millilitri del mezzo. Quindi, erogare 20 millilitri di sospensione cellulare in ciascun tubo del bioreattore. Posizionare i tubi nel sistema del bioreattore e impostare i parametri di coltivazione per una durata illimitata.

Avviare il programma di pre-coltivazione tramite il display del bioreattore. Per cambiare il mezzo il giorno successivo, lasciare che l'aggregato si depositi nei tubi del bioreattore per circa cinque minuti prima di aspirare accuratamente il surnatante. Aggiungere 15 millilitri di terreno di mantenimento IPSC fresco senza alimentatore senza inibitore ROCK per provetta e continuare la coltivazione nel bioreattore da banco per 24 ore.

Per iniziare la differenziazione neuronale, lasciare che l'aggregato si depositi nei tubi del bioreattore e aspirare con cura il surnatante dalle cellule, lasciando circa cinque millilitri di surnatante nel tubo. Quindi, aggiungere 35 millilitri di mezzo di induzione neurale costituito da mezzo neurobasale e due microgrammi per millilitro di doxiciclina. Rimetti i tubi nel bioreattore da banco e continua la coltivazione.

Eseguire modifiche ai supporti ogni giorno per due giorni, come dimostrato in precedenza. Dopo aver aspirato il surnatante come mostrato in precedenza, trasferire gli aggregati in un tubo sterile da 15 millilitri o 50 millilitri e risciacquare delicatamente gli aggregati due volte con DPBS. Aspirare con attenzione il surnatante il più possibile senza disturbare gli aggregati.

Quindi aggiungere da due a cinque millilitri di enzima di dissociazione cellulare preriscaldato al pellet, a seconda delle dimensioni del pellet, e incubare le cellule per circa 10 minuti a 37 gradi Celsius a bagnomaria. Risospendere delicatamente gli aggregati sedimentati ogni due minuti fino a quando gli aggregati non si dissociano. Aggiungere il mezzo neurobasale preriscaldato, tre volte il volume dell'enzima di dissociazione cellulare precedentemente aggiunto, e risospendere attentamente le cellule per garantire la singolarizzazione cellulare.

Determinare il numero di cellule e trasferire il volume corrispondente di sospensione cellulare per la crioconservazione in un tubo da 15 millilitri o 50 millilitri. Centrifugare alle cellule a 300 G per tre minuti. Aspirare il surnatante e risospendere delicatamente il pellet cellulare nel volume corrispondente del mezzo di congelamento contenente il 10% di dimetilsolfossido.

Aliquotare la sospensione cellulare in flaconcini idonei per la crioconservazione. Trasferire immediatamente i flaconcini in un contenitore di congelamento pre-raffreddato e a bassa velocità riempito con 2-propanolo e posizionare il contenitore a meno 80 gradi Celsius durante la notte. Posizionare i flaconcini a meno 150 gradi Celsius il giorno successivo per la conservazione a lungo termine.

Dopo che le colture aderenti delle iPSC umane sono state staccate, singolarizzate, e trasferite in sospensione, gli aggregati si sono formati entro 24 ore e hanno continuato a crescere. Dopo due giorni di induzione del transgene, i primi neuroni potrebbero essere crioconservati per la successiva maturazione. È stata osservata una proliferazione persistente delle iPSC umane durante i primi giorni di sospensione e il numero di colture cellulari ha raggiunto il picco dopo due giorni di induzione.

Tuttavia, la coltivazione prolungata per più di quattro giorni in sospensione non ha migliorato la resa cellulare, poiché gli aggregati sono diventati sempre più resistenti alla singolarizzazione enzimatica. Inoltre, rispetto al giorno zero, il diametro aggregato è aumentato del 50% il secondo giorno e quasi raddoppiato il quinto giorno. Sebbene l'aumento del diametro limiti l'apporto di nutrienti agli aggregati, la vitalità delle cellule non è stata influenzata il secondo o il quinto giorno di differenziazione.

Il profilo di espressione genica temporale e la colorazione immunochimica per i marcatori neuronali beta tre tubulina e proteina associata ai microtubuli, o MAP2, hanno confermato l'identità cellulare neuronale delle cellule crioconservate del giorno due. Inoltre, le colture neuronali sono state arricchite in trascritti tau proteici associati ai microtubuli, o MAPT, e hanno mostrato un concomitante declino nell'espressione del fattore di trascrizione che regola la pluripotenza POU5F1 Una fitta rete neuritica si è formata entro la prima settimana dopo lo scongelamento, che ha anche suggerito una crescente maturazione delle colture neuronali. Questo protocollo pone le basi per la traduzione in bioreattori su larga scala e completamente automatizzati, che mostrano un ulteriore significativo aumento della capacità di produzione delle celle per future applicazioni su larga scala.

Una volta dimostrato con la neurogenina 2, l'uso di fattori di trascrizione determinanti lineari per accelerare la differenziazione è stato applicato a molti diversi tipi di cellule e malattie per facilitare la modellazione iPSC.