Quantificazione dei costi di fitness nelle zanzare transgeniche Aedes aegypti

Questo protocollo dimostra misurazioni standard, che riflettono la fitness, nelle zanzare aedes aegypti, questi parametri di fitness sono stati scelti perché riflettono il successo riproduttivo, sono semplici da misurare e sono comunemente riportati in letteratura. Per iniziare, metti le cartine per uova in acqua sterile durante la notte nell'insectory per far schiudere le zanzare transgeniche e di tipo selvatico. Lasciare che le larve si nutrano ad libitum fornendo diverse gocce di liquame di cibo per pesci macinati.

Per assicurarsi che gli adulti siano vergini, separare le pupe in base al sesso una volta emerse, spostare la pupa su un vetrino da microscopio e rimuovere l'acqua in eccesso con il tessuto per immobilizzare la pupa. Sotto uno stereoscopio con un ingrandimento da due a quattro volte, usando un pennello a punta fine, posiziona la pupa a faccia in su. Quindi analizza visivamente la coda per le differenze nella forma del lobo genitale.

Metti le pupe maschili e femminili in tazze d'acqua separate in un adeguato contenimento. Per incrociare uno o due maschi di gene drive selvatico o transgenico in massa con femmine vergini di tipo selvatico, aggiungere zanzare anestetizzate in rapporti di cinque maschi per una femmina in cartoni di zanzare contenenti circa 150 zanzare. Dopo due o tre giorni, fornire una fonte di sangue sulla gabbia per nutrire le femmine seguendo le pratiche di allevamento standard.

Separa le femmine nutrite con sangue dalle femmine non nutrite controllando visivamente i loro addomi per l'ingorgo e scartando i maschi parzialmente nutriti e non nutriti. Rimetti le femmine gonfie nelle rispettive gabbie. Dopo due o tre giorni, metti le singole femmine in tubi conici da 50 millilitri rivestiti con carta da filtro pre-etichettata con matita.

Riempi tutti i tubi con cinque millilitri di acqua del rubinetto. Metti un pezzetto di batuffolo di cotone imbevuto di uvetta o zucchero su ogni tubo conico. Lasciare le femmine nell'insectory per uno o due giorni e lasciarle deporre le uova.

Quindi conta il numero di uova su ogni carta e calcola la fecondità media, poiché il numero di uova contate su ogni carta diviso per il numero di femmine esaminate. Per asciugare la cartina all'uovo, scolare l'acqua dai tubi e rimetterli nell'insectory. Per congelare le femmine nutrite con sangue dallo studio di fecondità completato, posizionare le gabbie per zanzare a meno 20 gradi Celsius per circa 15 minuti.

Seziona l'ala sinistra di ogni zanzara, asportando l'articolazione dell'ala e il torace e rimuovendo l'intera ala. Usando una pinza, posizionare l'ala su un vetrino, quindi aggiungere una goccia della soluzione madre da 15 millilitri contenente il 70% di etanolo e una goccia di detersivo per piatti all'ala sul vetrino utilizzando una pipetta di trasferimento. Quindi, aggiungi una goccia di glicerolo all'80% al vetrino coprioggetti e posizionalo sopra l'ala nella soluzione di sapone all'etanolo.

Fotografa le ali montate sulle diapositive utilizzando una fotocamera con obiettivo da 65 millimetri. Utilizza il software TpsDig per identificare le coordinate cartesiane bidimensionali per i punti di riferimento. Calcola la lunghezza e l'area dell'ala utilizzando la scrittura R fornita nel manoscritto.

Calcola la dimensione del baricentro dell'ala, che è una misura delle dimensioni, statisticamente indipendente dalla forma definita come la radice quadrata della somma delle distanze quadrate di ogni punto di riferimento dal punto centrale dell'ala Schiudi le singole uova F1 dalle carte raccolte da singole femmine in contenitori di polipropilene trasparente contenenti 100 millilitri di acqua deionizzata appena sterilizzata. A due o tre giorni dalla schiusa, togliete le cartine dall'acqua e lasciatele asciugare per una notte. Schiudi nuovamente le carte delle uova negli stessi contenitori in cui sono state inizialmente schiuse.

Da tre a cinque giorni dopo la schiusa iniziale, ispezionare visivamente le larve alla ricerca di un marcatore transgenico. Registrare il numero di larve transgeniche positive o negative. Scartare le larve negative.

Calcola la fertilità come il numero di larve transgeniche o di controllo diviso per il numero totale di uova. Per determinare il rapporto tra i sessi, aggiungere il numero di femmine o il numero di maschi raccolti nella sequenza temporale dello studio per singola zanzara femmina adulta. Dividi questo numero per il numero di pupe raccolte per la stessa linea di zanzara generata da una singola femmina.

Per determinare la vitalità delle larve, aggiungere il numero totale di pupe raccolte nella sequenza temporale dello studio per zanzara femmina adulta. Dividi questo numero per il numero di larve contate per ogni singola zanzara femmina adulta per la stessa linea contata in precedenza. Calcola lo sviluppo dalle larve alle pupe come il tempo medio per lo sviluppo delle pupe dopo la schiusa.

Per determinare il contributo maschile, incrociare 50 maschi transgenici o di controllo con 100 femmine di controllo in cartoni da 64 once in modo che ci siano 50 maschi con 100 femmine. Dopo l'accoppiamento, offri alle zanzare un pasto di sangue, seguendo le pratiche di allevamento standard. Quindi separare le singole femmine completamente gonfie in tubi conici da 50 millilitri rivestiti con carta da filtro bianca pre-etichettata.

Lasciare le femmine per uno o due giorni nell'insectory e lasciarle deporre le uova. Lasciare asciugare le cartine in tubi nell'insectory per almeno cinque giorni. Usa le pinze per rimuovere le carte e posizionarle per la schiusa.

Due o tre giorni dopo la schiusa, togliete la carta delle uova dall'acqua e lasciatele asciugare. Schiudete nuovamente le cartine per uova negli stessi contenitori. Da tre a cinque giorni dopo la schiusa iniziale, ispezionare visivamente le larve alla ricerca di un marcatore transgenico.

Calcola il contributo maschile come il numero di larve transgeniche F2 diviso per il numero di larve totali per linea di zanzara. Trasferire 50 maschi e 50 femmine di zanzare di tipo selvatico o transgenico di età non alimentate con sangue in un recinto adeguato. Tieni traccia del numero di zanzare maschi e femmine morti ogni giorno.

Calcola la longevità come il numero medio di giorni trascorsi prima che le zanzare muoiano attraverso le gabbie, omettendo le zanzare che muoiono per cause non informative. I tempi di sviluppo tra larve e pupe adulte e tra pupe adulte sono stati valutati con un confronto post hoc tra l'ANOVA di Kruskal-Wallis e Dunn. Le zanzare maschi di tipo selvatico avevano un tempo di impupamento più breve rispetto alle femmine di tipo selvatico, mentre i maschi di D7L1 non differivano significativamente nel tempo di pupa rispetto alle femmine di D7L1.

Le femmine di D7L1 hanno impiegato più tempo per raggiungere l'impupamento rispetto alle femmine di tipo selvatico, così come i maschi di D7L1, rispetto ai maschi di tipo selvatico. Per quanto riguarda le pupe rispetto al tempo di sviluppo adulto, le femmine wild type e D7L1 non differivano significativamente, i maschi wild type si impupano più velocemente delle femmine wild type e dei maschi D7L1. Le zanzare femmine di tipo selvatico non hanno mai raggiunto il loro tempo di sopravvivenza mediano durante lo studio.

Tutti gli altri gruppi hanno raggiunto la loro sopravvivenza mediana prima di 40 giorni, con una netta separazione temporale dei tempi di sopravvivenza mediana. Le zanzare knockout D7L1 avevano un'area alare significativamente più piccola rispetto alle loro controparti di tipo selvatico, ma non c'erano differenze nelle dimensioni delle ali o del centroide. Le zanzare che ospitano una copia di una cassetta di gene drive sotto espressione dei promotori nanos o ZPG non avevano una fitness significativamente diversa rispetto alla linea degli occhi larghi di Higgs, con la notevole eccezione della vitalità delle larve.

I dati di fitness raccolti qui possono essere utilizzati in applicazioni a valle come la modellazione matematica. Per gli studi che valutano nuove strategie di controllo genetico, sarebbero necessari studi più ampi in gabbia in condizioni di semicampo dopo i piccoli studi di fitness delle abilità qui delineati. Gli studi di fitness in laboratorio aiutano a identificare gli effetti indesiderati dei knockout genici o knockin.

L'eliminazione di una proteina salivare può indurre stress per lo sviluppo, mentre il gene drive nelle zanzare gene drive uno e due ha mostrato tassi di sopravvivenza delle larve inferiori. La misurazione dell'idoneità del gene drive ha fortemente influenzato la sua persistenza nella simulazione delle popolazioni dopo la modellazione matematica.