Isolamento di vettori virali adeno-associati attraverso un protocollo cromatografico di affinità con eparina a passaggio singolo e semiautomatico

Questo manoscritto descrive un protocollo dettagliato per la generazione e la purificazione di vettori virali adeno-associati utilizzando un metodo cromatografico di affinità ottimizzato a base di eparina. Presenta un approccio semplice, scalabile ed economico, eliminando la necessità di ultracentrifugazione. I vettori risultanti mostrano un'elevata purezza e attività biologica, dimostrando il loro valore negli studi preclinici.

In questo lavoro, intendiamo sviluppare un protocollo migliorato per la produzione, la purificazione e la caratterizzazione di vettori virali adeno-associati a mosaico che potrebbero dimostrare il loro valore negli studi preclinici. Nonostante gli sforzi per stabilire linee cellulari produttrici stabili, la trasfezione transitoria nelle cellule di mammifero è ancora il flusso di lavoro predominante per la produzione di AAV. Quindi gli AAV vengono purificati mediante centrifugazione in gradiente ad altissima velocità o mediante tecniche cromatografiche che si basano sulle proprietà biochimiche delle particelle virali.

I metodi comunemente usati per purificare gli AAV utilizzano il cloruro di cesio o l'ultracentrifugazione a gradiente di densità di iodixanolo. Nonostante i loro vantaggi, hanno alcune limitazioni. Richiedono molto tempo, hanno una scalabilità limitata e spesso danno risultati ad alcuni vettori con bassa purezza.

Ora, per superare questi vincoli, diversi ricercatori hanno rivolto la loro attenzione alle tecniche cromatografiche. Descriviamo un protocollo passo-passo per la generazione di rAAV a mosaico basato sulla capacità di legare l'eparina di AAV2. Questo metodo rende gli rAAV altamente puri e biologicamente attivi pronti per l'uso in sei giorni, presentandosi come una strategia semi-automatizzata, scalabile ed economica per generare rAAV per studi preclinici.

Avendo dimostrato l'applicabilità di questo metodo per la generazione di rAAV a mosaico, il sistema di produzione può ora essere messo a punto per ottenere una migliore scalabilità ed economicità stabilendo una linea cellulare di produzione. Inoltre, miriamo a rimuovere le particelle vuote includendo una seconda fase di purificazione della lucidatura.