Name: Isolamento semi-automatico della frazione vascolare stromale dal tessuto adiposo bianco murino mediante un dissociatore tissutale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-19T14:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 8 s
Description: Impara l'isolamento semi-automatico della frazione vascolare stromale dal tessuto adiposo bianco murino mediante dissociatore tissutale. Questo metodo migliora la riproducibilità per la ricerca sul differenziamento adipocitario.

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Gli autori desiderano ringraziare Takahito Wada e Saiko Yoshida (The University of Tokyo, Tokyo, Giappone) per la loro assistenza sperimentale. Questo lavoro è stato finanziato dalle seguenti sovvenzioni a Y.H.: borsa di ricerca dell'Università di Tokyo Excellent Young Researcher Program; Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) KAKENHI Grant-in-Aid for Early-Career Scientists, numero di sovvenzione 19K17976; sovvenzione per il Front Runner of Future Diabetes Research (FFDR) della Japan Foundation for Applied Enzymology, numero di sovvenzione 17F005; borsa di studio della Fondazione per la Ricerca Farmacologica; sovvenzione della Mochida Memorial Foundation for Medical and Pharmaceutical Research; sovvenzione della MSD Life Science Foundation; sovvenzione della Daiwa Securities Health Foundation; sovvenzione della Tokyo Biochemical Research Foundation; Borsa di ricerca Life Science della Takeda Science Foundation; e sovvenzione della SENSHIN Medical Research Foundation.

Tutti gli esperimenti sugli animali descritti in questo protocollo sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università di Tokyo ed eseguiti secondo le linee guida istituzionali dell'Università di Tokyo.
1. Preparazione della soluzione enzimatica e del mezzo
<ol><li>Mettere entrambi i lati del tessuto adiposo bianco inguinale (lato destro e sinistro, circa 150 mg) da un topo di 7-8 settimane e 2,5 ml di soluzione enzimatica nel tubo C del dissociatore.</li>
	<li>Ricostituire l'enzima D con 3 ml di terreno di aquila modificato (DMEM)/F12 di Dulbecco senza siero fetale bovino (FBS) o antibiotici, l'enzima R con 2,7 ml di DMEM/F12 senza FBS o antibiotici e l'enzima A con 1 ml di tampone A.</li>
	<li>Preparare 2,5 ml di soluzione enzimatica aggiungendo 100 μL di enzima D, 50 μL di enzima R, 12,5 μL di enzima A e 2,35 ml di DMEM/F12 senza FBS o antibiotici nel tubo C. Impostare il tubo C con soluzione enzimatica su ghiaccio.</li>
</ol>2. Isolamento del tessuto adiposo
<ol><li>Eutanasia Topi maschi C57BL/6J di 7-8 settimane (circa 20 g) per lussazione cervicale.</li>
	<li>In una panca pulita, per isolare il tessuto adiposo bianco inguinale, tagliare la pelle con forbici smussate / affilate sull'addome e verso gli arti inferiori. Isolare il tessuto adiposo dall'interno delle cosce usando forbici affilate / affilate. Un lato del tessuto adiposo inguinale wieghs ~ 75 mg.</li>
	<li>Mettere il tessuto adiposo isolato nel tubo C con soluzione enzimatica su ghiaccio e mantenere il tubo all'interno del banco pulito per mantenere la sterilità.</li>
</ol>3. Tritamento e digestione del tessuto adiposo
<ol><li>Al banco pulito, aggiungere 2,5 ml di soluzione enzimatica alla provetta C.</li>
	<li>Tritare il tessuto adiposo in piccoli pezzi tagliando con forbici affilate / affilate 50 volte. Tagliare il tessuto adiposo in ~ 2 mm2 pezzi.</li>
	<li>Chiudere saldamente il cappuccio del tubo C, capovolgere il tubo e fissarlo al manicotto del dissociatore tissutale con il cappuccio. Quindi, digerire il campione per ~40 minuti a 37 °C. NOTA: Questo studio ha utilizzato gentleMACS Octo Dissociator with Heaters (Miltenyi Biotec 130-096-427) e il programma preinstallato "37C_mr_ATDK_1" è stato seguito.</li>
</ol>4. Filtrazione della sospensione cellulare
<ol><li>DMEM/F12 preriscaldato contenente il 10% di FBS e l'1% di penicillina-streptomicina a 37 °C.</li>
	<li>Staccare il tubo C dal dissociatore tissutale e interrompere la digestione aggiungendo 5 ml di DMEM / F12 contenente il 10% di FBS e l'1% di penicillina-streptomicina e pipettando delicatamente quattro volte.</li>
	<li>Centrifugare a 700 x g per 10 minuti a 20 °C.</li>
	<li>Aspirare con cura il surnatante senza disturbare il pellet cellulare.</li>
	<li>Risospendere il pellet aggiungendo 10 ml di DMEM/F12 contenente il 10% di FBS e l'1% di penicillina-streptomicina e pipettando delicatamente cinque volte.</li>
	<li>Filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare di 70 μm di diametro posizionato su un nuovo tubo da 50 ml.</li>
	<li>Centrifugare a 250 x g per 5 minuti e risospendere il pellet in 10 ml di soluzione salina tamponata fosfato (PBS).</li>
</ol>5. Placcatura cellulare
<ol><li>Centrifugare a 500 x g per 5 min.</li>
	<li>Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet aggiungendo 10 ml di DMEM/F12 contenente il 10% di FBS e l'1% di penicillina-streptomicina e pipettaggio dieci volte.</li>
	<li>Placcare la sospensione cellulare su un piatto rivestito di collagene di 10 cm e porre i piatti in un incubatore di coltura cellulare (37 °C, 5% CO 2) per1-2 ore. NOTA: I piatti rivestiti di collagene non sono assolutamente necessari. Tuttavia, sulla base dell'esperienza, i piatti rivestiti di collagene aiutano l'aderenza dei preadipociti e quindi aumentano la sopravvivenza delle cellule.</li>
	<li>Aspirare il mezzo e lavare le cellule due volte con 3 ml di PBS per lavaggio.</li>
	<li>Aggiungere 10 mL di DMEM/F12 contenente il 10% di FBS e l'1% di penicillina-streptomicina e riportare i piatti nell'incubatore di coltura cellulare (37 °C, 5% CO2).</li>
</ol>6. Passaggio dei preadipociti
<ol><li>Il giorno successivo, aspirare il mezzo (le cellule saranno aderenti, e quindi il mezzo può essere aspirato), lavare le cellule due volte con 3 ml di PBS per lavaggio e aggiungere 10 ml di DMEM / F12 contenente il 10% di FBS e l'1% di penicillina-streptomicina.</li>
	<li>Quando le cellule raggiungono l'80% di confluenza (di solito 4 giorni dopo l'isolamento SVF), dividere le cellule in quattro piatti rivestiti di collagene da 10 cm.<ol><li>In particolare, aspirare il mezzo, lavare le cellule con PBS (temperatura ambiente [RT]), aggiungere 1 ml di tripsina allo 0,05% preriscaldata e incubare per 5 minuti nell'incubatore di coltura cellulare.</li>
		<li>Aggiungere 10 ml di DMEM / F12 contenente il 10% di FBS e l'1% di penicillina-streptomicina per estinguere l'attività della tripsina. Dopo il pipettaggio, centrifugare a 440 x g per 5 min.</li>
		<li>Aspirare il surnatante, risospendere le cellule aggiungendo 40 ml di DMEM / F12 contenente il 10% di FBS e l'1% di penicillina-streptomicina e placcare le cellule in quattro piatti rivestiti di collagene da 10 cm.</li>
	</ol></li>
	<li>Far passare nuovamente le cellule quando raggiungono l'80% di confluenza.</li>
</ol>7. Preparazione di retrovirus che esprimono l'antigene T SV40 per l'immortalizzazione dei preadipociti (opzionale)
<ol><li>Almeno 3 giorni prima dell'immortalizzazione, placcare le celle di confezionamento Platinum-E (Plat-E)29 ad una densità di 3,0 x 105 cellule/ml in 2 ml di DMEM con il 10% di FBS senza antibiotici. Utilizzare un ematocitometro per contare le cellule.</li>
	<li>Il giorno successivo, trasfettare 4 μg di pBABE-neo largeTcDNA (aggiungere gene plasmide #1780) usando Lipofectamine 2000, secondo le istruzioni del produttore.</li>
	<li>Dopo 24 ore, aspirare il mezzo e aggiungere 2 ml di DMEM con il 10% di FBS e l'1% di penicillina-streptomicina.</li>
	<li>Il giorno dopo, raccogli il supernatante retrovirale. Il retrovirus può essere utilizzato per l'immortalizzazione immediatamente o conservato a -80 °C.</li>
</ol>8. Immortalizzazione di preadipociti con antigene T grande SV40 (opzionale)
<ol><li>Passaggio ed espansione dei preadipociti due volte dopo l'isolamento SVF.</li>
	<li>Placcare le cellule in piastre a 6 pozzetti ad una densità di 0,5-1,0 x 104 cellule / ml in 2 ml di DMEM / F12 con 10% FBS e 1% penicillina-streptomicina. Utilizzare un ematocitometro per contare le cellule.</li>
	<li>Il giorno successivo, preparare 250 μL di retrovirus fresco o scongelato che esprime l'antigene T grande SV40 per pozzetto delle piastre a 6 pozzetti. Centrifugare a 440 x g per 5 minuti e posizionare il surnatante in una nuova provetta.</li>
	<li>Aggiungere 750 μL di DMEM/F12 contenente il 10% di FBS e l'1% di penicillina-streptomicina e 1 μL di polibrene per 250 μL di surnatante retrovirale per rendere il virus funzionante.</li>
	<li>Aspirare il terreno e aggiungere 1.000 μL del retrovirus funzionante a ciascun pozzetto contenente i preadipociti.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di DMEM/F12 con 10% FBS e 1% penicillina-streptomicina 4 ore dopo.</li>
	<li>Il giorno successivo, separare i preadipociti infetti in un piatto da 10 cm e selezionare le cellule infette con DMEM / F12 contenenti il 10% di FBS, l'1% di penicillina-streptomicina e 500 μg / mL di neomicina. Per monitorare la selezione degli antibiotici, preparare un piatto di cellule non infette con neomicina.</li>
	<li>Continuare a far passare le cellule infette con neomicina fino a quando tutte le cellule non infette nel monitor sono morte.</li>
</ol>9. Differenziazione degli adipociti
<ol><li>Placcare le celle. Per piastre a 12 pozzetti, placcare le cellule ad una densità di 4,0 x 104 cellule / ml in 1 ml di DMEM / F12 contenente il 10% di FBS e l'1% di penicillina-streptomicina.</li>
	<li>Quando i preadipociti diventano confluenti (48-72 ore dopo la placcatura), aspirare il mezzo e sostituirlo con il mezzo di differenziazione (vedere Tabella 1 per la composizione).</li>
	<li>Al giorno 2 della differenziazione (cioè 48 ore dopo aver indotto la differenziazione), sostituire il mezzo con il mezzo di mantenimento (vedere Tabella 1 per la composizione). Successivamente, cambiare il mezzo di manutenzione ogni 2 giorni. La differenziazione terminale si ottiene al giorno 7 della differenziazione.</li>
	<li>Rosso olio o colorazione<ol><li>Per la colorazione rosso olio, aspirare il mezzo e sciacquare le cellule con 1 ml di PBS per pozzetto. Fissare le cellule aggiungendo 1 ml di formaldeide al 4% per pozzetto e incubare le cellule per 15 minuti a RT.</li>
		<li>Durante l'incubazione, diluire la soluzione di brodo rosso olio allo 0,5% (in alcool isopropilico) allo 0,3% usando ddH2O e filtrare la soluzione di lavoro con carta da filtro.</li>
		<li>Dopo i 15 minuti di incubazione, rimuovere la formaldeide, sciacquare le cellule con alcool isopropilico al 60%, aggiungere 1 ml di olio filtrato rosso o soluzione di lavoro e incubare per 1 ora a RT.</li>
		<li>Dopo l'incubazione, lavare le cellule con acqua corrente. Quindi, osservare gli adipociti carichi di lipidi al microscopio invertito (ingrandimento: obiettivo 20x e oculare 10x).</li>
	</ol></li>
	<li>Analisi dell'espressione dell'mRNA NOTA: Fare riferimento alla Tabella 2 per l'elenco dei primer utilizzati in questo studio.<ol><li>Aspirare il mezzo e aggiungere 1 mL/pozzetto di trizolo al pozzetto.</li>
		<li>Incubare per 15 minuti a RT, staccare le cellule mediante pipettaggio e raccogliere i campioni in provette da 1,5 ml. I campioni possono essere conservati a -80 °C fino all'estrazione dell'RNA.</li>
		<li>Scongelare il campione congelato a RT, aggiungere 200 μL di cloroformio al campione e agitare vigorosamente per 15 s.</li>
		<li>Incubare il campione a RT per 3 minuti e quindi centrifugare a 20.000 x g per 15 minuti a 4 °C.</li>
		<li>Rimuovere con attenzione la fase acquosa (superiore, incolore) e trasferirla in nuovi tubi. Non trasferire mai la fase proteica (media, bianca) o la fase fenolo/cloroformio (in basso, rosa).</li>
		<li>Aggiungere lentamente un volume uguale di 70% di EtOH e mescolare delicatamente. Non vortice.</li>
		<li>Caricare il campione (fino a 700 μL) in una colonna di spin di RNA inserita in una provetta di raccolta. Assicurati di includere qualsiasi precipitato che potrebbe essersi formato.</li>
		<li>Ruotare a 9.000 x g per 30 s a 4 °C e quindi eliminare il flusso passante.</li>
		<li>Aggiungere 700 μL di tampone RW1, centrifugare a 9.000 x g per 30 s a 4 °C e quindi eliminare il flusso passante.</li>
		<li>Trasferire la colonna in una nuova provetta di raccolta e aggiungere 500 μL di RPE buffer.</li>
		<li>Ruotare a 9.000 x g per 30 s a 4 °C e quindi scartare il flusso in corso.</li>
		<li>Aggiungere 500 μL di RPE tampone, ruotare a 9.000 x g per 2 minuti a 4 °C, quindi eliminare il flusso in corso.</li>
		<li>Trasferire la colonna in un nuovo tubo di raccolta e ruotare (colonne senza buffer) a 9.000 x g per 1-2 minuti a 4 °C.</li>
		<li>Trasferire la colonna in un nuovo tubo di raccolta da 1,5 mL e aggiungere 30 μL di acqua priva di RNasi direttamente sulla membrana della colonna.</li>
		<li>Incubare il campione a RT per 1-2 minuti. Quindi, ruotare a 9.000 x g per 1 minuto a 4 °C per eluire l'RNA.</li>
		<li>Controllare la concentrazione di RNA utilizzando un fluorospettrometro. NOTA: Si raccomanda di allineare la concentrazione qui.</li>
		<li>Eseguire la trascrizione inversa utilizzando ~ 200 ng di modello di RNA. Utilizzare un kit commerciale quantitativo di reazione a catena della polimerasi in tempo reale (qPCR-RT) e seguire il protocollo del produttore. Dopo la reazione, diluire il cDNA 20 volte a 200 μL.</li>
		<li>Aggiungere 2,0 μL di cDNA, 3,0 μL di Power Sybr Green Master Mix, 0,018 μL di primer forward qPCR da 100 μM, 0,018 μL di primer inverso qPCR da 100 μM e 0,96 μL di ddH2O a ciascun pozzetto di una piastra da 384 pozzetti.</li>
		<li>Eseguire una qPCR (fase di attesa: 50°C per 2 min e 95°C per 2 min; Stadio PCR: 40 cicli di 95 °C per 15 s e 60 °C per 1 min; stadio della curva di fusione: 95 °C per 15 s, 60 °C per 1 min e 95 °C per 15 s). Utilizzare il metodo della curva standard per la quantificazione.</li>
	</ol></li>
</ol>

Isolamento semi-automatico del tessuto adiposo bianco murino

<ol><li>Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+we+talk+about+when+we+talk+about+fat%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">What we talk about when we talk about fat.</a> Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).</li>
<li>Hotamisligil, G. S., Shargill, N. S., Spiegelman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+expression+of+tumor+necrosis+factor-alpha%3A+direct+role+in+obesity-linked+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Adipose expression of tumor necrosis factor-alpha: direct role in obesity-linked insulin resistance.</a> Science. 259 (5091), 87-91 (1993).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positional+cloning+of+the+mouse+obese+gene+and+its+human+homologue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Positional cloning of the mouse obese gene and its human homologue.</a> Nature. 372 (6505), 425-432 (1994).</li>
<li>Kajimura, S., Saito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+era+in+brown+adipose+tissue+biology%3A+Molecular+control+of+brown+fat+development+and+energy+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">A new era in brown adipose tissue biology: Molecular control of brown fat development and energy homeostasis.</a> Annual Review of Physiology. 76, 225-249 (2014).</li>
<li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beige+adipocytes+are+a+distinct+type+of+thermogenic+fat+cell+in+mouse+and+human%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Beige adipocytes are a distinct type of thermogenic fat cell in mouse and human.</a> Cell. 150 (2), 366-376 (2012).</li>
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<li>Loos, R. J. F., Yeo, G. S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bigger+picture+of+FTO-the+first+GWAS-identified+obesity+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">The bigger picture of FTO-the first GWAS-identified obesity gene.</a> Nature Reviews Endocrinology. 10 (1), 51-61 (2014).</li>
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<li>Villanueva, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+subtype-selective+recruitment+of+TLE3+or+Prdm16+by+PPAR%CE%B3+specifies+lipid+storage+versus+thermogenic+gene+programs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Adipose subtype-selective recruitment of TLE3 or Prdm16 by PPARγ specifies lipid storage versus thermogenic gene programs.</a> Cell Metabolism. 17 (3), 423-435 (2013).</li>
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<li>Green, H., Kehinde, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+established+preadipose+cell+line+and+its+differentiation+in+culture+II.+Factors+affecting+the+adipose+conversion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An established preadipose cell line and its differentiation in culture II. Factors affecting the adipose conversion.</a> Cell. 5 (1), 19-27 (1975).</li>
<li>Green, H., Kehinde, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+heritable+changes+leading+to+increased+adipose+conversion+in+3T3+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Spontaneous heritable changes leading to increased adipose conversion in 3T3 cells.</a> Cell. 7 (1), 105-113 (1976).</li>
<li>Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+differentiation+of+stromal+vascular+cells+to+beige%2Fbrite+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e50191(2013).</li>
<li>Galmozzi, A., Kok, B. P., Saez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+differentiation+of+primary+white+and+brown+preadipocytes+from+newborn+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and differentiation of primary white and brown preadipocytes from newborn mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (167), e62005(2021).</li>
<li>Priya, N., Sarcar, S., Majumdar, A. S., SundarRaj, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Explant+culture%3A+a+simple%2C+reproducible%2C+efficient+and+economic+technique+for+isolation+of+mesenchymal+stromal+cells+from+human+adipose+tissue+and+lipoaspirate%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering+and+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Explant culture: a simple, reproducible, efficient and economic technique for isolation of mesenchymal stromal cells from human adipose tissue and lipoaspirate.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 8 (9), 706-716 (2014).</li>
<li>Lockhart, R. A., Aronowitz, J. A., Dos-Anjos Vilaboa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+freshly+isolated+human+adipose+stromal+cells+for+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Aesthetic+Surgery+Journal%22%5BJournal%5D)">Use of freshly isolated human adipose stromal cells for clinical applications.</a> Aesthetic Surgery Journal. 37, S4-S8 (2017).</li>
<li>Morita, S., Kojima, T., Kitamura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plat-E%3A+an+efficient+and+stable+system+for+transient+packaging+of+retroviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Plat-E: an efficient and stable system for transient packaging of retroviruses.</a> Gene Therapy. 7 (12), 1063-1066 (2000).</li>
<li>Li, Y., Fromme, T., Klingenspor, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meaningful+respirometric+measurements+of+UCP1-mediated+thermogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Meaningful respirometric measurements of UCP1-mediated thermogenesis.</a> Biochimie. 134, 56-61 (2017).</li>
<li>Hiraike, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation+with+mouse+adipocytes+using+hypotonic+buffer+to+enrich+nuclear+fraction+before+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation with mouse adipocytes using hypotonic buffer to enrich nuclear fraction before fixation.</a> STAR Protocols. 4 (1), 102093(2023).</li>
<li>Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+white+adipocyte+progenitor+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo.</a> Cell. 135 (2), 240-249 (2008).</li>
</ol>

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Qui, abbiamo descritto un protocollo per l'isolamento della SVF dal tessuto adiposo murino per ottenere preadipociti ed eseguire la differenziazione degli adipociti in vitro. L'uso di un dissociatore tissutale per la digestione della collagenasi ha ridotto la variazione sperimentale, diminuito il rischio di contaminazione e aumentato la riproducibilità. Sebbene questa procedura sia un passaggio critico all'interno del protocollo presentato, il processo è altamente automatizzato e non è necessaria l'ottimizzazion...

La biologia del tessuto adiposo ha attirato un'attenzione sempre maggiore a causa della crescente prevalenza dell'obesità e del diabete di tipo 2 a livello globale1. Gli adipociti immagazzinano l'energia in eccesso sotto forma di goccioline lipidiche, che vengono rilasciate per fame. Inoltre, il tessuto adiposo mantiene l'omeostasi energetica sistemica fungendo da organo endocrino e comunicando con altri tessuti 2,3. Curiosamente, sia l'eccesso di tessuto adiposo (obesità) che la perdita adiposa (lipodistrofia) sono legati all'insulino-resistenza e al diabete1. Gli adipociti sono divisi in tre tipi: bianco, marrone e beige1. Gli adipociti bianchi immagazzinano principalmente l'energia in eccesso come lipidi, mentre gli adipociti marroni e beige dissipano l'energia sotto forma di calore attraverso la proteina di disaccoppiamento mitocondriale-1 (Ucp1)1,4. In particolare, gli adipociti beige (chiamati anche adipociti bruni "inducibili") compaiono nel tessuto adiposo bianco in risposta alla stimolazione fredda o simpatica e mostrano modelli di espressione genica che si sovrappongono ma sono distinti da quelli degli adipociti bruni "classici"5. Recentemente, gli adipociti marroni e beige sono stati anticipati come potenziali bersagli di trattamenti anti-obesità e anti-diabete volti a "migliorare la dissipazione di energia" piuttosto che "sopprimere l'apporto energetico"4. Supportivamente, l'allele di rischio della variante dell'obesità FTO rs1421085 nell'uomo, che mostra la più forte associazione con un indice di massa corporea (BMI) più elevato tra le varianti comuni6,7 e mostra varie interazioni gene-ambiente 8,9, è riportato per regolare negativamente la differenziazione e la funzione degli adipociti beige10. Il recettore attivato dal proliferatore dei perossisomi γ (PPARγ) è noto come regolatore trascrizionale principale dell'adipogenesi ed è necessario e sufficiente per la differenziazione degli adipociti11. I regolatori trascrizionali, come il dominio omologo PRD1-BF1-RIZ1 contenente 16 (PRDM16), il fattore precoce delle cellule b 2 (EBF2) e il fattore nucleare I-A (NFIA), sono cruciali per la differenziazione e la funzione degli adipociti marroni e beige 12,13,14,15,16,17,18. D'altra parte, la programmazione genica degli adipociti bianchi richiede regolatori trascrizionali, come la proteina enhancer transducina-simile 3 (TLE3) e la proteina delle dita di zinco 423 (ZFP423)19,20,21.
I sistemi modello in vitro consentono di eseguire studi molecolari che mirano a migliorare la comprensione dei meccanismi alla base delle funzioni e delle disfunzioni degli adipociti. Sebbene le linee cellulari di preadipociti pubblicamente disponibili e immortalate come 3T3-L1 e 3T3-F442A esistano22,23,24, la coltura di preadipociti primari e la differenziazione in adipociti sarebbe un modello più adatto per lo studio dell'adipogenesi in vivo. L'isolamento della frazione vascolare stromale (SVF) dal tessuto adiposo murino è un metodo ben noto per ottenere i preadipociti primari25,26. Tuttavia, la digestione della collagenasi del tessuto adiposo, che viene comunemente eseguita utilizzando uno shaker batterico con una cremagliera tubiera, può provocare variazioni sperimentali ed è soggetta a contaminazione27,28. Qui, descriviamo un protocollo alternativo che utilizza un dissociatore tissutale MACS (Gentle magnetic-activated cell sorting) per la digestione della collagenasi per ottenere un più facile isolamento della SVF.

<table><tbody><tr><td>Piastra da 100 mm</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 12 pozzetti</td><td>Corning</td><td>3513</td><td></td></tr><tr><td>Piastra da 60 mm</td><td>IWAKI</td><td>3010-060</td><td></td></tr><tr><td>Kit di dissociazione del tessuto adiposo, topo e ratto</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-105-808</td><td>contenuto: Enzima D, Enzima R, Enzima A e tampone A</td></tr><tr><td>Filtro cellulare 70 &; m</td><td>BD falcon</td><td>#352350</td><td></td></tr><tr><td>Piastre rivestite di collagene, 100 mm</td><td>BD</td><td>#356450</td><td></td></tr><tr><td>Piastre rivestite di collagene, 60 mm</td><td>BD</td><td>#354401</td><td></td></tr><tr><td>Collagene I Coat Micropiastra a 6 pozzetti</td><td>IWAKI</td><td>4810-010</td><td></td></tr><tr><td>Desametasone</td><td>Wako</td><td>041-18861</td><td></td></tr><tr><td>Pinze da dissezione</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>autoclave prima dell'uso</td></tr><tr><td>Forbici da dissezione, smussate/affilate</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>autoclave prima dell'uso</td></tr><tr><td>Forbici da dissezione, affilate/affilate</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>autoclave prima dell'uso</td></tr><tr><td>DMEM/F-12, integratore GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>10565-042</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS C Tubes</td><td>Milteny Biotec</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td>delicatoMACSOcto dissociatore con riscaldatori</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-427</td><td></td></tr><tr><td>Humulin R Iniezione U-100</td><td>Eli Lilly</td><td>872492</td><td></td></tr><tr><td>Indometacina</td><td>Sigma</td><td>I7378-5G</td><td></td></tr><tr><td>Isobutilmetilxantina (IBMX)</td><td>Sigma</td><td>17018-1G</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamina 2000</td><td>Life Technologies</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>Neomicina Solfato</td><td>Fujifilm</td><td>146-08871&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>31985-062</td><td></td></tr><tr><td>pBABE-neo largeTcDNA (SV40)</td><td>Add gene</td><td>#1780</td><td></td></tr><tr><td>PBS compresse</td><td>Takara</td><td>T900</td><td></td></tr><tr><td>Platinum-E (Plat-E) Retrovirale Packaging Linea</td> cellulare <td>cell biolab</td><td>RV-101</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Nacalai Tesque</td><td>12996-81</td><td></td></tr><tr><td>Power Sybr Green Master Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4367659</td><td></td></tr><tr><td>ReverTra Ace qPCR RT Master Mix</td><td>TOYOBO</td><td>#FSQ-201</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit (250)</td><td>QIAGEN</td><td>74106</td><td></td></tr><tr><td>Rosiglitazone</td><td>Wako</td><td>180-02653</td><td></td></tr><tr><td>T3</td><td>Sigma</td><td>T2877-100mg</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,05%)</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento semi-automatico della frazione vascolare stromale dal tessuto adiposo bianco murino mediante un dissociatore tissutale

Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator

Lo studio in vitro della differenziazione degli adipociti bianchi, marroni e beige consente lo studio delle funzioni autonome cellulari degli adipociti e dei loro meccanismi. Le linee cellulari di preadipociti bianchi immortalizzati sono pubblicamente disponibili e ampiamente utilizzate. Tuttavia, l'emergere di adipociti beige nel tessuto adiposo bianco in risposta a segnali esterni è difficile da ricapitolare nella misura completa utilizzando linee cellulari di adipociti bianchi disponibili al pubblico. L'isolamento della frazione vascolare stromale (SVF) dal tessuto adiposo murino viene comunemente eseguito per ottenere preadipociti primari ed eseguire la differenziazione degli adipociti. Tuttavia, la tritatura e la digestione della collagenasi del tessuto adiposo a mano possono provocare variazioni sperimentali ed è soggetta a contaminazione. Qui, presentiamo un protocollo semi-automatico modificato che utilizza un dissociatore tissutale per la digestione della collagenasi per ottenere un più facile isolamento della SVF, con l'obiettivo di ridurre la variazione sperimentale, ridurre la contaminazione e aumentare la riproducibilità. I adipociti ottenuti e gli adipociti differenziati possono essere utilizzati per analisi funzionali e meccanicistiche.

Questo protocollo produce adipociti completamente differenziati e carichi di lipidi 7 giorni dopo aver indotto la differenziazione degli adipociti. Il grado di differenziazione degli adipociti può essere valutato mediante la colorazione rosso olio di trigliceridi e lipidi (Figura 1A), o l'analisi dell'espressione dell'mRNA utilizzando qPCR-RT di geni adipocitari, come il regolatore principale dell'adipogenesi Pparg e il suo target Fabp4 (Figura 1B).</st...

Questo protocollo descrive l'isolamento semi-automatico della frazione vascolare stromale (SVF) dal tessuto adiposo murino per ottenere preadipociti e ottenere la differenziazione degli adipociti in vitro. L'uso di un dissociatore tissutale per la digestione della collagenasi riduce la variazione sperimentale e aumenta la riproducibilità.

Isolamento semi-automatico della frazione vascolare stromale dal tessuto adiposo bianco murino mediante un dissociatore tissutale

The in vitro study of white, brown, and beige adipocyte differentiation enables the investigation of cell-autonomous functions of adipocytes and their ...

Siamo interessati ai sottotipi di adipociti marroni e beige che dissipano energia sotto forma di calore, mentre gli adipociti bianchi generalmente immagazzinano energia come Il nostro obiettivo è sviluppare un nuovo trattamento per l'obesità e il diabete basato sulla promozione del dispendio energetico, piuttosto che sulla soppressione dell'assunzione di energia. Abbiamo identificato un fattore di trascrizione, NFI, come regolatore critico della differenziazione degli adipociti bruni mediante un'analisi della cromatina aperta a livello di genoma. NFI e il principale regolatore trascrizionale dell'adipogenesi, PPAR-gamma, co-localizzano come potenziatori specifici del grasso bruno.Nel processo di isolamento della frazione vascolare stromale dal tessuto adiposo del topo, la tritatura manuale e la digestione della collagenasi del tessuto adiposo possono portare a variabilità e contaminazione sperimentali. Il nostro metodo utilizza un dissociatore tissutale per la digestione della collagenasi, che facilita l'isolamento SVF, riduce la variabilità sperimentale e la contaminazione e migliora la riproducibilità. Gli esperimenti con adipociti differenziati individualmente sono indispensabili per la ricerca nel nostro campo.Il nostro protocollo offrirebbe un isolamento SVF facile e riproducibile per la successiva differenziazione degli adipociti e accelererebbe la ricerca nella nostra comunità. Attualmente, stiamo studiando il ruolo delle NFI del metabolismo di tutto il corpo, come il peso corporeo e il glucosio, utilizzando modelli murini di guadagno e perdita di funzione. Esploreremo anche altre attivazioni farmacologiche di NFI per ogni via a valle nel prossimo futuro.

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Questo video mostra una tecnica per isolare e coltivare cellule staminali derivate dalla cresta neurale (ADSC) derivate da creste neurali marcate in modo fluorescente da tessuto adiposo dell'arco periaortico murino. Dopo l'isolamento, le NCADSC vengono rilevate, selezionate utilizzando la smistamento cellulare attivata dalla fluorescenza e successivamente coltivate su una piastra, promuovendo la proliferazione cellulare.

Isolamento di cellule staminali di derivazione adiposa da tessuto adiposo periaortico murino

Primarie preadipociti bianchi isolati dal tessuto adiposo bianco nei topi possono essere differenziate in cellule del beige / brite. Presentato qui è un sistema affidabile modello cellulare per studiare la regolazione molecolare della "doratura" di grasso bianco.

Isolamento e la differenziazione di cellule stromali vascolari alle celle Beige / Brite

Nel 2001, i ricercatori della UCLA hanno descritto l'isolamento di una popolazione di cellule staminali adulte, chiamate cellule o ASC staminali derivate da tessuto adiposo, dal tessuto adiposo. Questo articolo descrive l'isolamento di ASC da lipoaspirato utilizzando un protocollo digestione enzimatica manuale mediante collagenasi.

Isolamento Manuale di cellule staminali derivate da tessuto adiposo da lipoaspirato umani

Il tessuto adiposo (AT) è un sito di attivazione delle cellule immunitarie intensa e interazione. Quasi tutte le cellule del sistema immunitario sono presenti in AT e per i rapporti sono alterati da obesità. Isolamento adeguato, quantificazione e caratterizzazione di AT popolazioni di cellule immunitarie sono fondamentali per comprendere il loro ruolo nella malattia immunometabolic.

Isolamento di tessuto adiposo cellule immunitarie

Vi presentiamo un protocollo per isolare frammenti adiposo microvascolari derivate dal tessuto che rappresentano le unità di vascolarizzazione promettenti. Possono essere isolati rapidamente, non richiedono l'elaborazione in vitro e, pertanto, può essere utilizzato per un passo prevascularization in diversi campi dell'ingegneria dei tessuti.

L&#39;isolamento di Murine adiposo derivate dal tessuto microvascolare Frammenti come vascolarizzazione Unità per Tissue Engineering

Tessuto adiposo bianco (WAT) ha gravi lacune nei suoi modelli di cultura primaria corrente, ostacolando lo sviluppo farmacologico e gli studi metabolici. Qui, presentiamo un protocollo per produrre un sistema adiposo microphysiological di WAT sandwiching tra fogli di cellule stromali. Questo costrutto fornisce una piattaforma stabile e adattabile per colture primarie di WAT.

Una piattaforma di Microphysiologic per grasso umano: Sandwich tessuto adiposo bianco

Questo protocollo descrive l'approccio tecnico per isolare sottopopolazioni di cellule stromali adipogeniche e fibro-infiammatorie da depositi di tessuto adiposo bianco (WAT) murino intra-addominale mediante smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza o separazione di microsfere immunomagnetiche.

Isolamento di sottopopolazioni di cellule stromali adipogeniche e fibro-infiammatorie da depositi adiposi intra-addominali murini

Questo protocollo fornisce un metodo efficiente di digestione della collagenasi per l'isolamento di adipociti vitali e cellule di frazione vascolare stromale-SVF dal grasso viscerale umano in un unico processo, compresa la metodologia per ottenere RNA di alta qualità dagli adipociti e la fenotipizzazione dei macrofagi SVF attraverso la colorazione di più marcatori legati alla membrana per l'analisi mediante citometria a flusso.

Isolamento di adipociti vitali e frazione vascolare stromale dal tessuto adiposo viscerale umano adatto per l'analisi dell'RNA e la fenotipizzazione dei macrofagi

Qui, descriviamo l'isolamento, la coltura e l'induzione adipogenica di preadipociti derivati dalla frazione vascolare stromale dal tessuto adiposo periaortico di topo, consentendo lo studio della funzione del tessuto adiposo perivascolare e della sua relazione con le cellule vascolari.

Isolamento, coltura e induzione adipogenica di preadipociti derivati dalla frazione vascolare stromale dal tessuto adiposo periaortico di topo

Qui presentiamo un metodo standard per isolare in modo efficiente cellule staminali e adipociti derivati dalle adipoci, caratterizzato da una riduzione del &gt;90% dei tempi di lavorazione, un'elevata vitalità cellulare e una compatibilità ampia.

Isolamento efficiente di cellule staminali e adipociti derivati dall'adiposo dal tessuto adiposo suino

Impara l'isolamento semi-automatico della frazione vascolare stromale dal tessuto adiposo bianco murino mediante dissociatore tissutale. Questo metodo migliora la riproducibilità per la ricerca sul differenziamento adipocitario.

Isolamento semi-automatico della frazione vascolare stromale dal tessuto adiposo bianco murino mediante un dissociatore tissutale (Video) | JoVE Journal

Isolamento semi-automatico della frazione vascolare stromale dal tessuto adiposo bianco murino mediante un dissociatore tissutale

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