Protocollo per tridimensionale confocale morfometrica Analisi di astrociti

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di valutare la morfologia degli astrociti analizzando immagini tridimensionali di astrociti acquisite tramite microscopia confocale. Questo metodo può essere utilizzato per valutare i cambiamenti morfologici che possono comparire in vari tipi di cellule, sia in condizioni patologiche che come effetto di una strategia di intervento. Il vantaggio principale di questa tecnica è che molti parametri associati all'architettura cellulare possono essere studiati contemporaneamente.

La dott.ssa Mariam Bodel dimostrerà questa procedura Dopo la preparazione dei vetrini per la colorazione immunoistochimica de sezioni di parize immergendole in xilene due volte per 10 minuti. Incubare i vetrini per 10 minuti in ciascuno di etanolo al 99,8%, 95% e 70% per reidratare le sezioni dopo il lavaggio. I PBS incubano i vetrini in una diluizione da uno a 1500 di proteina acida fibrillare gliale o di una soluzione di anticorpi primari GFAP a quattro gradi Celsius durante la notte.

Dopo l'incubazione, lavare le sezioni in PB S3 volte per cinque minuti. Quindi incubare i vetrini con una soluzione di anticorpi secondari coniugati con fosfatasi alcalina da uno a 100 per un'ora a temperatura ambiente. Anche in questo caso, lavare la ciocca in PB S3 volte per cinque minuti, meno di 30 minuti prima dell'uso.

Aggiungere una goccia di soluzione di cromogeno rosso a tre millilitri di tampone di substrato. Incubare ogni vetrino in 100 microlitri di questa soluzione per 15-20 minuti al buio. Quindi lavare i vetrini in PB S3 volte per cinque minuti.

Infine, colorare i nuclei con DPI diluiti da uno a 500 in PBS. Applicare una o due gocce di Antifa medium sulla ciocca e sigillare immediatamente con un vetrino coprioggetto. Incubare i vetrini a quattro gradi Celsius per 24-48 ore prima della microscopia per garantire la sigillatura.

Per iniziare la microscopia confocale, posizionare un vetrino sul tavolino del microscopio e selezionare l'obiettivo 63x. Dopo aver aperto il software di acquisizione, fare clic su configurazione intelligente nella scheda di acquisizione e selezionare il piano di quattro corretto. Qui, dappy e Alexa, piano 5 55 sono utilizzati.

Quindi, fai clic sul miglior segnale, seguito da applica. Quindi fare clic su imposta esposizione per consentire al computer di determinare i parametri di esposizione ottimali Per ottimizzare l'immagine, aprire la finestra dei canali e impostare l'immagine in diretta. Regolare la messa a fuoco se necessario.

Quindi fare clic su uno per ottimizzare il foro stenopeico, regolare il guadagno per la migliore intensità. Infine, imposta il guadagno digitale tra due e tre. Dopo questa ottimizzazione, interrompere l'immagine dal vivo e aprire la finestra della modalità di acquisizione.

Regola le dimensioni del fotogramma facendo clic su X per Y e seleziona 10 24 per 10 24. Scegli anche una velocità bassa. Quindi, apri la scheda della media e seleziona un numero maggiore o uguale a quattro.

Quindi fare clic sul pulsante di aggancio e salvare l'immagine 2D acquisita. Per configurare l'imaging 3D, apri la scheda di configurazione intelligente e contrassegna l'elemento dello stack ZS, che causerà l'apertura della finestra dello stack Zs. Per impostare la prima e l'ultima posizione per lo Zack, di nuovo, fai clic su live e regola la messa a fuoco sulla posizione più alta dell'astrocita.

Fare clic su set per primo. Ora regola la messa a fuoco sulla posizione più bassa dell'astrocita e fai clic su imposta per ultimo, quindi interrompi la visualizzazione dal vivo. Quindi, scegli l'intervallo facendo clic su ottimale.

Per impostare il numero di fette qui, l'intervallo è di 1,01 micrometri. Infine, fai clic su Avvia, sperimenta e salva le immagini una volta completata la scansione. Inoltre, acquisisci un'immagine 2D utilizzando un obiettivo 10x o 20x.

Per le misurazioni dell'intensità della fluorescenza, selezionare lo strumento rettangolo o cerchio nella finestra dell'immagine ed evidenziare un'area di misurazione per quantificare il volume e la superficie del corpo e del territorio del nucleo del soma dell'astrocita. Trasferisci le immagini 3D a un programma software di analisi appropriato, come Velocity 6.1 nel software di analisi. Crea una nuova libreria e trascina tutte le immagini nella colonna grigia sinistra.

Seleziona un'immagine 3D e attiva uno dei canali acquisiti di interesse, come ad esempio dapi. Per le misurazioni nucleari, regolare manualmente la luminosità per ottimizzare il contrasto. Ora seleziona il menu degli strumenti.

Scegliere Crea volume e produrre una singola immagine 3D dalle immagini Zack. Apri il menu di modifica e fai clic su proprietà. Assicurarsi che le proprietà X, Y e Z siano visualizzate.

Successivamente, scegli lo strumento ROI a mano libera dalla barra degli strumenti. Utilizzando lo strumento selezionato, tracciare una linea attorno al nucleo etichettato DPI per misurare il volume e l'area superficiale del nucleo dell'astrocita. Anche in questo caso, utilizzando lo strumento ROI a mano libera, misura il volume e la superficie dell'intero astrocita tracciando una linea attorno al soma seguendo la superficie di tutti i rami.

Fare clic sul menu delle misure nella parte superiore della finestra dell'immagine, trascinare gli oggetti di ricerca nella parte superiore della finestra e assegnare un nome descrittivo alla popolazione uno, selezionare il colore associato e fare clic su misura, che aprirà una nuova finestra. In questa nuova finestra. Selezionate il volume o l'area della superficie come parametro e fate clic su OK.

Per salvare i dati, fare clic sul menu di misurazione e selezionare la voce di misurazione. Selezionare un nuovo elemento di misura richiamato dalla finestra. Immettere un nome file per i dati e fare clic su OK.

Infine, esportare i dati di misura in un pacchetto software appropriato per eseguire analisi statistiche e generare grafici di dati. Qui, i ricercatori hanno confrontato gli astrociti nel tessuto cerebrale fisso di ratti trattati con amiloide-beta one 40 o con amiloide-beta one 40 e Ian. L'iniezione di trattamento con la proteina amiloide ha portato ad astrociti con rami più spessi e più lunghi.

Questi astrociti provenienti da animali trattati con Ian mostravano una forma stellata con rami corti e sottili. I ratti trattati con Ian hanno anche dimostrato una ridotta fluorescenza positiva per la GFAP degli astrociti nelle fette di cervello. L'analisi morfometrica di specifici volumi di astrociti ha rivelato che il volume del nucleo dell'astrocita, dell'intero corpo cellulare dell'astrocita e del territorio degli astrociti è diminuito con il trattamento con Ian rispetto al solo trattamento con amiloide.

Una volta padroneggiata questa immagine, la tecnica di analisi può essere completata in pochi minuti per cella se viene eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante contrassegnare la struttura con alta precisione. È consigliabile esercitarsi a contrassegnare manualmente la struttura di interesse prima di iniziare l'esperimento dopo il suo sviluppo.

Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia cellulare, dell'istologia e della patologia per esplorare la struttura di una cellula in un contesto sano o di malattia. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come misurare 12 diversi parametri per una singola cella utilizzando immagini 3D.