Name: Quantificazione dei costi di fitness nelle zanzare transgeniche Aedes aegypti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-15T14:35:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: Impara a quantificare i costi di fitness nelle zanzare transgeniche Aedes aegypti attraverso parametri riproduttivi e analisi morfometriche. Questo protocollo fornisce tecniche essenziali per valutare l'impatto ecologico delle modifiche genetiche.

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Gli autori desiderano ringraziare i dottori Bill Reid e Alexander Franz dell'Università del Missouri per il loro sostegno a questo protocollo. Gli autori desiderano anche ringraziare il Dr. Benjamin Krajacich del NIH/NIAID per il suo supporto con l'analisi R. Questo studio è stato finanziato dal NIH, sovvenzione numero R01 AI130085 (KEO) e dalla NIH/NIAID Division of Intramural Research Program AI001246 (EC).

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Gli studi di fitness di Ae. aegypti sono spesso eseguiti in laboratorio per valutare i costi di fitness associati al carico transgenico (ad esempio, elementi gene drive) o knock out genici, come discusso in questo manoscritto; tuttavia, questi studi possono essere eseguiti per una varietà di scopi, qualsiasi che miri a valutare la salute di un gruppo di Ae. aegypti, come30,31 infetto da Wolbachia,32,33<s...

La sopravvivenza del più adatto è l'idea darwiniana che gli individui che ospitano i geni più adattati al loro ambiente trasmetteranno quei genialle generazioni successive. Ciò significa che è la fitness che determina se i loro geni sopravviveranno. Questo concetto di oltre 150 anni fa è forse il fattore determinante più significativo per l'ingegnerizzazione di un gene drive di successo nelle zanzare transgeniche. I gene drive, o il modello di ereditarietà super-mendeliana di un elemento genetico egoista che gli permette di diffondersi attraverso le popolazioni2, sono in fase di studio per la gestione geneticadei parassiti 3. Nel contesto del controllo dei vettori, questa strategia mira a sostituire gli artropodi wild-type (WT) con quelli resistenti ai patogeni (modificazione della popolazione) o a eliminarli del tutto (soppressione della popolazione)4. Tuttavia, le zanzare transgeniche spesso mostrano costi di fitness (chiamati anche carico genetico) rispetto alle loro controparti WT, il che significa che il transgene andrà perso nelle popolazioni che possono superarle. L'accoppiamento dei transgeni con un sistema di gene drive è quindi necessario per compensare eventuali costi di fitness e spingere il transgene attraverso la popolazione a livelli maggiori di quelli attesi dalla tipica eredità mendeliana4.
Studi di laboratorio su specie di zanzare vettori hanno dimostrato che i transgeni spesso mostrano costi di fitness 5,6,7. Ad esempio, Irvin et al. ha misurato vari parametri di vita in Aedes (Ae.) aegypti ingegnerizzati per esprimere la proteina fluorescente verde potenziata (eGFP) o i geni della trasposizione sotto Drosophila actin 5C o promotori sintetici 3XP3 e li ha confrontati con il ceppo Orlando wild-type (lo stesso background genetico da cui sono derivati)5. In particolare, hanno scoperto che tutti i ceppi transgenici avevano una capacità riproduttiva significativamente ridotta5. A seconda del transgene, alcune zanzare Anopheles (An.) che esprimono transgeni che inibiscono lo sviluppo del parassita Plasmodium hanno anche mostrato costi di fitness6. In particolare, An. stephensi che esprime una fosfolipasi veleno d'api (PLA2) sotto promotori costitutivi o inducibili dal pasto di sangue ha deposto un numero significativamente inferiore di uova rispetto ai controlli6. Questi autori hanno anche scoperto che gli Anopheles transgenici che esprimono un transgene diverso, un tetramero dodecapeptide SM1, non mostravano costi di fitness, portandoli a concludere che i costi di fitness conferiti dal transgene sono dipendenti, almeno probabilmente in parte, dall'effetto della proteina transgenica prodotta6. In effetti, i costi di fitness possono essere attribuiti a prodotti transgenici, effetti posizionali, effetti off-target, mutagenesi inserzionale o effetti di consanguineità in ceppi allevati in laboratorio7. I gene drive devono quindi essere sufficientemente robusti da compensare questi costi di fitness indotti dai transgeni, evitando al contempo lo sviluppo di inserzioni e delezioni (indel) che bloccano il drive stesso.
I costi dello sviluppo o dell'idoneità riproduttiva possono essere misurati in studi di laboratorio o in gabbia7, con l'avvertenza che anche fattori sconosciuti nel campo possono avere un impatto. Ciononostante, gli studi controllati di fitness sono un primo passo importante quando si pianificano o si valutano i rilasci di zanzare geneticamente modificate, come un programma di gene drive, per determinare se la linea transgenica persisterà nelle generazioni successive. Ad esempio, Hammond et al. valutato Un gene drive basato su CRISPR/Cas9 di gambiae destinato a interrompere i geni necessari per la fertilità femminile8. Attraverso studi in gabbia mantenuti per almeno 25 generazioni, gli autori hanno scoperto che le zanzare incorrevano in alleli resistenti al gene drive che bloccavano la scissione mirata a CRISPR e ripristinavanola fertilità femminile. I loro sforzi di modellazione hanno suggerito che la fertilità nelle femmine eterozigoti per il gene drive ha avuto gli impatti più drammatici sulla fissazione del gene drive in condizioni simulate8. Sulla stessa linea, Ae. aegypti (Higgs' White Eye strain, HWE) ingegnerizzato per esprimere cassette di gene drive autonomo sotto diversi promotori o in diversi loci intergenici ha mostrato diversi tassi di fissazione del gene drive nelle popolazioni simulate9. Utilizzando il modello MGDrivE10, combinato con i tassi misurati di formazione di indel, gli effetti materni e i dati dei parametri di vita raccolti in laboratorio, gli autori hanno scoperto che la fitness delle zanzare ha influenzato maggiormente la persistenza del gene drive in condizioni simulate9. I costi di fitness che hanno maggiori probabilità di compromettere l'efficienza del gene drive sono attribuibili alla (sovra)espressione somatica di Cas9 o al gene che è bersaglio, in particolare negli eterozigoti, piuttosto che al drive intrinseco stesso 11,12,13,14,15,16,17.
Data la sua importanza, l'idoneità è un fattore importante per la capacità di una linea transgenica di persistere nelle generazioni successive e può essere utilizzata come indicatore di eventuali effetti fisiologici associati a un transgene. Ad esempio, gli effetti fuori bersaglio possono essere associati ai costi di fitness. In questo caso, si consiglia di reincrociare una linea transgenica per diverse generazioni. Inoltre, l'attraversamento della linea transgenica con una che riflette una popolazione di campo può anche essere necessario per studiare quanto bene la popolazione transgenica possa competere nel mondo reale. Per quantificare i costi di fitness in modo che possano essere confrontabili, questo manoscritto fornisce semplici protocolli per misurare i tratti comuni della storia di vita nelle zanzare Ae. aegypti, con particolare enfasi sui costi di fitness associati ai transgeni, in modo che tali studi possano essere riprodotti più facilmente. I protocolli includono fecondità, fertilità, rapporto tra i sessi, vitalità, tempi di sviluppo, contributo maschile e longevità adulta. Anche la misurazione della lunghezza e dell'area delle ali è stata scelta come misura di fitness in quanto è correlata alla lunghezza del torace18,19 e alle misure delle dimensioni del corpo, che è direttamente collegata alle dimensioni, alla fecondità e all'immunità del pasto di sangue20,21. Sebbene esistano molti modi per valutare l'idoneità, questi parametri sono stati scelti perché riflettono il successo riproduttivo, sono semplici da misurare e sono comunemente riportati in letteratura.

<table><tbody><tr><td>1 oz. tazze da soufflé in plastica traslucida</td><td>WebstaurantStore</td><td>301100PC</td><td></td></tr><tr><td>2 oz. tazze da soufflé in polistirene traslucido</td><td>WebstaurantStore</td><td>760P200N</td><td></td></tr><tr><td>3 mL pipettatori in plastica&nbsp;</td><td>Cornin</td><td>357524</td><td></td></tr><tr><td>provette coniche da 50 ml</td><td>Qualsiasi marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>64 oz. bicchiere per alimenti in carta politenata bianca da 64 once</td><td>WebstaurantStore</td><td>999SOUP64WB</td><td>per chiusura zanzare</td></tr><tr><td>Lente da 65 mm&nbsp;</td><td>Canon</td><td>MP-E 65mm f/2.8 1-5x Macro Photo</td><td>Canon Macro Photo MP-E 65mm, 7D-65mm-1X; zoom=1, 200, 6.3, ISO=100; per fotografare ali o carta per uova, anche se altre fotocamere sono probabilmente sufficienti</td></tr><tr><td> zanzare</td><td>BEI</td><td>ceppi multipli come uova sono disponibili</td><td></td></tr><tr><td>Alimentatori a membrana artificiali</td><td>https://lillieglassblowers.com/</td> <td>Alimentatore a membrana Meduim, su misura, 33mm</td><td>Chemglass offre anche, ma le dimensioni sono sbagliate per noi. I nostri sono circa 3 cm?</td></tr><tr><td>ATP</td><td>MP Biomedical</td><td>ICN15026605</td><td>Qualsiasi ATP di buona qualità, aliquote sterili con filtro da 10 mM a -20</td></tr><tr><td>Autoclave</td><td></td><td></td><td>per sterilizzare l'acqua per la schiusa</td></tr><tr><td>Fotocamera Canon EOS 7D</td><td>Canon</td><td>3814B004</td><td>per fotografare ali o carte per uova, anche se altre fotocamere sono probabilmente sufficienti</td></tr><tr><td>sangue di pecora defibrinato.</td><td>Colorado Serum Co.</td><td>60 ml, ogni 2 settimane</td><td>https://colorado-serum-com.3dcartstores.com/sheep-defibrinated</td></tr><tr><td>Illuminatore per microscopio a doppio collo d'oca</td><td>Dolan Jenner Fiber-Lite 180</td><td>181-1 Sistema</td><td></td></tr><tr><td>Pinza per etanolo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Dumont</td><td>5SF</td><td></td></tr><tr><td>Garza</td><td></td><td>omnisorb ii</td><td>4" spugne non tessute vetrino</td></tr><tr><td>per microscopio</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-2</td><td></td></tr><tr><td>Piastre di Petri in vetro, 100 & 15 mm</td><td>VWR</td><td>75845-546</td><td>per anestetizzare/manipolare le zanzare sul ghiaccio</td></tr><tr><td>Budello di maiale</td><td>Qualsiasi gastronomia</td><td></td><td>che acquistiamo all'ingrosso, divisa, laviamo e conserviamo in piccole aliquote di ~4X12" a -20 in 50 ml</td></tr><tr><td>conico Ice</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bucket</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666A</td><td></td></tr><tr><td>Leica GZ4 StereoZoom microscopio</td><td></td><td></td><td>per lo screening delle zanzare transgeniche (se applicabile)</td></tr><tr><td>Pennello</td><td>AIT pennello sintetico&nbsp;</td><td>taglia 10-0</td><td>per manipolare larve / pupe (Amazon)</td></tr><tr><td>Collant</td><td>Walmart</td><td>L'eggs Everyday</td><td>&nbsp; Calze da donna in nylon Plus Gambaletti con punta trasparente, 16 paia (più si adatta alla scatola)</td></tr><tr><td>Matite</td><td>Contenitori</td> in plastica di qualsiasi marca <td></td><td></td></tr><tr><td>per la conservazione a 2 gradi di cartoni</td><td>Walmart</td><td></td><td>Sterilite 58 Qt Storage Box Base trasparente Coperchio bianco Set di 8</td></tr><tr><td>contenitori in plastica per larve in crescita</td><td>Walmart</td><td></td><td>Sterilite 28 Qt. Scatola di immagazzinaggio in plastica, Bianco, Set di 10 contenitori in</td></tr><tr><td>plastica per larve da cova</td><td>Walmart</td><td></td><td>Sterilite 6 Qt. Scatola di immagazzinaggio in plastica, Contenitori per</td></tr><tr><td>gastronomia trasparenti in polipropilene bianco&nbsp;</td><td>Negozio Webstaurant</td><td>&nbsp; 127DM12BULK</td><td>12 oz, o 16 oz se necessario per elastici più grandi (127RD16BULK)</td></tr> <tr><td></td><td>Office Max</td><td>&nbsp;#100736/#909606 /#3777415</td><td>12", #64 e #10</td></tr><tr><td>Tappo in gomma</td><td>VWR</td><td>217-0515</td><td>per l'isolamento delle zanzare</td></tr><tr><td>Fonte di zucchero, come zollette di zucchero o uvetta</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tetramin cibo in scaglie Tetramin</td><td></td><td>16106</td><td></td></tr><tr><td>tpsDig</td><td>Stony Brook Morphometrics</td><td></td><td>Un software gratuito di elaborazione delle immagini morfometriche distribuito online disponibile all'indirizzo https://www.sbmorphometrics.org/</td></tr> <tr><td>tpsUtil</td><td>Stony Brook Morphometrics</td><td></td><td>Un software gratuito di elaborazione delle immagini morfometriche distribuito online disponibile all'indirizzo https://www.sbmorphometrics.org/</td></tr> <tr><td>Tessuto di organza bianco 8" & volte; 8"</td><td>FabricWholesale.com&nbsp;</td><td>4491676</td><td>Tessuto in organza Joann Casa Collection di Casa Collection&nbsp;</td></tr><tr><td>Carta da filtro qualitativa Whitman grado 1</td><td>Whitman</td><td>1001-824</td><td>per carte all'uovo. Il colore bianco rende più facile vedere le uova nere.</td></tr></tbody></table>

quantificazione dei costi di fitness nelle zanzare transgeniche aedes aegypti

Quantifying Fitness Costs in Transgenic Aedes aegypti Mosquitoes

Le zanzare transgeniche spesso mostrano costi di fitness rispetto alle loro controparti di tipo selvatico. A questo proposito, gli studi sui costi di fitness prevedono la raccolta di dati sui parametri di vita da zanzare geneticamente modificate e il loro confronto con zanzare prive di transgeni dello stesso background genetico. Questo manoscritto illustra come misurare i tratti comuni della storia della vita della zanzara Aedes aegypti, tra cui la fecondità, le dimensioni e la forma delle ali, la fertilità, il rapporto tra i sessi, la vitalità, i tempi di sviluppo, il contributo maschile e la longevità adulta. Questi parametri sono stati scelti perché riflettono il successo riproduttivo, sono semplici da misurare e sono comunemente riportati in letteratura. I risultati rappresentativi quantificano i costi di fitness associati a un knock-out genico o a un singolo inserimento di un elemento gene drive. Standardizzare il modo in cui vengono raccolti i dati sui parametri di vita è importante perché tali dati possono essere utilizzati per confrontare la salute delle zanzare transgeniche generate negli studi o per modellare il tasso di fissazione transgenica in una popolazione di zanzare di tipo selvatico simulata. Sebbene questo protocollo sia specifico per l'Aedes aegypti transgenica, il protocollo può essere utilizzato anche per altre specie di zanzare o altre condizioni di trattamento sperimentale, con l'avvertenza che alcuni contesti biologici possono richiedere adattamenti speciali.

Seguendo il protocollo di cui sopra, è stata valutata l'idoneità di due linee di zanzara: (1) knock out mediato da CRISPR/Cas9 della proteina salivare Ae. aegypti D7L1 (AAEL006424) e (2) linee di Ae. aegypti che esprimono gene drive autonomi mediati da CRISPR/Cas99. Nel primo caso, è stata stabilita una linea di knock-out omozigote D7L1 sfruttando la via di giunzione delle estremità non omologhe (NHEJ) per generare l'interruzione dopo la microiniezione di embrioni con sgRNA speci...

Il presente protocollo descrive come misurare i dati dei parametri di vita comuni nelle zanzare Aedes aegypti , tra cui fecondità, dimensioni delle ali, fertilità, rapporto tra i sessi, vitalità, tempi di sviluppo, contributo maschile e longevità adulta. Queste misurazioni possono essere utilizzate per valutare l'idoneità delle zanzare transgeniche.

Quantificazione dei costi di fitness nelle zanzare transgeniche Aedes aegypti

Transgenic mosquitoes often display fitness costs compared to their wild-type counterparts. In this regard, fitness cost studies involve collecting life ...

Questo protocollo dimostra misurazioni standard, che riflettono la fitness, nelle zanzare aedes aegypti, questi parametri di fitness sono stati scelti perché riflettono il successo riproduttivo, sono semplici da misurare e sono comunemente riportati in letteratura. Per iniziare, metti le cartine per uova in acqua sterile durante la notte nell'insectory per far schiudere le zanzare transgeniche e di tipo selvatico. Lasciare che le larve si nutrano ad libitum fornendo diverse gocce di liquame di cibo per pesci macinati.Per assicurarsi che gli adulti siano vergini, separare le pupe in base al sesso una volta emerse, spostare la pupa su un vetrino da microscopio e rimuovere l'acqua in eccesso con il tessuto per immobilizzare la pupa. Sotto uno stereoscopio con un ingrandimento da due a quattro volte, usando un pennello a punta fine, posiziona la pupa a faccia in su. Quindi analizza visivamente la coda per le differenze nella forma del lobo genitale.Metti le pupe maschili e femminili in tazze d'acqua separate in un adeguato contenimento. Per incrociare uno o due maschi di gene drive selvatico o transgenico in massa con femmine vergini di tipo selvatico, aggiungere zanzare anestetizzate

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Impara a quantificare i costi di fitness nelle zanzare transgeniche Aedes aegypti attraverso parametri riproduttivi e analisi morfometriche. Questo protocollo fornisce tecniche essenziali per valutare l'impatto ecologico delle modifiche genetiche.

Quantificazione dei costi di fitness nelle zanzare transgeniche Aedes aegypti

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