Name: Una strategia di apprendimento automatico basata su immagini di cellule vive per monitorare la differenziazione delle cellule staminali pluripotenti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-04T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 38 s
Description: Scopri una strategia di apprendimento automatico basata su immagini di cellule vive per monitorare la differenziazione delle cellule staminali pluripotenti. Questo metodo non invasivo ottimizza i protocolli e migliora la riproducibilità.

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<meta charset="utf8"></head><body>Monitoraggio della differenziazione delle cellule staminali pluripotenti mediante strategia ML basata su immagini

<ol><li>Yoshida, Y., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+10+years+later%3A+for+cardiac+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells 10 years later: for cardiac applications.</a> Circ Res. 120 (12), 1958-1968 (2017).</li>
<li>Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+technology%3A+a+decade+of+progress%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell technology: a decade of progress.</a> Nat Rev Drug Discov. 16 (2), 115-130 (2017).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li>
<li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+defined+generation+of+human+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Chemically defined generation of human cardiomyocytes.</a> Nat Methods. 11 (8), 855-860 (2014).</li>
<li>Mordwinkin, N. M., Burridge, P. W., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+high-throughput+drug+discovery%2C+cardiotoxicity+screening%2C+and+publication+standards%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cardiovasc+Transl+Res%22%5BJournal%5D)">A review of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for high-throughput drug discovery, cardiotoxicity screening, and publication standards.</a> J Cardiovasc Transl Res. 6 (1), 22-30 (2013).</li>
<li>Vanden Berg, C. W., Elliott, D. A., Braam, S. R., Mummery, C. L., Davis, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+cardiomyocytes+under+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes under defined conditions.</a> Methods Mol Biol. 1353, 163-180 (2016).</li>
<li>Burridge, P. W., Holmström, A., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+defined+culture+and+cardiomyocyte+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Chemically defined culture and cardiomyocyte differentiation of human pluripotent stem cells.</a> Curr Protoc Hum Genet. 87, 1-15 (2015).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiac+tissue-like+constructs+for+repairing+the+infarcted+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Human pluripotent stem cell-derived cardiac tissue-like constructs for repairing the infarcted myocardium.</a> Stem Cell Rep. 9 (5), 1546-1559 (2017).</li>
<li>Smith, A. S. T., Macadangdang, J., Leung, W., Laflamme, M. A., Kim, D. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+iPSC-derived+cardiomyocytes+and+tissue+engineering+strategies+for+disease+modeling+and+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Adv%22%5BJournal%5D)">Human iPSC-derived cardiomyocytes and tissue engineering strategies for disease modeling and drug screening.</a> Biotechnol Adv. 35 (1), 77-94 (2017).</li>
<li>Sharma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+to+assess+drug+cardiotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Use of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes to assess drug cardiotoxicity.</a> Nat Protoc. 13 (12), 3018-3041 (2018).</li>
<li>Mehta, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+targeted+and+testable+antiarrhythmic+therapy+for+long-QT+syndrome+type+2+using+a+patient-specific+cellular+model%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Heart+J%22%5BJournal%5D)">Identification of a targeted and testable antiarrhythmic therapy for long-QT syndrome type 2 using a patient-specific cellular model.</a> Eur Heart J. 39 (16), 1446-1455 (2018).</li>
<li>Cahan, P., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins+and+implications+of+pluripotent+stem+cell+variability+and+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Origins and implications of pluripotent stem cell variability and heterogeneity.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (6), 357-368 (2013).</li>
<li>Kim, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+memory+in+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).</li>
<li>Rouhani, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+background+drives+transcriptional+variation+in+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Genetic background drives transcriptional variation in human induced pluripotent stem cells.</a> PLoS Genet. 10 (6), e1004432(2014).</li>
<li>Kim, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor+cell+type+can+influence+the+epigenome+and+differentiation+potential+of+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Donor cell type can influence the epigenome and differentiation potential of human induced pluripotent stem cells.</a> Nat Biotechnol. 29 (12), 1117-1119 (2011).</li>
<li>Garitaonandia, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+risk+of+genetic+and+epigenetic+instability+in+human+embryonic+stem+cells+associated+with+specific+culture+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Increased risk of genetic and epigenetic instability in human embryonic stem cells associated with specific culture conditions.</a> PLoS One. 10 (2), e0118307(2015).</li>
<li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+elasticity+directs+stem+cell+lineage+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix elasticity directs stem cell lineage specification.</a> Cell. 126 (4), 677-689 (2006).</li>
<li>Matoba, N., Yamashita, T., Takayama, K., Sakurai, F., Mizuguchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+human+iPS+cell+culture+method+for+efficient+hepatic+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Optimal human iPS cell culture method for efficient hepatic differentiation.</a> Differentiation. 104, 13-21 (2018).</li>
<li>Volpato, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducibility+of+molecular+phenotypes+after+long-term+differentiation+to+human+iPSC-derived+neurons%3A+A+multi-site+omics+study%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Reproducibility of molecular phenotypes after long-term differentiation to human iPSC-derived neurons: A multi-site omics study.</a> Stem Cell Rep. 11 (4), 897-911 (2018).</li>
<li>Anderson, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Balancing+serendipity+and+reproducibility%3A+Pluripotent+stem+cells+as+experimental+systems+for+intellectual+and+developmental+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Balancing serendipity and reproducibility: Pluripotent stem cells as experimental systems for intellectual and developmental disorders.</a> Stem Cell Rep. 16 (6), 1446-1457 (2021).</li>
<li>Sepac, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+cardiomyogenic+potential+among+human+ESC+and+iPSC+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Comparison of cardiomyogenic potential among human ESC and iPSC lines.</a> Cell Transplant. 21 (11), 2523-2530 (2012).</li>
<li>Laco, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+the+inconsistencies+of+cardiac+differentiation+efficiency+induced+by+the+GSK3%CE%B2+inhibitor+CHIR99021+in+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Unraveling the inconsistencies of cardiac differentiation efficiency induced by the GSK3β inhibitor CHIR99021 in human pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Rep. 10 (6), 1851-1866 (2018).</li>
<li>Volpato, V., Webber, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Addressing+variability+in+iPSC-derived+models+of+human+disease%3A+guidelines+to+promote+reproducibility%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Addressing variability in iPSC-derived models of human disease: guidelines to promote reproducibility.</a> Dis Model Mech. 13 (1), 042317(2020).</li>
<li>Hu, B. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+follows+developmental+principles+but+with+variable+potency%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 107 (9), 4335-4340 (2010).</li>
<li>Huo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+batch+variations+in+induced+pluripotent+stem+cell-derived+human+cardiomyocytes+from+2+major+suppliers%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Sci%22%5BJournal%5D)">Evaluation of batch variations in induced pluripotent stem cell-derived human cardiomyocytes from 2 major suppliers.</a> Toxicol Sci. 156 (1), 25-38 (2017).</li>
<li>Rostam, H. M., Reynolds, P. M., Alexander, M. R., Gadegaard, N., Ghaemmaghami, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+based+machine+learning+for+identification+of+macrophage+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Image based machine learning for identification of macrophage subsets.</a> Sci Rep. 7 (1), 3521(2017).</li>
<li>Christiansen, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+silico+labeling%3A+Predicting+fluorescent+labels+in+unlabeled+images%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">In silico labeling: Predicting fluorescent labels in unlabeled images.</a> Cell. 173 (3), 792-803 (2018).</li>
<li>Buggenthin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+identification+of+hematopoietic+lineage+choice+by+deep+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Prospective identification of hematopoietic lineage choice by deep learning.</a> Nat Methods. 14 (4), 403-406 (2017).</li>
<li>Smith, Z. D., Nachman, I., Regev, A., Meissner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+single-cell+imaging+of+direct+reprogramming+reveals+an+early+specifying+event%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Dynamic single-cell imaging of direct reprogramming reveals an early specifying event.</a> Nat Biotechnol. 28 (5), 521-526 (2010).</li>
<li>Fan, K., Zhang, S., Zhang, Y., Lu, J., Holcombe, M., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+machine+learning+assisted%2C+label-free%2C+non-invasive+approach+for+somatic+reprogramming+in+induced+pluripotent+stem+cell+colony+formation+detection+and+prediction%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A machine learning assisted, label-free, non-invasive approach for somatic reprogramming in induced pluripotent stem cell colony formation detection and prediction.</a> Sci Rep. 7 (1), 13496(2017).</li>
<li>Kusumoto, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+deep+learning-based+system+to+identify+endothelial+cells+derived+from+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Automated deep learning-based system to identify endothelial cells derived from induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Rep. 10 (6), 1687-1695 (2018).</li>
<li>Zhu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+learning-based+predictive+identification+of+neural+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Deep learning-based predictive identification of neural stem cell differentiation.</a> Nat Commun. 12 (1), 2614(2021).</li>
<li>Qian, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+imaging+for+quality+control+of+cardiomyocyte+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Label-free imaging for quality control of cardiomyocyte differentiation.</a> Nat Commun. 12 (1), 4580(2021).</li>
<li>Ounkomol, C., Seshamani, S., Maleckar, M. M., Collman, F., Johnson, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+prediction+of+three-dimensional+fluorescence+images+from+transmitted-light+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Label-free prediction of three-dimensional fluorescence images from transmitted-light microscopy.</a> Nat Methods. 15 (11), 917-920 (2018).</li>
<li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+live-cell+image-based+machine+learning+strategy+for+reducing+variability+in+PSC+differentiation+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Discovery%22%5BJournal%5D)">A live-cell image-based machine learning strategy for reducing variability in PSC differentiation systems.</a> Cell Discovery. 9 (1), 53(2023).</li>
<li>Selvaraju, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Grad-CAM%3A+Visual+explanations+from+deep+networks+via+gradient-based+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+IEEE+Int+Conf+Computer+Vision+%28ICCV%29%22%5BJournal%5D)">Grad-CAM: Visual explanations from deep networks via gradient-based localization.</a> Proc IEEE Int Conf Computer Vision (ICCV). , 618-626 (2017).</li>
<li>Isola, P., Zhu, J. -Y., Zhou, T., Efros, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image-to-image+translation+with+conditional+adversarial+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+IEEE+Conf+Computer+Vision+Pattern+Recognition+%28CVPR%29%22%5BJournal%5D)">Image-to-image translation with conditional adversarial networks.</a> Proc IEEE Conf Computer Vision Pattern Recognition (CVPR). , 5967-5976 (2017).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ResNeSt%3A+Split-attention+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+IEEE%2FCVF+Conf+Computer+Vision+Pattern+Recognition+Workshops+%28CVPRW%29%22%5BJournal%5D)">ResNeSt: Split-attention networks.</a> Proc IEEE/CVF Conf Computer Vision Pattern Recognition Workshops (CVPRW). , 2735-2745 (2022).</li>
<li>Halabi, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-activatable+cell+tracker+for+controlled+and+prolonged+single-cell+labeling%29%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Dual-activatable cell tracker for controlled and prolonged single-cell labeling).</a> ACS Chem. Biol. 15 (6), 1613-1620 (2020).</li>
<li>Hannan, N. R. F., Segeritz, C. -P., Touboul, T., Vallier, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+hepatocyte-like+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Production of hepatocyte-like cells from human pluripotent stem cells.</a> Nat Protoc. 8 (2), 430-437 (2013).</li>
<li>Zhang, H., Shen, M., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+quiescent+cardiac+fibroblasts+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of quiescent cardiac fibroblasts derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Methods Mol Biol. 2454, 109-115 (2022).</li>
<li>Harding, M. J., McGraw, H. F., Nechiporuk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+and+regulation+of+multicellular+rosette+structures+during+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The roles and regulation of multicellular rosette structures during morphogenesis.</a> Development. 141 (13), 2549-2558 (2014).</li>
<li>Najm, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+robust+generation+of+functional+oligodendrocyte+progenitor+cells+from+epiblast+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid and robust generation of functional oligodendrocyte progenitor cells from epiblast stem cells.</a> Nat Methods. 8 (11), 957-962 (2011).</li>
<li>Hogrebe, N. J., Maxwell, K. G., Augsornworawat, P., Millman, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+insulin-producing+pancreatic+%CE%B2+cells+from+multiple+human+stem+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of insulin-producing pancreatic β cells from multiple human stem cell lines.</a> Nat Protoc. 16 (9), 4109-4143 (2021).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0,25% di tripsina-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td>I digestati diluiti sono stati utilizzati per la digestione di CPC e CM</td></tr><tr><td>Paraformaldeide al 4% in PBS</td><td>KeyGEN BioTECH</td><td>KGIHC016</td><td></td></tr><tr><td>Piastra per colture cellulari a 6 pozzetti</td><td>NEST</td><td>703001</td><td></td></tr><tr><td>Piastra per colture cellulari a 96 pozzetti</td><td>NEST</td><td>701001</td><td></td></tr><tr><td>Integratore B27</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Integratore B27 Minus Insulin</td><td>Gibco</td><td>A1895601</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA)</td><td>GPC BIOTECH</td><td>AA904-100G</td><td></td></tr><tr><td>Celldiscoverer 7</td> Strumenti <td>Zeiss</td><td>utilizzati per acquisire immagini in campo chiaro durante la differenziazione e immagini cTnT finali</td>CHIR99021 Selleck S1263 DMEM/F12 Gibco 12634010 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo secondario altamente adsorbito anti-topo d'asino (H+L), Alexa Fluor 488</td><td>Thermo</td><td>A-21202</td><td>Anticorpo</td></tr><tr><td>secondario FACSAria III</td><td>BD Biosciences</td><td>Selezionatore per citometria</td><td></td> a flusso</tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>VISTECH</td><td>SE100-B</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>YEASEN</td><td>40732ES03</td><td></td></tr><tr><td>Terreno chimico-definito con cellule staminali pluripotenti umane</td><td>Cauliscell Inc</td><td>400105</td><td>Terreno basale di preparazione PSC</td></tr><tr><td>iPS-18</td><td>TaKaRa</td><td>Y00300</td><td></td></tr><tr><td>iPS-B1</td><td>Cellapy</td><td>CA4025106</td><td></td></tr><tr><td>iPS-F</td><td>Nuwacell</td><td>RC01001-B</td><td></td></tr><tr><td>iPS-M</td><td>Nuwacell</td><td>RC01001-A</td><td></td></tr><tr><td>IWR1-1-endo</td><td>Selleck</td><td>S7086</td><td>IWR1</td></tr><tr><td>Jupyter Notebook</td><td>N/ A</td><td>Versione 6.4.0</td><td><a href="https://jupyter.org/">https://jupyter.org/</a></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>Versione R2020a</td><td>Software per il calcolo scientifico e l'annotazione delle immagini</td></tr><tr><td>Matrigel Matrix</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>Matrigel</td></tr><tr><td>Topo monoclonale IgG1 anti-cTnT</td><td>Thermo</td><td>MA5-12960</td><td>cTnT anticorpo primario</td></tr><tr><td>Asino normale Serum</td><td>Jackson</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>ORCA-Flash 4.0 V3 fotocamera CMOS digitale</td><td>Hamamatsu</td><td>C13440-20CU</td><td>La fotocamera digitale assemblata su Celldiscoverer7</td></tr><tr><td>PBS</td><td>NEB</td><td>21-040-CVR</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Pluripotenza Crescita Mater 1 terreno basale</td><td>Cellapy</td><td>CA1007500-1</td><td>terreno basale di PSC terreno di coltura</td></tr><tr><td>Pluripotenza Supplemento Mater di crescita 1</td><td>Cellapy</td><td>CA1007500-2</td><td>Supplemento del terreno di coltura PSC</td></tr><tr><td>Prism</td><td>Graphpad</td><td>Versione 8/9</td><td>Software statistico per l'analisi statistica e il tracciato</td></tr><tr><td>Python</td><td>N/A</td><td>versione 3.6</td><td>Ambiente Python 3 per il calcolo scientifico, con pacchetti pytorch (1.9.0), numpy, scipy, pandas, visdom, scikit-learn, scikit-image, OpenCV-Python e matplotlib Software per il calcolo scientifico e l'annotazione delle immagini.</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>11875176</td><td></td></tr><tr><td>Supplemento hPSC-CDM (500x)</td><td>Cauliscell Inc</td><td>00015</td><td>Supplemento del terreno di preparazione PSC</td></tr><tr><td>TiE</td><td>Nikon</td><td></td><td>Un microscopio a fluorescenza invertito (con modifica) per la purificazione regionale</td></tr><tr><td>Triton&nbsp; X-100</td><td>Amresco</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Versene Solution</td><td>Thermo</td><td>15040066</td><td>soluzione EDTA per digestione PSC</td></tr><tr><td>Y27632</td><td>Selleck</td><td>S6390</td><td></td></tr><tr><td>Zen</td><td>Zeiss</td><td>Versione 3.1</td><td>Un software di supporto di Celldiscoverer7 per l'acquisizione, l'elaborazione e l'analisi delle immagini</td></tr></tbody></table>

una strategia di apprendimento automatico basata su immagini di cellule vive per monitorare la differenziazione delle cellule staminali pluripotenti

A Live-cell Image-Based Machine Learning Strategy to Monitor Pluripotent Stem Cell Differentiation

Sulla base dell'imaging in campo chiaro e del ML, il processo di differenziazione complessivo può essere monitorato e ottimizzato in modo intelligente. Nella fase di PSC, abbiamo sviluppato un modello ML in grado di prevedere l'efficienza di differenziazione finale in base alle caratteristiche morfologiche delle colonie iniziali di PSC, per determinare il punto temporale più adatto o appropriato per iniziare la differenziazione (Figura 4A, B). L'efficienza di differenziazione prevista dal modello della foresta casuale è altamente correlata con l'efficienza di differenziazione reale ( r di Pearson = 0,76, P &lt; 0,0001) (Figura 4B). Il modello sottoposto a training evidenzia anche le funzionalità più importanti per la differenziazione. Tra tutte le caratteristiche morfologiche della colonia, la deviazione standard, il rapporto minimo e min/max delle distanze centro-contorno (CCD), così come la circonferenza, l'area, il rapporto area/circonferenza, la convessità e la circolarità, sono le 8 caratteristiche con il peso più importante. La relazione tra queste caratteristiche e l'efficienza finale suggerisce che le colonie iniziali di PSC con area moderata e con periferie più lunghe e irregolari tendevano a possedere una maggiore efficienza di differenziazione (Figura 4A), il che ci ispira a migliorare l'efficienza di differenziazione aumentando il tempo di processazione della soluzione di digestione per produrre colonie più piccole con confini più lunghi e irregolari (vedi fase del protocollo 1.3.1). Il monitoraggio basato su ML delle colonie di PSC e le operazioni di passaggio cellulare ottimizzate realizzano l'ottimizzazione dello stato cellulare iniziale.
Nella fase I del differenziamento cardiaco, abbiamo valutato e regolato la dose di CHIR (un induttore per il differenziamento cardiaco precoce) utilizzando ML. Utilizzando la regressione logistica, la dose di CHIR può essere valutata precocemente utilizzando immagini in campo chiaro time-lapse 0-12 ore. Il classificatore di regressione logistica raggiunge un'accuratezza del 93,1%, una precisione dell'88,7%, un richiamo del 94,5%, un punteggio F1 del 91,1% e un'AUC del 97,2% quando la durata dell'analisi chir è impostata su 24 ore. I punteggi di deviazione (risultato previsto) sono altamente correlati con la "concentrazione di ΔCHIR" (risultato vero) per ciascuna condizione di dose di CHIR negli esperimenti ( r di Pearson = 0,82, P &lt; 0,0001) (Figura 4C, D), suggerendo che la previsione ML può riflettere la deviazione delle dosi di CHIR dall'ottimale. Con una valutazione precoce delle dosi di CHIR, possiamo regolare la durata o la concentrazione del trattamento CHIR verso l'ottimale prima delle 48 ore, consentendoci di correggere prontamente la traiettoria cellulare disdifferenziata e sostenere la differenziazione CM in alta efficienza.
Abbiamo anche costruito modelli ML per riconoscere CPC e CM in modo informativo da immagini in campo chiaro allo stadio II e allo stadio III di differenziazione (Figura 5A-D). Inserendo immagini in campo chiaro di cellule vive, i modelli ML addestrati possono prevedere la distribuzione regionale di CPC e CM e valutare l'efficienza di differenziazione finale in modo non invasivo. Per il riconoscimento CPC, le maschere di segmentazione CPC previste da ResNeSt e Grad-CAM corrispondono alle maschere annotate manualmente (Figura 5A), con un IoU medio del 59,0%. La proporzione prevista di regioni CPC può anche servire come indicatore per l'efficienza di differenziazione finale (r di Pearson = 0,88, P &lt; 0,0001) (Figura 5B). Per il riconoscimento CM, il modello pix2pix può generare immagini di fluorescenza cTnT simili alle immagini di fluorescenza cTnT vere (ottenute sperimentalmente) (Figura 5C), con un'elevata correlazione tra l'indice di efficienza di differenziazione a pozzetto intero previsto e vero (r di Pearson = 0,93, P &lt; 0,0001) (Figura 5D). Questo approccio evita danni irreversibili alle cellule causati dalla colorazione in immunofluorescenza o dal flow sorting. Sulla base di una sonda fotoattivata (DACT-1), siamo riusciti a ottenere un'efficiente purificazione della CPC selettiva per regione senza biomarcatori (Figura 5E, F), consentendo così la purificazione in tempo reale del tipo di cellula desiderato durante il processo di differenziazione.
Pertanto, sfruttando l'imaging in campo chiaro su cellule vive e il ML, la metodologia realizza la previsione del lignaggio cellulare in tempo reale e la valutazione dell'efficienza nell'intero processo di differenziazione, modulando e stabilizzando la differenziazione di PSC.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66823/66823fig01.jpg"> 
Figura 1: Schema del flusso di lavoro di differenziazione CM assistito da ML. Lo sperimentatore esegue la differenziazione cardiaca e ottiene immagini di cellule in campo chiaro time-lapse da un microscopio; le immagini in ogni fase della differenziazione CM vengono passate ai modelli ML addestrati per la previsione; Utilizzando la previsione come feedback, gli sperimentatori modulano e ottimizzano lo schema di differenziazione in tempo reale per ottenere una differenziazione stabile e ad alta efficienza. Barra della scala = 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66823/66823fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66823/66823fig02.jpg"> 
Figura 2: Acquisizione di immagini cellulari. (A) Esempio di un'immagine di cellule vive in campo chiaro dallo stadio PSC con confluenza cellulare del 70%. (B) Esempio di un'immagine di cellule vive in campo chiaro dallo stadio PSC con confluenza cellulare dell'80-90%. (C) Esempio di un'immagine in campo chiaro di cellule vive dallo stadio CPC. (D) Esempio di un'immagine di cellule vive in campo chiaro dallo stadio CM. (E) Esempio di campo chiaro e fluorescenza dopo colorazione in immunofluorescenza dallo stesso campo visivo. (A-E) Barra della scala = 250 μm. Abbreviazioni: PSC = cellula staminale pluripotente; CPC = cellula progenitrice cardiaca; CM = cardiomiocita; cTnT = troponina T. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66823/66823fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66823/66823fig03.jpg"> 
Figura 3: Schermate per l'utilizzo del ML. (A-C) Schermate rappresentative per il ML nella fase PSC, tra cui (A) preparazione del set di dati, (B) test delle prestazioni del modello e (C) interpretazione dell'importanza delle funzionalità. (D-F) Screenshot rappresentativi per ML nella fase I, tra cui (D) preparazione del set di dati e valutazione del modello (E,F). (G-I) Screenshot rappresentativi per ML nella fase II, tra cui (G) preparazione del set di dati, (H) training del modello e (I) valutazione del modello. (J-L) Screenshot rappresentativi per ML nella fase III, tra cui (J) addestramento del modello e valutazione del modello (K,L). Abbreviazioni: ML = apprendimento automatico; PSC = cellula staminale pluripotente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66823/66823fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66823/66823fig04.jpg"> 
Figura 4: Risultati rappresentativi allo stadio PSC e allo stadio I per la differenziazione CM basata su ML. (A) Risultati della visualizzazione delle caratteristiche allo stadio PSC. Viene mostrata la relazione tra l'efficienza di differenziazione e le otto caratteristiche più importanti. L'importanza delle funzionalità è determinata dal modello di Machine Learning sottoposto a training. La gamma di ogni funzione è suddivisa in 20 contenitori. Gli indici di efficienza di differenziazione per i pozzetti all'interno di ciascun contenitore sono calcolati in media e visualizzati per colore. L'andamento del cambiamento di colore rappresenta il modo in cui ogni caratteristica morfologica influenza l'efficienza di differenziazione finale. Questi risultati insieme suggeriscono che un'area moderata, circonferenze più lunghe, distanze più variabili del contorno centrale, una circolarità inferiore e una convessità più elevata sono più favorevoli alla differenziazione. (B) Valutazione delle prestazioni del ML nella fase PSC mediante analisi di correlazione tra l'indice di efficienza di differenziazione vero e quello previsto. L'elevata correlazione indica che il potenziale di differenziazione delle colonie di PSC può essere previsto dalle sue caratteristiche morfologiche. n = 584 pozzi. (C) Valutazione delle prestazioni del ML nella fase I utilizzando l'analisi di correlazione tra i punteggi di deviazione previsti e le vere concentrazioni di ΔCHIR per ciascuna condizione di dose di CHIR in un lotto. I punteggi di deviazione (compresi tra -1 e 1) sono previsti in modo non invasivo da ML utilizzando flussi di immagini in campo chiaro di 0-12 ore. Le concentrazioni di ΔCHIR (..., -4 μM, -2 μM, 0, 2 μM, 4 μM, ...) sono determinate sperimentalmente dai risultati finali della differenziazione per misurare la deviazione effettiva dalle condizioni ottimali per ciascuna condizione CHIR. I punteggi di deviazione previsti sono altamente indicativi delle effettive concentrazioni di ΔCHIR, suggerendo che la previsione del ML può fungere da segnale per la valutazione e l'aggiustamento della dose di CHIR. Le caselle blu e rosse rappresentano rispettivamente le condizioni di sottodosaggio e sovradosaggio. (D) Valutazione delle prestazioni del ML nella fase I utilizzando la convalida cross-batch. In ogni round, un batch viene utilizzato per i test mentre gli altri sono per l'addestramento, per testare la capacità di generalizzazione dei modelli ML su nuovi batch. Viene condotta un'analisi di correlazione tra i punteggi di deviazione previsti e le concentrazioni di ΔCHIR reali (di durata inferiore a 24 ore). Il colore dei punti rappresenta diversi lotti di test. n = 20 dosi CHIR. Questa cifra è stata presa da Yang et al.35. Abbreviazioni: ML = apprendimento automatico; PSC = cellula staminale pluripotente; CHIR = CHIR99021. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66823/66823fig04large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66823/66823fig05.jpg"> 
Figura 5: Risultati rappresentativi allo stadio CPC e allo stadio CM per la differenziazione CM basata su ML. (A) Risultato tipico di ML per il riconoscimento CPC allo stadio II. Sono mostrate le immagini di fluorescenza cTnT reali del giorno 12 (a sinistra), le regioni CPC annotate manualmente (al centro) e le regioni CPC previste da ML utilizzando immagini in campo chiaro il giorno 6 (a destra). I risultati previsti assomigliano molto ai risultati sperimentali effettivi. Barra della scala = 1 mm. (B) Valutazione delle prestazioni del ML allo stadio II utilizzando l'analisi di correlazione tra il vero indice di efficienza di differenziazione (dalle etichette di fluorescenza cTnT del giorno 12) e la percentuale prevista di regioni CPC (dalle immagini in campo chiaro del giorno 6). L'elevata correlazione suggerisce che l'efficienza di differenziazione può essere prevista in modo non invasivo allo stadio II. Gli indici di efficienza di differenziazione reale sono normalizzati tra lo 0% e il 100%. n = 35 pozzi. (C) Risultato tipico del ML per il riconoscimento del CM nella fase III. Sono mostrati i risultati della fluorescenza cTnT reale (a sinistra), i risultati della fluorescenza cTnT previsti (al centro) e la mappa di calore per confrontare le intensità di fluorescenza previste e reali a ciascun pixel (a destra). Le immagini a fluorescenza vengono ridimensionate a 512 x 512 pixel e i numeri nei contenitori della mappa di calore rappresentano i conteggi di frequenza dei pixel per 100. Una grande percentuale di pixel si trova lungo la linea diagonale della mappa di calore, indicando che le intensità di fluorescenza previste e reali sono vicine. Barra della scala = 1 mm. (D) Valutazione delle prestazioni di ML allo stadio III utilizzando l'analisi di correlazione tra gli indici di efficienza di differenziazione veri e previsti. Gli indici di efficienza di differenziazione veri e previsti sono normalizzati tra lo 0% e il 100%. n = 36 pozzi. (E) Effetto di purificazione CPC identificato con immagine del giorno 6. Dopo la FACS e 6 giorni di coltura, i CPC identificati con immagine non marcata mostrano un'elevata purezza CM rispetto ai non CPC marcati con DACT-1 e alle cellule del gruppo di controllo (CTL). Barra della scala = 100 μm. (F) Analisi quantitativa dell'effetto di purificazione confrontando la percentuale di cellule cTnT+ in (E). I dati sono mezzi ± SD. n = 5 immagini. * P &lt; 0,05; P &lt; 0,0001 mediante ANOVA unidirezionale seguita dai test di confronto multipli di Dunnett. Questa cifra è stata presa da Yang et al.35. Abbreviazioni: ML = apprendimento automatico; PSC = cellula staminale pluripotente; CPC = cellula progenitrice cardiaca; CM = cardiomiocita; cTnT = troponina T. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66823/66823fig05large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">Problema osservato</td>
			<td colspan="4">Possibile motivo</td>
			<td colspan="5">Soluzione</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">I modelli ML non funzionano bene nel set di training.</td>
			<td colspan="4">1. L'addestramento del modello ML non converge bene. 2. Per il ML tradizionale, le caratteristiche dell'immagine estratta non sono sufficientemente informative per riflettere gli stati e i lignaggi delle cellule. 3. Per l'apprendimento profondo, la potenza di rappresentazione della rete neurale progettata non è sufficiente per eseguire il compito. 4. Il compito stesso è difficile da imparare.</td>
			<td colspan="5">1. Regolare gli iperparametri, ad esempio aumentare il numero di epoche e modificare la velocità di apprendimento. 2. Osservare le immagini per trovare indizi morfologici sugli stati cellulari. Progetta caratteristiche biologicamente plausibili. 3. Modificare l'architettura di rete per aumentarne la complessità. 4. Esaminare il set di dati e assicurarsi che le caratteristiche delle cellule target possano essere facilmente identificate. Se il modello non riesce ad apprendere l'attività, provare ad applicare il machine learning in una fase in cui gli indizi di imaging sono più chiari o a progettare un'attività più semplice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">I modelli ML non offrono prestazioni ottimali nel set di training, ma non nel set di test.</td>
			<td colspan="4">1. Il modello si adatta al set di addestramento.</td>
			<td colspan="5">1. Arricchire i set di dati di training e riqualificare il modello. Aumenta la diversità dei set di dati di addestramento includendo più linee cellulari, condizioni di differenziazione e condizioni di imaging. Per il ML tradizionale, l'uso della selezione delle funzionalità per ridurre il numero di funzionalità di input può anche aumentare la capacità di generalizzazione del modello.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">I modelli ML non funzionano bene su nuovi lotti o nuove linee cellulari.</td>
			<td colspan="4">1. Il microscopio e i parametri di imaging cambiano. 2. Le caratteristiche morfologiche di diverse linee cellulari potrebbero essere diverse.</td>
			<td colspan="5">1. Assicurarsi che il dispositivo di imaging sia lo stesso di quello durante l'addestramento del modello. 2. Raccogliere i dati etichettati acquisiti da nuove linee cellulari e/o nuove condizioni di imaging, riqualificare o mettere a punto i modelli ML.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">La modulazione guidata da ML del processo di differenziamento non sembra migliorare il risultato della differenziazione.</td>
			<td colspan="4">1. L'output ML è impreciso. 2. Esistono problemi nei reagenti o nelle procedure sperimentali. 3. La linea cellulare ha problemi di fondo, mancando della capacità di differenziarsi.</td>
			<td colspan="5">1. Tentare i passaggi per la risoluzione dei problemi sopra menzionati. 2. Ispezionare i reagenti di laboratorio e le procedure sperimentali. 3. Cambia le linee cellulari.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">La contaminazione di tipo cellulare esiste ancora dopo la purificazione.</td>
			<td colspan="4">1. Risultati di previsione imprecisi. 2. Alcune cellule indesiderate situate ai margini dell'area purificata sono state incapsulate.</td>
			<td colspan="5">1. Ottimizza i risultati previsti dal ML. 2. Utilizzare i risultati previsti dal ML in modo più conservativo, ovvero una riduzione appropriata delle dimensioni della regione CM.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Scarso stato delle celle dopo la purificazione.</td>
			<td colspan="4">1. Fototossicità laser. 2. Processo operativo lento. 3. Danni cellulari causati dalla digestione. 4. Danni alle celle causati dal processo di smistamento del flusso.</td>
			<td colspan="5">1. Elimina le cellule indesiderate tramite irradiazione laser invece delle cellule bersaglio. 2. Funzionamento più veloce. 3. Regolare il metodo di passaggio, ad esempio riducendo la concentrazione di enzimi digestivi. 4. Regolare il metodo di smistamento, ad esempio abbassando la velocità del flusso di celle impostata durante il processo di smistamento.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabella 1: Tabella di risoluzione dei problemi.

Una strategia di apprendimento automatico basata su immagini di cellule vive per monitorare la differenziazione delle cellule staminali pluripotenti

Pluripotent stem cell (PSC) technologies have been widely used in drug discovery, disease modeling, and regenerative medicine.&#160;However, available ...

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Fonte: Gómez-Villafuertes, R., et. Al., Imaging in tempo reale seguito da tracciamento di singole cellule per monitorare la biologia cellulare e la progressione del lignaggio di più popolazioni neurali. J. Vis. Exp. (2017) Il Il video mostra il processo di preparazione, imaging e monitoraggio delle cellule staminali neurali adulte in tempo reale per studiare i comportamenti cellulari, tra cui la divisione e la differenziazione.

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