Produzione e purificazione in coltura in sospensione di virus adeno-associati mediante centrifugazione a gradiente di densità di iodixanolo per applicazioni in vivo

Il virus adeno-associato viene prodotto in coltura cellulare in sospensione e purificato mediante centrifugazione a gradiente di densità a doppio iodixanolo. Sono incluse misure per aumentare la resa totale del virus, diminuire il rischio di precipitazione del virus e concentrare ulteriormente il prodotto finale del virus. I titoli finali attesi raggiungono^10-12 particelle virali/mL e sono adatti per l'uso preclinico in vivo .

Utilizziamo un approccio di evoluzione diretta per identificare i capiti virali adeno-associati con un tropismo più elevato per i tipi di cellule umane bersaglio. Attraverso questa ricerca, miriamo a produrre vettori virali adeno-associati ricombinanti con una migliore trasduzione delle cellule bersaglio e rilevanza clinica nel campo della terapia genica. Il nostro gruppo ha recentemente de-targettizzato diversi sierotipi di AAV dal fegato incorporando residui di capside originali di un sierotipo AAV che possiede naturalmente un ridotto trofismo epatico.

Se esteso con successo ad altri sierotipi, questo fornisce le basi per ridurre la dose clinica di RAAV necessaria mediante iniezione periferica e ridurre gli esiti avversi per i pazienti. Il metodo di purificazione IODIXanol, pur essendo conveniente, è difficile da scalare. Inoltre, nelle applicazioni a valle, l'approccio dell'evoluzione diretta viene eseguito con modelli animali o in vitro.

Quindi il capside isolato dall'evoluzione diretta potrebbe non trasdurre bersagli in vivo nell'uomo nella stessa misura dei modelli preclinici. Questo protocollo è conveniente e accessibile per i laboratori più piccoli. Inoltre, questo metodo produce virus adeno-associati ricombinanti ad alta purezza che possono essere utilizzati per applicazioni precliniche in vivo a valle.