Formazione immagine tridimensionale su larga scala di organizzazione cellulare nella neocorteccia Mouse
September 5th, 2018
Qui descriviamo una procedura per tessuto di compensazione, l'etichettatura fluorescente e su larga scala di formazione immagine del tessuto di cervello di topo che, quindi, permette la visualizzazione dell'organizzazione tridimensionale dei tipi delle cellule nella neocorteccia.
Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle neuroscienze come l'analisi della struttura e della funzione della neocorteccia. Il vantaggio principale di questa tecnica è che può rivelare la struttura tridimensionale su larga scala nel cervello. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla neocorteccia, può essere applicato anche ad altri sistemi nervosi come il midollo spinale.
Per iniettare il tracciante nel ponte dei topi adulti, prelevare prima un microlitro di subunità B della tossina del colera marcata in fluorescenza in una siringa Hamilton calibro 26. Posizionare una pompa iniettore sulla siringa, quindi posizionare la siringa e la pompa sul portautensili di un manipolatore su uno strumento stereotassico. Inclinare il manipolatore di 12 gradi posteriormente rispetto all'asse verticale.
Successivamente, posiziona il mouse sullo strumento stereotassico. Usando una lama di rasoio, rimuovi i peli per prevenire l'infezione. Quindi tagliare 10 millimetri del cuoio capelluto in modo che la bregma e la lambda siano visibili.
Somministrare 0,1 millilitri di lidocaina all'1% utilizzando una pipetta. Impostare l'angolo della testa regolando la posizione verticale del bocchino sullo strumento stereotassico in modo che la bregma e la lambda abbiano lo stesso livello Z. Successivamente, regolare la posizione del manipolatore facendolo scorrere sullo strumento stereotassico in modo che la punta della siringa sia vicina al bregma.
Registra la posizione del manipolatore. Ritrarre la siringa spostando il portautensile sul manipolatore. Successivamente spostare il manipolatore di 5,4 millimetri posteriormente e di 0,4 millimetri lateralmente.
Far avanzare la siringa in modo che la punta sia vicina al punto di ingresso sul cranio, quindi ritrarre la siringa e contrassegnare il punto di ingresso. Nella posizione contrassegnata, praticare un foro con un diametro di circa un millimetro. Inserire la punta della siringa attraverso il foro in modo che la profondità della punta sia di 6,9 millimetri superiore a quella misurata al bregma.
Quindi, iniettare un microlitro di traccianti utilizzando la pompa a 0,2 microlitri al minuto. Dopo l'iniezione, rimuovere la siringa dal cervello. Se necessario, coprire il cervello esposto con piccoli frammenti di emostatico microfibrillare e adesivo istantaneo.
Pulire il cervello esposto con soluzione fisiologica per prevenire l'infezione e suturare il cuoio capelluto. Quindi rimuovere il mouse dallo strumento stereotassico. Lasciare che il topo si riprenda dall'anestesia in un'incubatrice a 30 gradi Celsius per circa un'ora.
Non lasciare il topo incustodito fino a quando non ha riacquistato sufficiente coscienza per mantenere la decubito sternale. Restituisci il topo alla compagnia di altri animali dopo che si è completamente ripreso. Per raccogliere il tessuto cerebrale, tagliare il cuoio capelluto usando un paio di forbici per esporre il cranio.
Quindi, taglia la linea mediana del cranio esposto usando un paio di forbici. Quindi, rimuovi il cranio usando una pinza. Se è necessario segnare la posizione del bregma e del lambda, rimuovere prima un lato del cranio.
Quindi inserire sottili aghi di tungsteno nel cervello nelle posizioni del bregma e del lambda, quindi rimuovere il cranio rimanente. Successivamente, posizionare il campione di cervello sulla piattaforma del vibratomo. Tagliare le sezioni fino a 500 micrometri di spessore in PBS a temperatura ambiente.
In questa procedura, trasferire le fette in una provetta di plastica da cinque millilitri contenente quattro millilitri di soluzione di Scala S0. Quindi incubarli per 12 ore agitandoli delicatamente a 37 gradi Celsius. Dopo 12 ore rimuovere la soluzione dal tubo utilizzando una pipetta e aggiungere quattro millilitri di soluzione di Scala A2.
Incubare le fette per 36 ore agitando delicatamente a 37 gradi Celsius. Dopo 36 ore, rimuovere la soluzione dal tubo e aggiungere quattro millilitri di soluzione di Scale B4. Incubare le fette per 24 ore agitando delicatamente a 37 gradi Celsius.
Trascorse 24 ore, rimuovere la soluzione dal tubo e aggiungere quattro millilitri di soluzione di scala A2. Incubare le fette per 12 ore agitando delicatamente a 37 gradi Celsius. Dopo 12 ore, rimuovere la soluzione dal tubo e aggiungere quattro millilitri di PBS.
Incubare le fette per sei ore agitando delicatamente a temperatura ambiente. Successivamente, rimuovere con cura le fette in un tubo di plastica da due millilitri. Incubarli con un anticorpo primario in un millilitro di soluzione AB Scale per 48-72 ore a 37 gradi Celsius agitando delicatamente.
Successivamente, rimuovere con cura le fette in un tubo di plastica da cinque millilitri. Incubarli in quattro millilitri di soluzione AB Scale per due ore, due volte a temperatura ambiente agitando delicatamente. Successivamente, rimuovere con cura le fette in un tubo di plastica da due millilitri.
Incubare con un anticorpo secondario marcato in fluorescenza in un millilitro di soluzione AB Scale per 48 ore a 37 gradi Celsius agitando delicatamente. Rimuovere con cautela le fette in una provetta di plastica da cinque millilitri contenente quattro millilitri della soluzione anticorpale Scale e incubare le fette per sei ore agitando delicatamente a temperatura ambiente. Togliere la soluzione e aggiungere quattro millilitri della soluzione AB Scale e incubare le fette per due ore, due volte con una leggera agitazione a temperatura ambiente.
Successivamente, rimuovere la soluzione e aggiungere quattro millilitri di PFA al 4% e incubare le fette per un'ora agitando delicatamente a temperatura ambiente. Quindi, rimuovere la soluzione e aggiungere quattro millilitri di PBS e incubare le fette per un'ora agitando delicatamente a temperatura ambiente. Togliere la soluzione e aggiungere quattro millilitri della soluzione Scale S4 e incubare le fette per 12 ore agitando delicatamente a 37 gradi Celsius.
Successivamente, posizionare il distanziatore su un vetrino e posizionare le fette nel distanziatore e immergere le fette nella soluzione Scale S4. Sigillare il distanziatore con un vetro di copertura. Mettere un po' d'acqua sul vetro di copertura e visualizzare le fette utilizzando la microscopia confocale o a due fotoni con un obiettivo a lunga distanza a immersione in acqua.
In questo studio, i neuroni di proiezione corticale sono stati marcati in verde dall'espressione di tdTomato nei topi transgenici Tlx3-cre AI9 e i neuroni di proiezione subcerebrale in magenta sono stati visualizzati iniettando il tracciante retrogrado CTB488 nel ponte a sette settimane di età. Questa è la vista dall'alto per mostrare le posizioni approssimative delle aree corticali. Ecco le viste oblique della fluorescenza CTB488 che mostra i neuroni di proiezione subcerebrale e la fluorescenza tdTomato che mostra i neuroni di proiezione corticale e questa è l'immagine unita.
I corpi cellulari dei due tipi di cellule erano visibili in un'ampia gamma di aree cerebrali e le sezioni ottiche mostravano micro colonne periodiche. Questa immagine mostra i corpi cellulari e i dendriti apicali dei neuroni di proiezione subcerebrale che esprimono eGFP nella sezione ottica di un topo Crym-eGFP e questa immagine mostra le cellule che esprimono parvalbumina marcate in verde e i neuroni di proiezione subcerebrale marcati in magenta iniettando CTB488 nel ponte di un topo C57 Black 6 con il metodo della scala anticorpale. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come l'elaborazione di immagini 3D per rispondere a domande aggiuntive come la caratterizzazione quantitativa dell'organizzazione cerebrale.
Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia corticale per esplorare una nuova organizzazione modulare nel cervello del topo.
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Panoramica
Questo studio delinea un protocollo dettagliato per la chiarezza dei tessuti, l'etichettatura fluorescente e l'imaging su larga scala del tessuto cerebrale del topo. La metodologia permette ai ricercatori di visualizzare l'organizzazione tridimensionale dei tipi cellulari nella neocorteccia, offrendo preziose intuizioni sulla sua struttura e funzione.
Componenti principali dello studio
Area di scienza
- Neuroscienza
- Imaging dei tessuti
- Etichettatura fluorescente
Sfondo
- La struttura e la funzione della neocorteccia sono fondamentali nella neuroscienza.
- Comprendere l'organizzazione cellulare può aiutare a rispondere a domande chiave della ricerca.
- Questa tecnica può essere estesa ad altre regioni del sistema nervoso, come il midollo spinale.
Obiettivo dello studio
- Sviluppare una metodologia per una visualizzazione migliorata delle strutture cerebrali.
- Indagare l'organizzazione dei tipi cellulari all'interno della neocorteccia.
- Fornire un quadro applicabile a studi più ampi sul sistema nervoso.
Metodi utilizzati
- Imaging su larga scala utilizzando microscopia confocale o a due fotoni.
- Il modello utilizzato include topi adulti e regioni cerebrali specifiche come il ponte.
- Il protocollo dettaglia i passaggi procedurali per l'iniezione del tracciante e la preparazione dei tessuti.
- L'incubazione in soluzioni come Scale S0, A2, B4 e l'uso di anticorpi fluorescenti sono stati passaggi critici.
Risultati principali
- Il metodo rivela strutture tridimensionali su larga scala nel tessuto cerebrale del topo.
- È stata ottenuta un'etichettatura specifica dei neuroni di proiezione corticale e di altri tipi cellulari.
Conclusioni
- Questo studio dimostra un metodo robusto per visualizzare l'organizzazione neuronale.
- I risultati contribuiscono significativamente alla comprensione della struttura neocorticale e della sua funzione.
- La metodologia può essere adattata per diverse applicazioni nella ricerca neuroscientifica.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Understanding the three-dimensional cellular architecture of complex tissues like the neocortex supports target validation by revealing spatially resolved organization of neuronal subtypes. This mechanistic insight enables de-risking of therapeutic hypotheses through direct visualization of target engagement and network-level organization in disease-relevant systems. The method provides predictive confidence in preclinical models by linking anatomical organization to functional readouts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by mapping cell-type-specific microcolumn organization in the neocortex.
- Operational Value: Supports biological de-risking through direct visualization of neuronal subtypes and their spatial relationships.
- Predictive Value: Enhances target confidence by resolving periodic functional modules relevant to network-level drug effects.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream assay standardization by preserving three-dimensional tissue architecture.
- Operational Value: Enables reproducible imaging workflows through standardized tissue clearing and labeling protocols.
- Scalability: Facilitates platform reuse across brain regions and complex tissues via motorized stage scanning and long-working-distance objectives.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-stage organization insights to preclinical validation through disease-relevant system modeling.
- Mechanistic De-risking: Supports risk-adjusted advancement decisions by visualizing target engagement across distributed neural networks.
- Biomarker Alignment: Enables correlation of structural phenotypes with functional outputs for translational biomarker development.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification to preclinical validation by providing spatially resolved, quantitative anatomical data.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by resolving cell-type-specific organization in intact tissue.
- Screening: Delivers assay readiness through reproducible tissue preparation and quantitative fluorescence readouts.
- Analytics: Enables comparative analysis via three-dimensional imaging and cell counting across experimental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by preserving disease-relevant tissue architecture for longitudinal study.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable imaging platform applicable to multiple brain regions and complex tissues beyond the neocortex.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation through direct visualization of neuronal organization and microcolumn periodicity.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility via defined tissue clearing, labeling, and imaging workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in complex tissue systems.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization by linking anatomical phenotypes to functional outcomes in disease models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neuroscience, tissue preparation, and fluorescence microscopy.
- Depends on access to confocal or two-photon microscopes with large working distance objectives and motorized stages.
- Necessitates cross-team standardization for tissue clearing, antibody labeling, and imaging protocols.
- Involves adaptation considerations when applying the method to diverse model systems such as spinal cord or human tissue surrogates.
- Limited by tissue size and optical penetration depth, which may restrict imaging of whole-brain samples without sectioning.
