Name: Formazione immagine tridimensionale su larga scala di organizzazione cellulare nella neocorteccia Mouse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-05T15:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 55 s
Description: Scopri l'imaging tridimensionale su larga scala dell'organizzazione cellulare nella neocorteccia del topo. Questo metodo di marcatura fluorescente e tissue clearing rivela la struttura neuronale in 3D.

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Ringraziamo Atsushi Miyawaki e Hiroshi Hama per i loro consigli sugli esperimenti elAbSca, Charles Yokoyama per l'editing del manoscritto, Eriko Ohshima e Miyuki Kishino per la loro assistenza tecnica. Questo lavoro è stato sostenuto dai fondi di ricerca da RIKEN T.H. e localizzativi per ricerca scientifica dal Ministero della pubblica istruzione, cultura, sport, scienza e tecnologia (MEXT) del Giappone di T.H. (aree Innovative "Mesoscopiche neurocircuiti"; 22115004) e S.S. (25890023).

Tutte le procedure sperimentali sono state approvate dal comitato di esperimenti di RIKEN Wako animale e RIKEN genetico ricombinante esperimento Safety Committee ed eseguite secondo le linee guida istituzionali dell'animale il RIKEN Brain Science: Servizi Istituto.
1. preparazione di Imaging Chambers
<ol><li>
Imaging camera19
	<ol>
<li>Utilizzando lastre di gomma siliconica, preparare una camera con uno spessore di circa 5 mm e piano lamiere di vari spessori. Inoltre, preparare piatti Petri con e senza un fondo di vetro (Figura 1A).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Distanziale di fetta
	<ol>
<li>Preparare i distanziali per contenere campioni, utilizzando lastre di gomma siliconica con uno spessore di 0,5 mm (Figura 1).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. tracer iniezione
Nota: Fare iniezioni nel collicolo superiore (2.2) o pons (2.1). Iniezione nei neuroni di proiezione Sub-cerebrale di etichetta pons in una regione vasta cervello, comprese le aree visive e motorie, mentre l'iniezione nel collicolo superiore etichette neuroni di proiezione Sub-cerebrale nel campo visivo. Per gli esperimenti di controllo, iniettare soluzione fisiologica invece di subunità di fluorescente etichettati colera tossina B. Per il mantenimento dello stato sterile utilizzare attrezzature sterilizzate e guanti di plastica puliti con etanolo.
<ol><li>
Fare le iniezioni nel ponte di topi adulti.
	<ol>
<li>Disegnare 1 µ l di subunità di fluorescente etichettati colera tossina B (25 µ g / µ l di PBS) in una siringa Hamilton G 26.</li>
		<li>Posto un iniettore pompa della siringa.</li>
		<li>Posizionare la siringa e la pompa al supporto utensile di un manipolatore posizionato su uno strumento stereotassica. Inclinare il manipolatore 12° posteriormente rispetto all'asse verticale.</li>
		<li>Anestetizzare un topo adulto maschio o femmina (C57BL/6J o Tlx3-cre/Ai9) iniettando sodio pentobarbital intraperitonealmente (60 mg/kg di peso corporeo) o con la somministrazione di isoflurano (2 – 3%). Attendere fino a quando il mouse non fa nessuna risposta quando la coda viene pizzicata con il forcipe, che indica che il mouse è completamente anestetizzato.</li>
		<li>Posizionare il mouse sullo strumento stereotassica.</li>
		<li>Rimuovere accuratamente i capelli con una lama di rasoio per prevenire l'infezione e tagliare 10 mm del cuoio capelluto in modo che il bregma e lambda sono visibili. Somministrare 0,1 mL di lidocaina 1% utilizzando una pipetta. Regolando la posizione verticale del boccaglio sullo strumento stereotassica affinché il bregma e lambda hanno lo stesso livello di z, impostare l'angolo della testa.</li>
		<li>Regolare la posizione del manipolatore facendolo sullo strumento stereotassica in modo che la punta della siringa è vicino il bregma e registrare la posizione del manipolatore. Ritrarre la siringa spostando il portautensile sul manipolatore.</li>
		<li>Spostare il manipolatore 5,4 mm posteriormente e 0,4 mm lateralmente. Avanzare la siringa in modo che la punta si trova vicino al punto di entrata sul cranio. Ritrarre la siringa e segnare il punto di ingresso.</li>
		<li>La posizione contrassegnata, praticare un foro con un diametro di circa 1 mm.</li>
		<li>Inserire la punta della siringa nel foro in modo che la profondità della punta è 6,9 mm più di quella misurata presso il bregma.</li>
		<li>Iniettare 1 µ l di traccianti utilizzando la pompa a 0,2 µ l/min.</li>
		<li>Rimuovere la siringa dal cervello.</li>
		<li>Se necessario, coprire il cervello esposto con piccoli frammenti di microfibrillare emostato e adesivo istantaneo.</li>
		<li>Sciacquare il cervello esposto utilizzando soluzione fisiologica consegnato con una pipetta per prevenire l'infezione e suturare il cuoio capelluto.</li>
		<li>Rimuovere il mouse dallo strumento stereotassica. Consentire il mouse per recuperare dall'anestesia in un incubatore a 30 ˚ c, in genere per 1 h. Non lasciare incustodito il mouse fino a quando ha riacquistato coscienza sufficiente per mantenere decubito sternale. Restituire il mouse per la compagnia di altri animali dopo che completamente ha recuperato.</li>
		<li>Mantenere il mouse per 3 – 7 giorni.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Fare le iniezioni nel collicolo superiore di topi adulti.
	<ol>
<li>Preparare una pipetta di vetro con un diametro di punta di 30 – 50 µm.</li>
		<li>Connettere la pipetta di vetro una siringa Hamilton attraverso un tubo di plastica (Figura 2A).</li>
		<li>Riempire la pipetta di vetro, tubo di plastica e siringa Hamilton con il liquido paraffina.</li>
		<li>Posto un iniettore pompa della siringa.</li>
		<li>Inserire la pipetta di vetro sul manipolatore e inclinare il manipolatore 60° posteriormente rispetto all'asse verticale (Figura 2B).</li>
		<li>Eseguire 2.1.4–2.1.9. La posizione del manipolatore è 1,4 mm posteriore, laterale di 0,5 mm per l'espressione lambda.</li>
		<li>Posizionare una pellicola di plastica piccolo paraffina sul cranio, quindi mettere circa 1 µ l della soluzione tracciante su di esso. Avanzare la pipetta di vetro e riempirlo con almeno 0,5 µ l della soluzione tracciante rapidamente.</li>
		<li>Inserire la pipetta di vetro in modo che la profondità di punta è di 3,0 mm dalla superficie del cervello.</li>
		<li>Iniettare 0,5 µ l di traccianti utilizzando la pompa a 0,2 µ l/min.</li>
		<li>Rimuovere la pipetta di vetro dal cervello.</li>
		<li>Eseguire 2.1.13–2.1.16.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. fissazione e rifilatura
<ol><li>Iniettare per via intraperitoneale sodio pentobarbital (60 mg/kg di peso corporeo) in un mouse (C57BL/6J o Tlx3-cre/Ai9, con o senza l'iniezione tracciante come descritto nel passaggio 2. Attendere fino a quando il mouse non fa nessuna risposta quando la coda viene pizzicata con il forcipe, che indica che il mouse è completamente anestetizzato.</li>
	<li>Eutanasia il mouse umanamente irrorando il mouse via20 con soluzione fisiologica allo 0,9%.</li>
	<li>Difficoltà il mouse20 irrorando paraformaldeide al 4% (PFA) in 0.1 M tampone fosfato (pH 7.5).</li>
	<li>
Tagliare il cuoio capelluto utilizzando un paio di forbici per esporre il cranio come descritto20.
	<ol>
<li>Tagliare la linea mediana del cranio esposto utilizzando un paio di forbici. Rimuovere il cranio usando il forcipe.</li>
		<li>Se contrassegnare la posizione del bregma e lambda è necessario, prima di rimuovere un emisfero del cranio. Inserire gli aghi sottili di tungsteno nel cervello alle posizioni del bregma e lambda sul cranio restanti sul cervello, quindi rimuovere il cranio rimanente. Nota: Il cervello possa essere memorizzato in PBS a 4 ˚ c.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Per eseguire la macchiatura dell'anticorpo dei neuroni inibitori, tagliare a fette i campioni di cervello.
	<ol>
<li>Posizionare il campione di cervello su un vibratomo.</li>
		<li>Tagliate le fette fino a 500 µm di spessore in PBS a temperatura ambiente e procedere al passaggio 5 (il AbScale metodo).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Se la macchiatura dell'anticorpo è necessaria, trim il campione di cervello a blocchi (fino a 3 mm di spessore) con una lama di rasoio (Figura 3) e procedere al passaggio 4 (metodo SeeDB). Nota: Il cervello possa essere memorizzato in PBS a 4 ° C dopo il taglio o rifilatura. Il metodo di SeeDB è preferibile quando la macchiatura dell'anticorpo non è necessaria perché richiede meno tempo rispetto al metodo dil. e AbSca.</li>
</ol>4. compensazione senza anticorpi (metodo SeeDB)
<ol><li>Trasferire il campione con una spatola per un tubo di plastica da 50 mL contenente 20 mL di 0.5% α-thioglycerol e 20% (p/v) di fruttosio e incubare per 4 h con agitazione delicata a temperatura ambiente.</li>
	<li>Trasferire il campione con una spatola per un tubo di plastica da 50 mL contenente 20 mL di 0.5% α-thioglycerol e 40% (p/v) di fruttosio e incubare per 4 h con agitazione delicata a temperatura ambiente.</li>
	<li>Trasferire il campione con una spatola per un tubo di plastica da 50 mL contenente 20 mL di 0.5% α-thioglycerol e 60% (p/v) di fruttosio e incubare per 4 h con agitazione delicata a temperatura ambiente.</li>
	<li>Trasferire il campione con una spatola per un tubo di plastica da 50 mL contenente 20 mL di 0.5% α-thioglycerol e 80% (w/v) di fruttosio e incubare per 12 h con agitazione delicata a temperatura ambiente.</li>
	<li>Trasferire il campione con una spatola per un tubo di plastica da 50 mL contenente 20 mL di 0.5% α-thioglycerol e 100% (p/v) di fruttosio e incubare per 12 h con agitazione delicata a temperatura ambiente.</li>
	<li>Trasferire il campione con una spatola per un tubo di plastica di 50 mL contenente 20 mL di 0.5% α-thioglycerol e 80,2% di fruttosio (w/w) e incubare per 24 h con agitazione delicata a temperatura ambiente. Nota: Maneggiare il campione accuratamente per evitare deformazioni più piccolo possibile. Non Incubare i campioni più lunghi rispetto a quanto indicato, come campioni possono rapidamente diventare opachi.</li>
	<li>Incorporare il campione in una camera di imaging riempita con la soluzione di fruttosio 80,2% (Figura 1B). Se necessario, correggere l'esempio mettendo piccoli pezzi di adesivo di gomma intorno. Se la camera è troppo profonda, mettere un piatto piano in Aula prima di mettere i campioni.</li>
	<li>Mettere la capsula di Petri con un coperchio di vetro sulla camera imaging e mettere l'acqua nel piatto e immagine mediante microscopia confocale o due fotoni con un'immersione in acqua-obiettivo di distanza di funzionamento lunga. Lunghezze d'onda di eccitazione e di emissione filtri sono descritti nella tabella 1. Se necessario, utilizzare un tavolino motorizzato.</li>
</ol>5. schiarimento con anticorpo che macchia (il AbScale metodo)
<ol><li>Preparare i reagenti come descritto in tabella 2.</li>
	<li>Trasferire le fette con una spatola per un tubo di plastica da 5 mL contenente 4 mL di soluzione di Sca/eS0 e li Incubare per 12 h con agitazione delicata a 37 ° C (Figura 4B).</li>
	<li>Rimuovere la soluzione dal tubo usando una pipetta, aggiungere 4 mL di soluzione di Sca/eA2 e incubare le fette per 36 h con agitazione delicata a 37 ° C.</li>
	<li>Rimuovere la soluzione dal tubo usando una pipetta, aggiungere 4 mL di soluzione di Sca/eB4 e incubare le fette per 24 h con agitazione delicata a 37 ° C.</li>
	<li>Rimuovere la soluzione dal tubo usando una pipetta, aggiungere 4 mL di soluzione di Sca/eA2 e incubare le fette per 12 h con agitazione delicata a 37 ° C.</li>
	<li>Rimuovere la soluzione dal tubo usando una pipetta e aggiungere 4 mL di PBS e incubare le fette per 6 h con agitazione delicata a temperatura ambiente.</li>
	<li>Rimuovere con cautela le fette di un tubo di plastica da 2 mL con una spatola.</li>
	<li>Incubare con gli anticorpi primari (tabella 3) in 1 mL di soluzione di AbScale per 48-72 h a 37 ° C (Figura 4) con agitazione delicata.</li>
	<li>Rimuovere con cautela le fette di un tubo di plastica da 5 mL con una spatola.</li>
	<li>Incubare in 4 mL di soluzione di AbScale per 2 h 2 volte a temperatura ambiente con agitazione delicata.</li>
	<li>Rimuovere con cautela le fette di un tubo di plastica da 2 mL con una spatola.</li>
	<li>Incubare con anticorpi secondari con etichetta fluorescente (Tabella materiali, 1: 100) in 1 mL di soluzione di AbScale per 48 h a 37 ° C con agitazione delicata.</li>
	<li>Rimuovere le fette con una spatola per un tubo di plastica da 5 mL contenente 4 mL della soluzione elAbSca con cautela e incubare le fette per 6 h con agitazione delicata a temperatura ambiente.</li>
	<li>Rimuovere la soluzione dal tubo usando una pipetta e aggiungere 4 mL della soluzione elAbSca e incubare le fette per 2 h 2 volte con agitazione delicata a temperatura ambiente.</li>
	<li>Rimuovere la soluzione dal tubo usando una pipetta e aggiungere 4 mL di 4% PFA e incubare le fette per 1 h con agitazione delicata a temperatura ambiente.</li>
	<li>Rimuovere la soluzione dal tubo usando una pipetta e aggiungere 4 mL di PBS e incubare le fette per 1 h con agitazione delicata a temperatura ambiente.</li>
	<li>Rimuovere la soluzione dal tubo usando una pipetta, aggiungere 4 mL di soluzione di Sca-eS4 e incubare le fette per 12 h con agitazione delicata a 37 ° C.</li>
	<li>Posizionare il distanziale su un vetrino e mettere le fette nel distanziale e immergere le fette con Sca-eS4 soluzione. Sigillare il distanziatore con un vetro di copertura (Figura 1).</li>
	<li>Mettere l'acqua sul vetro di copertura e immagine mediante microscopia confocale o due fotoni con un'immersione in acqua-obiettivo di distanza di funzionamento lunga. Se necessario, utilizzare un tavolino motorizzato. Nota: Controllare se le parti profonde del campione sono etichettate allo stesso modo per le parti superficiali per confermare l'assenza di una significativa distorsione d'etichettatura. Nota: La penetrazione degli anticorpi testati è descritto nella tabella 3.</li>
</ol>6. determinazione della posizione di cella
<ol><li>Per ciascuna posizione in immagini digitalizzate, calcolare i valori di correlazione utilizzando un'immagine tridimensionale filtro14 (Figura 5A-5D).</li>
	<li>Determinare le posizioni dei picchi del valore di correlazione (Figura 5).</li>
	<li>Indagare le immagini intorno alle cime per individuare le celle (Figura 5E).</li>
</ol>

<ol><li>Lein, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+atlas+of+gene+expression+in+the+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain.</a> Nature. 445 (7124), 168-176 (2007).</li>
<li>Defelipe, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+classification+and+nomenclature+of+cortical+GABAergic+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons.</a> Nature Reviews Neuroscience. 14 (3), 202-216 (2013).</li>
<li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+connectivity+among+morphologically+defined+cell+types+in+adult+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Principles of connectivity among morphologically defined cell types in adult neocortex.</a> Science. 350 (6264), aac9462(2015).</li>
<li>Sorensen, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlated+gene+expression+and+target+specificity+demonstrate+excitatory+projection+neuron+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Correlated gene expression and target specificity demonstrate excitatory projection neuron diversity.</a> Cerebral Cortex. 25 (2), 433-449 (2015).</li>
<li>Zeisel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+structure.+Cell+types+in+the+mouse+cortex+and+hippocampus+revealed+by+single-cell+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Brain structure. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq.</a> Science. 347, 1138-1142 (2015).</li>
<li>Tasic, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+mouse+cortical+cell+taxonomy+revealed+by+single+cell+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics.</a> Nature Neuroscience. 19 (2), 335-346 (2016).</li>
<li>Zeng, H., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+cell-type+classification%3A+Challenges%2C+opportunities+and+the+path+forward%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuronal cell-type classification: Challenges, opportunities and the path forward.</a> Nature Reviews Neuroscience. 18 (9), 530-546 (2017).</li>
<li>Horton, J. C., Adams, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cortical+column%3A+a+structure+without+a+function%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">The cortical column: a structure without a function.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 360 (1456), 837-862 (2005).</li>
<li>Costa, N. M., Martin, K. A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whose+cortical+column+would+that+be%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">Whose cortical column would that be?</a> Frontiers in Neuroanatomy. 4, Article 16 (2010).</li>
<li>Molyneaux, B. J., Arlotta, P., Menezes, J. R. L., Macklis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+subtype+specification+in+the+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuronal subtype specification in the cerebral cortex.</a> Nature Reviews Neuroscience. 8 (6), 427-437 (2007).</li>
<li>Hioki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+inhibitory+inputs+to+dendritic+and+somatic+compartments+of+parvalbumin-expressing+neocortical+interneuron%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific inhibitory inputs to dendritic and somatic compartments of parvalbumin-expressing neocortical interneuron.</a> Journal of Neuroscience. 33 (2), 544-555 (2013).</li>
<li>Maruoka, H., Kubota, K., Kurokawa, R., Tsuruno, S., Hosoya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Periodic+organization+of+a+major+subtype+of+pyramidal+neurons+in+neocortical+layer+V%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Periodic organization of a major subtype of pyramidal neurons in neocortical layer V.</a> Journal of Neuroscience. 31 (50), 18522-18542 (2011).</li>
<li>Kwan, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Species-dependent+posttranscriptional+regulation+of+NOS1+by+FMRP+in+the+developing+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Species-dependent posttranscriptional regulation of NOS1 by FMRP in the developing cerebral cortex.</a> Cell. 149 (4), 899-911 (2012).</li>
<li>Maruoka, H., Nakagawa, N., Tsuruno, S., Sakai, S., Yoneda, T., Hosoya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lattice+system+of+functionally+distinct+cell+types+in+the+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lattice system of functionally distinct cell types in the neocortex.</a> Science. 358 (6363), 610-615 (2017).</li>
<li>Treweek, J. B., Gradinaru, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracting+structural+and+functional+features+of+widely+distributed+biological+circuits+with+single+cell+resolution+via+tissue+clearing+and+delivery+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Extracting structural and functional features of widely distributed biological circuits with single cell resolution via tissue clearing and delivery vectors.</a> Current Opinion in Biotechnology. 40, 193-207 (2016).</li>
<li>Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+Principles+in+Tissue+Clearing+and+Staining+Protocols+for+Whole-Body+Cell+Profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Chemical Principles in Tissue Clearing and Staining Protocols for Whole-Body Cell Profiling.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32 (1), (2016).</li>
<li>Gerfen, C. R., Paletzki, R., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GENSAT+BAC+cre-recombinase+driver+lines+to+study+the+functional+organization+of+cerebral+cortical+and+basal+ganglia+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">GENSAT BAC cre-recombinase driver lines to study the functional organization of cerebral cortical and basal ganglia circuits.</a> Neuron. 80 (6), 1368-1383 (2013).</li>
<li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ScaleS%3A+an+optical+clearing+palette+for+biological+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging.</a> Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).</li>
<li>Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SeeDB%3A+a+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nature Neuroscience. 16 (8), 1154-1161 (2013).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).</li>
<li>Kim, S. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+electrotransport+selectively+enhances+the+transport+of+highly+electromobile+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Stochastic electrotransport selectively enhances the transport of highly electromobile molecules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (46), E6274-E6283 (2015).</li>
<li>Murray, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple%2C+scalable+proteomic+imaging+for+high-dimensional+profiling+of+intact+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Simple, scalable proteomic imaging for high-dimensional profiling of intact systems.</a> Cell. 163 (6), 1500-1514 (2015).</li>
<li>Ke, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+mapping+of+neuronal+circuitry+with+an+index-optimized+clearing+agent%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Super-resolution mapping of neuronal circuitry with an index-optimized clearing agent.</a> Cell Reports. 14 (11), 2718-2732 (2016).</li>
<li>Lee, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ACT-PRESTO%3A+Rapid+and+consistent+tissue+clearing+and+labeling+method+for+3-dimensional+%283D%29+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">ACT-PRESTO: Rapid and consistent tissue clearing and labeling method for 3-dimensional (3D) imaging.</a> Scientific Reports. 6, 18631(2016).</li>
<li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+Brain+Activity+by+Automated+Volume+Analysis+of+Immediate+Early+Genes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mapping of Brain Activity by Automated Volume Analysis of Immediate Early Genes.</a> Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).</li>
<li>Kubota, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+profiling+of+cancer+metastasis+with+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Whole-body profiling of cancer metastasis with single-cell resolution.</a> Cell Reports. 20 (1), 236-250 (2017).</li>
<li>Li, W., Germain, R. N., Gerner, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex%2C+quantitative+cellular+analysis+in+large+tissue+volumes+with+clearing-enhanced+3D+microscopy+%28Ce3D%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Multiplex, quantitative cellular analysis in large tissue volumes with clearing-enhanced 3D microscopy (Ce3D).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (35), E7321-E7330 (2017).</li>
<li>Liu, A. K. L., Lai, H. M., Chang, R. C. C., Gentleman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free+of+acrylamide+sodium+dodecyl+sulphate+%28SDS%29-based+tissue+clearing+%28FASTClear%29%3A+a+novel+protocol+of+tissue+clearing+for+three-dimensional+visualization+of+human+brain+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropathology+and+Applied+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Free of acrylamide sodium dodecyl sulphate (SDS)-based tissue clearing (FASTClear): a novel protocol of tissue clearing for three-dimensional visualization of human brain tissues.</a> Neuropathology and Applied Neurobiology. 43 (4), 346-351 (2017).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Abbiamo presentato le procedure per ottenere immagini tridimensionali su larga scala dell'organizzazione cellulare specifico del tipo dei tipi principali delle cellule nello strato neocortical mouse 5. Rispetto alla fetta convenzionale macchiatura, il metodo è più utile nel determinare l'organizzazione tridimensionale della neocorteccia. Il metodo consente acquisizione immagini dalla più ampia e le regioni del cervello più profonde rispetto al tipico in vivo microscopia 2-fotone o microscopia confocale convenzio...

La neocorteccia dei mammiferi è composta da un gran numero di tipi di cellule, ognuna con il pattern di espressione genica specifici, proprietà elettrofisiologiche e biochimiche, connessioni sinaptiche, e in vivo funzioni1,2 ,3,4,5,6,7. Se questi tipi di cellule sono organizzati in strutture ripetute è stato poco chiaro. Colonne corticali, comprese le colonne di orientamento visivo e somatosensoriali botti, hanno ripetuto le strutture, ma la loro organizzazione cellulare rimane poco chiaro8,9. Questi sono presenti nelle specifiche aree corticali e non sono un sistema di tutto il cervello.
Nello strato neocortical 5, la grande maggioranza dei neuroni è classificata in quattro tipi principali. Un tipo principale di neuroni eccitatori, neuroni di proiezione Sub-cerebrale, proietta assoni subcortical obiettivi inclusi pons, midollo spinale e il collicolo superiore e, pertanto, rappresenta i principali output corticale via10. Neuroni di proiezione corticale, un altro tipo di neuroni eccitatori, innervano la corteccia10. Neuroni inibitori contengono anche due grandi classi: le cellule che esprimono parvalbumina ed esprimendo la somatostatina11.
Recenti analisi indicano che i tipi di quattro cellule sono organizzati in strutture ripetute12,13,14. Sia sub-cerebrale proiezione neuroni12,13,14 e proiezione corticale neuroni14 organizzare in cellula-tipo microcolonne specifico con un diametro di 1 – 2 celle. Le cellule che esprimono parvalbumina e somatostatina-esprimendo allineare specificamente con microcolonne dei neuroni di proiezione Sub-cerebrale ma non con microcolonne di proiezione corticale neuroni14. Microcolonne stessi allineare periodicamente a forma esagonale della grata di matrice14 e sono presenti in più aree corticali, comprese le zone visivi, somatosensoriali e motori nel cervello del mouse12,14 e in lingua aree del cervello umano13. Neuroni nella microcolonna singolo esibiscono l'attività sincronizzata e avere risposte sensoriali simili14. Queste osservazioni indicano che tipi di cellule strato 5 organizzano in una struttura di reticolo microcolonna che rappresenta l'organizzazione di tutto il cervello nota prima di ripetere moduli funzionali.
Microcolonne hanno un raggio di circa 10 µm e hanno una periodicità spaziale di circa 40 µm. Inoltre, l'orientamento delle microcolonne è parallelo alla loro dendriti apicali e cambia a seconda della loro posizione nella corteccia14. Pertanto, il sistema microcolonna è difficile da analizzare utilizzando fette corticali convenzionale con uno spessore tipico di poche decine di micrometri. Inoltre, l'analisi della periodicità richiede dati tridimensionali da una vasta gamma di aree cerebrali e, pertanto, l'area di imaging tipico di microscopia confocale o in vivo imaging 2-fotone è troppo stretta.
Recentemente, le tecniche sono state sviluppate per deselezionare tessuti spessi15,16. Qui descriviamo l'applicazione di questi metodi per ottenere immagini tridimensionali, su larga scala dei tipi principali delle cellule nello strato neocortical mouse 5 che compongono il sistema microcolonna. Neuroni di proiezione subcerebral sono etichettati dall'etichettatura retrograda o dall'espressione della proteina fluorescente verde avanzata in Crym-egfp topi transgenici12e proiezione corticale neuroni sono etichettati da entrambi il retrogrado etichettatura o dall'espressione del tdTomato Tlx3-cre/Ai9 topi17. Le cellule che esprimono parvalbumina e che esprimono somatostatina sono etichettate da immunohistochemistry. Il metodo (anticorpo scala S) AbScale18 viene utilizzato per l'anticorpo che macchia esperimenti, mentre il metodo SeeDB (vedere cerebrale profonda)19 viene utilizzato per altri esperimenti. Questi metodi superare le suddette difficoltà dei metodi convenzionali di formazione immagine e rivelano l'organizzazione accurata di strato 514.

<table><tbody><tr><td>Topi transgenici Crym-egfp</td><td>MMRRC</td><td>012003-UCD</td><td></td></tr><tr><td>Tlx3-cre topi transgenici</td><td>MMRRC</td><td>36547-UCD</td><td></td></tr><tr><td>ROSA-CAG-flox-tdTopi pomodoro</td><td>Jackson Laboratory</td><td>JAX #7909</td><td></td></tr><tr><td>Foglio di gomma siliconica</td><td>AS ONE</td><td>6-611-01</td> Foglio di gomma siliconica spessore <td>0,5 mm</td></tr><tr><td></td><td>AS ONE</td><td>6-611-02</td><td>Spessore 1,0 mm</td></tr><tr><td>Foglio di gomma siliconica</td><td>AS ONE</td><td>6-611-05</td> piastre di Petri <td>spessore 3,0 mm</td></tr><tr><td></td><td>Falcon</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>Vetro di copertura</td><td>Matsunami</td><td>C022241</td><td></td></tr><tr><td>tossina del colera subunità B (ricombinante), Alexa Fluor 488 coniugato</td><td>Invitrogen</td><td>C22841</td><td></td></tr><tr><td>tossina del colera subunità B (ricombinante), Alexa Fluor 555 coniugato</td><td>Invitrogen</td><td>C22843</td><td></td></tr><tr><td>Subunità B della tossina del colera (ricombinante), Alexa Fluor 594 coniugato</td><td>Invitrogen</td><td>C22842</td><td></td></tr><tr><td>Subunità B della tossina del colera (ricombinante), Alexa Fluor 647 coniugato</td><td>Invitrogen</td><td>C34778</td><td></td></tr><tr><td>Siringa Hamilton da 26 G</td><td>Hamilton</td><td>701N</td><td></td></tr><tr><td>Pompa iniettore</td><td>KD Scientific</td><td>KDS 310</td><td>Pons iniezione</td></tr><tr><td>Pompa iniettore</td><td>KD Scientific</td><td>KDS 100</td><td>Superiore collicolo</td></tr><tr><td>iniezione Manipolatore</td><td>Narishige</td><td>SM-15</td><td></td></tr><tr><td>Sodio pentobarbital</td><td>Kyoritsu Seiyaku</td><td>Somnopentyl</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Pfizer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lidocaina</td><td>AstraZeneca Iniezione di</td><td>xilocaina 1% con epinefrina</td><td></td></tr><tr><td>Drill</td><td>Toyo Associates</td><td>HP-200</td><td></td></tr><tr><td>Avitene emostatico microfibrillare</td><td>Davol Inc</td><td>1010090</td><td></td></tr><tr><td>Alonalfa</td><td>Daiichi-Sankyo</td><td>Alonalpha A</td><td></td></tr><tr><td>Seta chirurgica</td><td>Ethicon</td><td>K881H</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore</td><td>UVP</td><td>HB-1000 Ibridatore</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta di vetro</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>2-000-075</td><td></td></tr><tr><td>Estrattore di elettrodi</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Paraffina liquida, leggera</td><td>Nacalai tesque</td><td>26132-35</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina</td><td>Otsuka</td><td>1326</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Nacalai tesque</td><td>26126-54</td><td></td></tr><tr><td>Ago di tungsteno</td><td>Inter medical</td><td>&Phi; 0,1 * L200 mm</td><td></td></tr><tr><td>Vibratomo</td><td>Leica</td><td>VT1000S</td><td></td></tr><tr><td>50 mL tubo di plastica</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>&alfa;-tioglicerina</td><td>Nacalai tesque</td><td>33709-62</td><td></td></tr><tr><td>D(-) Fruttosio</td><td>Nacalai tesque</td><td>16315-55</td><td></td></tr><tr><td>BluTack</td><td>Bostik</td><td>CKBT-450000</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio a due fotoni</td><td>Nikon</td><td>A1RMP</td><td></td></tr><tr><td>Obiettivi a immersione in acqua a lunga distanza di lavoro</td><td>Nikon</td><td>CFI Apo LWD 25XW, NA 1.1, WD 2 mm</td><td></td></tr><tr><td>Obiettivi a immersione in acqua a lunga distanza</td><td>di lavoro Nikon</td><td>CFI LWD 16XW, NA 0.8, WD 3 mm</td><td></td></tr><tr><td>Stadio motorizzato</td><td>COMS</td><td>PT100C-50XY</td><td></td></tr><tr><td>Filtro</td><td>Semrock</td><td>FF01-492/SP-25</td><td></td></tr><tr><td>Filtro</td><td>Semrock</td><td>FF03-525/50-25</td><td></td></tr><tr><td>Filtro</td><td>Semrock</td><td>FF03-575/25-25</td><td></td></tr><tr><td>Filtro</td><td>Semrock</td><td>FF01-629/56</td><td></td></tr><tr><td>Filtro</td><td>Chroma</td><td>D605/55m</td><td></td></tr><tr><td>5 mL tubo di plastica</td><td>AS ONE</td><td>VIO-5B</td><td></td></tr><tr><td>2 mL tubo di plastica</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td></td><td></td>0030120094</tr><tr><td>Urea</td><td>Nacalai tesque</td><td>35905-35</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Nacalai tesque</td><td>35501-15</td><td></td></tr><tr><td>Glyserol</td><td>Sigma-aldrich</td><td>191612</td><td></td></tr><tr><td>D(-)-sorbitolo</td><td>Wako</td><td>191-14735</td><td></td></tr><tr><td>Metil-&beta;-ciclodestrina</td><td>Tokyo industria chimica</td><td>M1356</td><td></td></tr><tr><td>&gamma;- Cyclodextrin</td><td>Wako</td><td>037-10643</td><td></td></tr><tr><td>N-acetil-L-idrossiprolina</td><td>Attivi essenziali per la pelle</td><td>33996-33-7</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Nacalai tesque</td><td>13445-45</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>Sigma-aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20 (1,1 g/mL)</td><td>Nacalai tesque</td><td>35624-15</td><td></td></tr><tr><td>IgG anti-topo di capra (H+L) Secondario adsorbito incrociato Anticorpo, Alexa Fluor 555</td><td>Invitrogen</td><td>A21422</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo secondario adsorbito incrociato anti-coniglio di capra (H+L), Alexa Fluor 555</td><td>Invitrogen</td><td>A21428</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo secondario adsorbito incrociato anti-topo di capra (H+L), Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>A21235</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo secondario altamente adsorbito anti-topo di capra IgG (H+L), Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo secondario altamente adsorbito anti-coniglio d'asino IgG (H+L), Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A21206</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocale</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>Obiettivi a lunga distanza di lavoro a immersione in acqua</td><td>Olympus</td><td>XLUMPLFLN 20XW, NA 1.0, WD 2 mm</td><td></td></tr><tr><td>Anti-NeuN</td><td>Millipore</td><td>MAB377</td><td></td></tr><tr><td>Anti-NeuN</td><td>Millipore</td><td>ABN78</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CTIP2</td><td>Abcam</td><td>ab18465</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Statb2</td><td>Abcam</td><td>ab51502</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GAD67</td><td>Millipore</td><td>MAB5406</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GABA</td><td>Sigma</td><td>A2052</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Parvalbumina</td><td>Swant</td><td>235</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Parvalbumina</td><td>Frontier Institute</td><td>PV-Go-Af460</td><td></td></tr><tr><td>Anti-parvalbumina</td><td>Sigma</td><td>P3088</td><td></td></tr><tr><td>Anti-parvalbumina</td><td>Abcam</td><td>ab11427</td><td></td></tr><tr><td>Anti-somatostatina</td><td>Peninsula Laboratories</td><td>T-4103</td><td></td></tr><tr><td>Anti-c-Fos</td><td>CalbioChem</td><td>PC38</td><td></td></tr></tbody></table>

formazione immagine tridimensionale su larga scala di organizzazione cellulare nella neocorteccia mouse

Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex

La neocorteccia dei mammiferi è composta di molti tipi di neuroni eccitatori ed inibitori, ognuno con specifiche proprietà elettrofisiologiche e biochimiche, connessioni sinaptiche, e in vivo funzioni, ma loro basic funzionale e anatomica organizzazione dal cellulare alla scala di rete è capita male. Qui descriviamo un metodo per l'imaging tridimensionale dei neuroni fluorescente etichettati attraverso grandi aree del cervello per l'indagine l'organizzazione corticale. Specifici tipi di neuroni sono contrassegnati tramite l'iniezione di traccianti fluorescenti di un neurone retrogradi o l'espressione di proteine fluorescenti in topi transgenici. Campioni di blocco del cervello, per esempio, un emisfero, sono preparati dopo la fissazione, reso trasparenti con tessuto metodi di compensazione e sottoposti a immunolabeling fluorescente dei tipi cellulari specifici. Grandi aree vengono scansionati usando microscopi confocale o due-fotone dotati di grande lavoro distanza obiettivi e fasi motore. Questo metodo può risolvere l'organizzazione periodica dei moduli funzionali di tipo-specific microcolonna di cella nella neocorteccia del mouse. La procedura può essere utile per lo studio di architettura cellulare tridimensionale in aree cerebrali diverse e altri tessuti complessi.

Abbiamo etichettato neuroni di proiezione corticale di espressione di tdTomato in Tlx3-cretopi transgenici /Ai9 e visualizzati i neuroni di proiezione Sub-cerebrale iniettando il tracciante retrogrado CTB488 nel ponte. L'emisfero sinistro del cervello è stato sottoposto al metodo SeeDB e scansionati usando un microscopio a due fotoni dotato di un'immersione in acqua-obiettivo di distanza di funzionamento lunga (25 X, N.A. 1.1, distanza di lavoro 2 mm) e un tavolino motor...

Qui descriviamo una procedura per tessuto di compensazione, l'etichettatura fluorescente e su larga scala di formazione immagine del tessuto di cervello di topo che, quindi, permette la visualizzazione dell'organizzazione tridimensionale dei tipi delle cellule nella neocorteccia.

Formazione immagine tridimensionale su larga scala di organizzazione cellulare nella neocorteccia Mouse

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle neuroscienze come l'analisi della struttura e della funzione della neocorteccia. Il vantaggio principale di questa tecnica è che può rivelare la struttura tridimensionale su larga scala nel cervello. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla neocorteccia, può essere applicato anche ad altri sistemi nervosi come il midollo spinale.Per iniettare il tracciante nel ponte dei topi adulti, prelevare prima un microlitro di subunità B della tossina del colera marcata in fluorescenza in una siringa Hamilton calibro 26. Posizionare una pompa iniettore sulla siringa, quindi posizionare la siringa e la pompa sul portautensili di un manipolatore su uno strumento stereotassico. Inclinare il manipolatore di 12 gradi posteriormente rispetto all'asse verticale.Successivamente, posiziona il mouse sullo strumento stereotassico. Usando una lama di rasoio, rimuovi i peli per prevenire l'infezione. Quindi tagliare 10 millimetri del cuoio capelluto in modo che la bregma e la lambda siano visibili.Somministrare 0,1 millilitri di lidocaina all'1% utilizzando una pipetta. Impostare l'angolo della testa regolando la posizion

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Angolo retto microprismi inserita nella neocorteccia del mouse permette l'imaging con profonda di più strati corticali con un punto di vista tipicamente si trovano in fetta. Un millimetro microprismi offrono un ampio campo di vista (~ 900 micron) e risoluzione spaziale sufficiente per risolvere spine dendritiche. Dimostriamo strato di imaging neuronale V e neocorticale imaging vascolare con microprismi.

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Micron scala Risoluzione ottica Tomografia del cervello dei topi interi con confocale Luce Foglio Microscopia

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Corticale multistrato Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Imaging nei mouse con movimento libero con sonde a prisma e microscopia a fluorescenza miniaturizzata

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Formazione immagine tridimensionale su larga scala di organizzazione cellulare nella neocorteccia Mouse

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