Protocollo per tridimensionale confocale morfometrica Analisi di astrociti
11 dicembre 2015
Gli astrociti nel SNC cambiano le loro proprietà funzionali e strutturali in risposta a stimoli dannosi. Questo rapporto presenta un protocollo per la valutazione della morfologia tridimensionale degli astrociti in condizioni di malattia o dopo interventi terapeutici.
L'obiettivo generale di questo procedimento è valutare la morfologia degli astrociti analizzando immagini tridimensionali di astrociti ottenute mediante microscopia confocale. Questo metodo può essere utilizzato per valutare i cambiamenti morfologici che possono manifestarsi in diversi tipi cellulari, sia in condizioni patologiche sia come effetto di una strategia di intervento. Il vantaggio principale di questa tecnica è che molti parametri associati all'architettura cellulare possono essere studiati contemporaneamente.
La dottoressa Mariam Bodel illustrerà questa procedura. Dopo aver preparato i vetrini per la colorazione immunohistochemica, deparinizzare le sezioni immergendole in xilolo due volte per 10 minuti. Incubare i vetrini per 10 minuti in ciascuna delle seguenti soluzioni di etanolo: 99,8%, 95% e 70%, per riidratare le sezioni dopo il lavaggio. Incubare i vetrini in una soluzione di anticorpo primario contro la proteina acida fibrillare della glia (GFAP) diluita 1:1500 in PBS a quattro gradi Celsius durante la notte.
Al termine dell'incubazione, lavare le sezioni in PBS per 3 volte di cinque minuti ciascuna. Successivamente, incubare i vetrini con una soluzione di anticorpo secondario coniugato con fosfatasi alcalina in rapporto 1:100 per un'ora a temperatura ambiente. Lavare nuovamente le sezioni in PBS per 3 volte di cinque minuti ciascuna, meno di 30 minuti prima dell'uso.
Aggiungere una goccia di soluzione cromogenica rossa a tre millilitri di tampone substrato. Incubare ogni vetrino in 100 microlitri di questa soluzione per 15-20 minuti al buio. Quindi lavare i vetrini in PBS 3 volte per cinque minuti.
Infine, colorare i nuclei con DPI diluito 1:500 in PBS. Applicare una o due gocce di mezzo Antifa sulla sezione e sigillare immediatamente con un coverslip. Incubare i vetrini a quattro gradi Celsius per 24-48 ore prima della microscopia per garantire una corretta sigillatura.
Per iniziare la microscopia confocale, posizionare un vetrino sullo stage del microscopio e selezionare l'obiettivo 63x. Dopo aver aperto il software di acquisizione, fare clic su "smart setup" nella scheda di acquisizione e selezionare il corretto piano di illuminazione. In questo caso, vengono utilizzati DAPI e Alexa Fluor 555.
Successivamente, fare clic su segnale migliore, quindi su applica. Quindi fare clic su impostare l'esposizione per consentire al computer di determinare i parametri di esposizione ottimali. Per ottimizzare l'immagine, aprire la finestra dei canali e passare l'immagine in modalità live. Regolare la messa a fuoco se necessario.
Quindi fare clic su uno au per ottimizzare il diaframma, regolare il guadagno per ottenere l'intensità migliore. Infine, impostare il guadagno digitale tra due e tre. Al termine di questa ottimizzazione, arrestare l'immagine in tempo reale e aprire la finestra della modalità di acquisizione.
Regolare le dimensioni del fotogramma facendo clic su X per Y e selezionare 10 24 per 10 24. Scegliere anche una velocità lenta. Successivamente, aprire la scheda della media e selezionare un numero maggiore o uguale a quattro.
Quindi fare clic sul pulsante di acquisizione e salvare l'immagine 2D catturata. Per configurare l'acquisizione 3D, aprire la scheda di configurazione rapida e selezionare la voce ZS stack, il che farà aprire la finestra Zs stack. Per impostare la prima e l'ultima posizione dello Zack, fare nuovamente clic su live e regolare il fuoco sulla posizione più alta dell'astrocita.
Fare clic su "imposta primo". Ora regolare il fuoco sulla posizione più bassa dell'astrocita e fare clic su "imposta ultimo", quindi interrompere la visualizzazione in tempo reale. Successivamente, scegliere l'intervallo facendo clic su "ottimale".
Per impostare il numero di sezioni qui, l'intervallo è di 1,01 micrometri. Infine, fare clic su start, esperimento, e salvare le immagini una volta completata la scansione. Inoltre, acquisire un'immagine 2D utilizzando un obiettivo 10x o 20x.
Per le misurazioni dell'intensità di fluorescenza, selezionare lo strumento rettangolo o cerchio nella finestra dell'immagine e evidenziare un'area da misurare per quantificare il volume e la superficie del corpo cellulare del soma nucleare dell'astrocita e del suo territorio. Trasferire le immagini 3D a un opportuno programma di analisi, come Velocity 6.1 nel software di analisi. Creare una nuova libreria e trascinare tutte le immagini nella colonna grigia a sinistra.
Selezionare un'immagine 3D e attivare uno dei canali acquisiti di interesse, ad esempio dapi. Per le misurazioni nucleari, regolare manualmente la luminosità per ottimizzare il contrasto. A questo punto selezionare il menu strumenti.
Scegliere l'opzione per creare un volume e produrre una singola immagine 3D dalle immagini Zack. Aprire il menu Modifica e fare clic su Proprietà. Assicurarsi che le proprietà X, Y e Z siano visualizzate.
In seguito, selezionare lo strumento ROI a mano libera dalla barra degli strumenti. Utilizzando lo strumento selezionato, tracciare una linea attorno al nucleo etichettato DPI per misurare il volume e l'area superficiale del nucleo dell'astrocita. Ancora una volta, utilizzando lo strumento ROI a mano libera, misurare il volume e l'area superficiale dell'intero astrocita tracciando una linea attorno al soma seguendo la superficie di tutti i rami.
Fare clic sul menu delle misurazioni nella parte superiore della finestra dell'immagine, trascinare Trova oggetti nella parte superiore della finestra e assegnare un nome descrittivo alla popolazione uno, selezionare il colore associato e fare clic su Misura, che aprirà una nuova finestra. In questa nuova finestra, scegliere volume o area superficiale come parametro e fare clic su OK.
Per salvare i dati, fare clic sul menu di misurazione e selezionare "crea elemento di misurazione". Selezionare un nuovo elemento di misurazione dalla finestra. Inserire un nome file per i dati e fare clic su OK.
Infine, esportare i dati delle misurazioni in un pacchetto software appropriato per eseguire l'analisi statistica e generare grafici dei dati. In questo caso, i ricercatori hanno confrontato gli astrociti in tessuto cerebrale fissato proveniente da ratti trattati con amiloide beta uno 40 o con amiloide beta uno 40 e Ian. L'iniezione del trattamento con la proteina amiloide ha determinato astrociti con rami più spessi e più lunghi.
Questi astrociti provenienti da animali trattati con Ian hanno mostrato una forma stellata con ramificazioni corte e sottili. I ratti trattati con Ian hanno inoltre dimostrato una ridotta fluorescenza positiva per GFAP negli astrociti nelle sezioni cerebrali. L'analisi morfometrica di volumi specifici di astrociti ha rivelato che il volume del nucleo cellulare dell'astrocita, del corpo cellulare dell'astrocita e del territorio astrocitario era diminuito con il trattamento con Ian rispetto al trattamento con amiloide da solo.
Una volta padroneggiata questa tecnica di analisi dell'immagine, l'analisi può essere completata in pochi minuti per cellula, se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è fondamentale marcare la struttura con elevata precisione. È consigliabile esercitarsi a marcare manualmente la struttura di interesse prima di iniziare l'esperimento, dopo il suo sviluppo.
Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia cellulare, dell'istologia e della patologia per esplorare la struttura di una cellula in condizioni di salute o di malattia. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come misurare 12 parametri diversi per una singola cellula utilizzando immagini tridimensionali.
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Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo per la valutazione della morfologia degli astrociti in tre dimensioni mediante microscopia confocale. Il metodo valuta i cambiamenti morfologici negli astrociti in condizioni patologiche o a seguito di interventi terapeutici.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia cellulare
- Patologia
Sfondo
- Gli astrociti nel SNC mostrano modifiche in risposta a stimoli dannosi.
- Comprendere la morfologia degli astrociti è fondamentale per lo studio di varie condizioni neurologiche.
- Questo protocollo consente l'analisi simultanea di più parametri dell'architettura cellulare.
- La microscopia confocale fornisce immagini tridimensionali ad alta risoluzione.
Scopo dello studio
- Valutare la morfologia degli astrociti in condizioni patologiche.
- Valutare gli effetti di interventi terapeutici sulla struttura degli astrociti.
- Sviluppare un protocollo affidabile per l'analisi morfologica.
Metodi Utilizzati
- Preparazione di vetrini per la colorazione immunoistochimica.
- Deparaffinizzazione dei tagli mediante xilolo.
- Riidratazione dei tagli attraverso soluzioni di etanolo a concentrazione decrescente.
- Incubazione con anticorpo primario anti-GFAP per l'identificazione degli astrociti.
Risultati principali
- Dimostrazione di cambiamenti morfologici negli astrociti.
- Identificazione di alterazioni strutturali in risposta a interventi.
- Convalida del protocollo per studi futuri.
Conclusioni
- Il protocollo valuta efficacemente la morfologia degli astrociti.
- I risultati contribuiscono alla comprensione del ruolo degli astrociti nella patologia del sistema nervoso centrale.
- Applicazioni future potrebbero migliorare le strategie terapeutiche per le malattie neurologiche.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La valutazione quantitativa della morfologia degli astrociti consente una riduzione del rischio meccanicistica nella validazione di bersagli neurodegenerativi, collegando modifiche strutturali a interventi terapeutici. Questo approccio morfometrico confocale 3D supporta la fiducia predittiva nelle fasi iniziali della scoperta fornendo letture multiparametriche che riflettono risposte gliali specifiche per pathway. Il metodo migliora la continuità traslazionale dai modelli in vitro o in vivo alla presa di decisioni precliniche attraverso flussi di lavoro di imaging standardizzati e riproducibili.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Verifica l'ipotesi terapeutica quantificando il rimodellamento strutturale degli astrociti in risposta alla beta-amiloide e alle strategie di intervento.
- Valore operativo: Permette la validazione funzionale del bersaglio mediante analisi multiparametrica della reattività gliale, riducendo l'ambiguità meccanicistica nell'interazione con il bersaglio nel sistema nervoso centrale.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Prepara sistemi biologici validati per flussi di lavoro successivi, stabilendo fenotipi morfologici di base e indotti da interventi.
- Valore operativo: Affronta la standardizzazione e la riproducibilità dei saggi attraverso uscite morfometriche quantitative a 12 parametri adatte all'adattamento per schermature ad alto contenuto.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Analizza la rilevanza per le malattie modellando la reattività astrocitaria in tessuto cerebrale di ratto esposto ad amiloide, in linea con i percorsi traslazionali di biomarcatori nella neurodegenerazione.
- Valore operativo: Descrive la continuità dallo stadio di scoperta fino alla validazione preclinica, consentendo il monitoraggio longitudinale delle modifiche strutturali degli astrociti in diverse condizioni di trattamento.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nel percorso di scoperta, dal test delle ipotesi all'identificazione dei composti promettenti, fornendo dati quantitativi sulla morfologia gliale che guidano la selezione delle target e la riduzione dei rischi associati ai percorsi molecolari.
- Biologia della scoperta: Spiega in che modo il metodo supporta la verifica di ipotesi, la chiarificazione di percorsi biologici o la riduzione del rischio biologico mediante fenotipizzazione strutturale degli astrociti in contesti patologici e di intervento.
- Screening: Descrive la prontezza del saggio, la riproducibilità o le uscite quantitative, quando supportate dall'articolo tramite imaging 3D standardizzato e analisi multiparametrica.
- Analisi: Evidenzia misurazioni, letture o uscite statistiche che aiutano i gruppi a confrontare diverse condizioni, inclusi volume, area superficiale, lunghezza e numero dei rami, intensità di fluorescenza e densità.
- Ricerca traslazionale: Collega il metodo a continuità precliniche o allineamento con biomarcatori solo quando sostenuto dalla fonte attraverso modellizzazione della reattività degli astrociti rilevante per la malattia.
- Riutilizzo aziendale: Presenta il metodo come una capacità riutilizzabile piuttosto che una tecnica monouso, grazie a protocolli standardizzati di imaging e analisi applicabili a diversi tipi cellulari e condizioni.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva, validazione dell'obiettivo, riduzione dell'ambiguità meccanicistica.
- Valore operativo: Standardizzazione, riproducibilità e scalabilità.
- Valore strategico: Migliori decisioni di avanzamento o interruzione, efficienza del capitale e riduzione del rischio biologico in fase avanzata.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione e decisioni di avanzamento corretti per il rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Esperienza scientifica richiesta in microscopia confocale, colorazione immunohistochimica e analisi di immagini 3D.
- Requisiti di strumentazione e infrastruttura analitica, inclusi microscopio confocale con capacità di acquisizione in Z-stack e software per l'analisi 3D come Volocity.
- Requisiti di standardizzazione tra gruppi di lavoro per protocolli di colorazione, parametri di acquisizione e coerenza nelle misurazioni morfometriche.
- Considerazioni sull'adattamento tra diversi sistemi modello, inclusi preparati di astrociti in vivo e in vitro provenienti da diverse specie.
- Limitazioni pratiche supportate dalla letteratura, tra cui la necessità di una marcatura manuale precisa delle strutture e l'ottimizzazione delle impostazioni di acquisizione per il rapporto segnale-rumore.
