Name: LPS e morte indotta da ATP dei macrofagi THP-1 differenziati da PMA e sua validazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-03T14:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 12 s
Description: Scopri i meccanismi di morte cellulare nei macrofagi THP-1 differenziati da PMA indotti da LPS e ATP. Questo metodo utilizza citometria a flusso e microscopia elettronica per rivelare pirptosi, apoptosi e necroptosi.

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Esprimiamo il nostro grande apprezzamento a Jiayi Sun e Lu Yang dell'Istituto Innovativo di Medicina Cinese e Farmacia, Università di Medicina Tradizionale Cinese di Chengdu, per l'assistenza con la citometria a flusso, Cuiping Chen del Laboratorio chiave statale delle risorse di medicina cinese sudoccidentale, per l'aiuto con la microscopia elettronica a scansione. Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China [82104491], dalla Natural Science Foundation of Sichuan [2023NSFSC0674] e dalla Post-doctoral Science Foundation of China [2021M693789].

1. Linea cellulare e coltura cellulare
<ol><li>Coltivare la linea cellulare monocitica umana THP-1 in un terreno di coltura completo RPMI-1640 con il 10% di siero fetale bovino, l'1% di penicillina-streptomicina e 0,05 mM di β-mercaptoetanolo. Coltivare le cellule a 37 °C in aria umidificata al 5% di CO2 . Sottocoltura delle cellule ogni 2-3 giorni. NOTA: THP-1 è una cella di sospensione, selezionare per cambiare metà del mezzo per la sub-coltura. Quando si osservano molti frammenti cellulari al microscopio ottico, centrifugare a 300 x g per 3 minuti a temperatura ambiente. Risospendere le cellule nel terreno di coltura cellulare completo fresco preriscaldato.</li>
	<li>Utilizzare le cellule (nei passaggi 4-10) nella fase di crescita logaritmica per tutti gli esperimenti. Quando le cellule sono in buone condizioni e in fase di crescita logaritmica, sono rotonde, luminose, dense e senza grumi e frammenti cellulari al microscopio ottico a 100 x.</li>
</ol>2. Differenziamento delle cellule THP-1
<ol><li>Preparare una soluzione madre di PMA con una concentrazione di 1 mM (sciogliere 1 mg di PMA in 1,62 mL di dimetilsolfossido). Diluire la soluzione madre di PMA con un terreno di coltura cellulare completo fino a una concentrazione finale di 100 nM.</li>
	<li>Raccogliere le cellule nella piastra di coltura in una provetta da centrifuga sterile da 10 mL. Centrifugare a 300 x g per 3 minuti a temperatura ambiente, risospendere le cellule con 3 mL di terreno di coltura completo contenente PMA.</li>
	<li>Aprire il contatore di celle e il software di conteggio. Pipettare 20 μL di sospensione cellulare nella scheda contacellule e inserirla nella scheda contacellule. Fare clic su Anteprima B1, ruotare la manopola in basso a destra dello strumento e regolare la distanza focale per rendere le celle con un centro luminoso con contorni chiari sul software. Fare clic su Conteggio per avviare il conteggio.</li>
	<li>Sulla base dei risultati del conteggio, utilizzare un terreno di coltura completo contenente PMA per regolare la densità cellulare a 1 x 106 cellule/mL. Seminare le cellule in una piastra a 6 pozzetti, incubare la piastra per 24 ore a 37 °C e 5% di CO2 prima di iniziare un ulteriore trattamento.</li>
</ol>3. Trattamento delle cellule THP-1
<ol><li>Preparare una soluzione madre di LPS con una concentrazione di 1 mg/mL (sciogliere 1 mg di LPS in 1 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)). Diluire la soluzione madre di LPS con terreno privo di siero fino a una concentrazione di lavoro finale di 1 μg/mL. Preparare una soluzione madre di Na2ATP con una concentrazione di 500 mM (sciogliere 0,3026 g di ATP in 1 mL di PBS).</li>
	<li>Aspirare il terreno contenente PMA dai pozzetti e lavare con PBS 1x. Aggiungere il terreno senza siero al gruppo di controllo e il terreno senza siero contenente LPS al gruppo di modelli. Incubare la piastra per 6 ore a 37 °C + 5% CO2 prima di procedere con ulteriori trattamenti.</li>
	<li>Dopo 6 ore, aggiungere la soluzione madre di ATP al gruppo modello fino a una concentrazione di lavoro finale di 500 nM. Incubare la piastra per 45 minuti a 37 °C + 5% CO2 prima di procedere.</li>
</ol>4. Analisi di citometria a flusso (Metodo 1)
<ol><li>Preparazione di campioni sperimentali<ol><li>Seminare e incubare le cellule in piastre a 6 pozzetti secondo la fase 2. Stabilire quattro gruppi di controllo senza trattamento: un controllo senza macchie, due controlli a colorazione singola (uno per ogni colorazione) e un controllo a doppia colorazione. Stabilire un gruppo di trattamento e trattare secondo il passaggio 3.</li>
		<li>Dopo il trattamento, aspirare tutto il surnatante dai pozzetti e lavare con PBS 2x. Aggiungere 500 μl di tripsina allo 0,05% (non EDTA) a ciascun pozzetto e incubare nell'incubatore per 30 s.</li>
		<li>Aggiungere 1 mL di terreno di coltura completo RPMI-1640 a ciascun pozzetto per evitare il distacco delle cellule e raccogliere le cellule nella provetta da 5 mL. Centrifugare a 300 x g per 3 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Aggiungere 1 mL di PBS per risospendere le cellule. Mettere le provette con le cellule a bagnomaria a 37 °C per 3 minuti. Centrifugare tutti i campioni a 300 x g per 3 minuti a temperatura ambiente.</li>
		<li>Diluire 200 μl di tampone legante 5x con 800 μl di acqua distillata in 1x tampone legante. Aggiungere 100 μl di tampone legante 1x per risospendere le cellule e trasferire le cellule nella provetta da 5 mL.</li>
		<li>Aggiungere 5 μL di soluzione di Annessina V-PE a una provetta di cellule del gruppo di controllo per 10 minuti e 5 μL di soluzione 7-AAD a un'altra provetta di cellule del gruppo di controllo per 5 minuti (come controlli a colorazione singola separatamente). Agitare delicatamente ogni provetta per mescolare, colorare e incubare i campioni a temperatura ambiente, al riparo dalla luce. Aggiungere 400 μl di PBS a ciascuna provetta e agitare delicatamente per terminare l'incubazione.</li>
		<li>Aggiungere 5 μL di soluzione di Annessina V-PE alle provette rimanenti e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente. Agitare delicatamente ogni provetta per mescolare, colorare e incubare i campioni a temperatura ambiente, al riparo dalla luce. Dopo 5 minuti, aggiungere 5 μL di soluzione di 7-AAD per 5 minuti a temperatura ambiente. Aggiungere 400 μl di PBS a ciascuna provetta e agitare delicatamente per terminare l'incubazione.</li>
		<li>Filtrare la sospensione cellulare utilizzando una rete di nylon da 35 μm che fa parte dei tubi a fondo tondo in polistirene da 5 mL. Posizionare il tubo sul ghiaccio e attendere il test. Mescolare delicatamente prima di eseguire il test e quindi inserirlo nello strumento.</li>
	</ol></li>
	<li>Citometria a flusso<ol><li>Utilizzare un citometro a flusso di selezione cellulare attivato dalla fluorescenza per il test. Aprire il software di analisi dei dati del citometro a flusso e confermare le prestazioni del rivelatore e del laser. Fare clic sul citometro e scegliere Avvio fluidics, attendere che il sistema sia pronto. Escludere le bolle della camera di flusso facendo clic su Citometro > Modalità di pulizia > Cella di flusso Degassosa.</li>
		<li>Fare clic su Esperimento, selezionare in sequenza Nuova cartella, Esperimento, Campione, Tubo e Modifica nome. Una freccia di forma pentagonale davanti al tubo, diventa verde quando si accende.</li>
		<li>Fare clic sull'icona del citometro FACSCelesta (un'icona con un tasto di scelta rapida), selezionare Parametro, quindi selezionare FSC, SSC e segnale PE . Fare clic sull'icona del foglio di lavoro globale (un'icona del tasto di scelta rapida) per stabilire l'istogramma PE. Per il citometro a flusso utilizzato in questo studio, utilizzare PE per l'annessina V a 586 nm e tracciare sull'asse X; PerCP-Cy5.5 per 7-AAD a 700 nm e grafico sull'asse Y.</li>
		<li>Inserire prima il campione di controllo non colorato nello strumento. Fare clic sull'icona di Acquisition Dashboard (un'icona di scelta rapida), acquisire un minimo di 10.000 eventi dalla popolazione desiderata. Escludere i detriti utilizzando un punto di iniezione (P1) su un diagramma a punti FSC-A e SSC-A. Regola la portata alla velocità media e registra i dati. Regolare la tensione per posizionare la popolazione cellulare sulla diagonale dell'istogramma FSC/SSC e fare clic su Riavvia. Regola la portata alla velocità media e registra i dati.</li>
		<li>Fare clic su Tubo successivo, eseguire i controlli di colorazione singola dell'annessina V e del 7-AAD per regolare la compensazione. Esegui le provette rimanenti e raccogli i dati.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Imaging SEM (Metodo 2)
<ol><li>Preparazione di campioni sperimentali<ol><li>Seminare e incubare le cellule in piastre a 6 pozzetti secondo la fase 2 e trattare secondo la fase 3.</li>
		<li>Dopo il trattamento, aspirare tutto il surnatante dai pozzetti e lavare 2 volte con PBS. Aggiungere 500 μl di tripsina allo 0,05% (non EDTA) a ciascun pozzetto e incubare nell'incubatore per 30 s.</li>
		<li>Aggiungere 1 mL di terreno di coltura completo RPMI-1640 a ciascun pozzetto per evitare il distacco delle cellule e raccogliere le cellule nella provetta da 5 mL. Centrifugare a 300 x g per 3 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Fissare le cellule con 500 μL di fissativo per microscopio elettronico (dialdeide glutarica al 2,5%, sali di fosforo 100 mM) per 2 ore a temperatura ambiente, seguite da una notte a 4 °C.</li>
		<li>Preparare la soluzione di allume di cromo: aggiungere 1,0 g di gelatina a 100 ml di acqua ultrapura, riscaldamento a bagnomaria a 70 °C e mescolare uniformemente. Aggiungere 0,05 g di allume di cromo, mescolare uniformemente e filtrare con carta da filtro. Immergere il vetro di copertura pulito in una soluzione di allume di cromo per 2 ore a 37 °C e asciugarlo in forno a 37 °C per un uso successivo. NOTA: Lo scopo è quello di prevenire il distacco delle cellule durante l'esperimento.</li>
		<li>Raccogliere le cellule dalla soluzione fissa. Centrifugare a 300 x g per 3 min a temperatura ambiente. Aggiungere 100 μl di PBS e soffiare via delicatamente le cellule. Lasciare cadere la sospensione della cella sul vetro di copertura, lasciare riposare per 5 minuti. Aspirare tutto il surnatante e lavare 3 volte con PBS per 5 minuti ogni volta. NOTA: L'operazione deve essere eseguita delicatamente per evitare il distacco delle celle. Non agitare energicamente, muoverti lentamente e aggiungere lentamente il liquido lungo il muro.</li>
		<li>Aggiungere 500 μl di fissazione dell'acido osmico all'1% per 1 ora. Aspirare tutto il surnatante e lavare 3 volte con PBS per 5 minuti ogni volta.</li>
		<li>Disidratare i campioni in successione in una serie di concentrazioni di etanolo (EtOH) (30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, 100%) per 15 minuti per soluzione di EtOH. NOTA: I bicchieri copri possono essere conservati in 100% EtOH per diversi giorni a 4 °C ma devono asciugarsi il prima possibile per evitare un'eccessiva disidratazione.</li>
		<li>Accendere l'essiccatore a punto critico, aprire il serbatoio di CO2 e raffreddare la camera a 10 °C. Avvolgere rapidamente il campione con carta da filtro quando la pressione della camera è 0 psi e inserirlo nella camera.</li>
		<li>Aprire la valvola di ingresso, osservare attraverso la finestra di osservazione CO2 , aumentare il livello di CO2 del liquido tra le due linee rosse (non superare il limite superiore), chiudere la valvola di ingresso. Immergere il campione per 10 minuti. Aprire contemporaneamente le valvole di aspirazione e di scarico per equalizzare la CO2 per 1 min (la CO2 liquida sostituisce l'EtOH). Chiudere la valvola di scarico per aumentare il livello di CO2 del liquido nella posizione specificata, chiudere la valvola di aspirazione.</li>
		<li>Impostare la temperatura a 35 °C e la pressione a 1250 psi. Una volta che la temperatura e la pressione si sono stabilizzate, depressurizzare a 100 psi/min. Estrarre il campione quando la pressione della camera è zero e spegnere lo strumento.</li>
		<li>Montare i campioni su portacampioni in alluminio SEM utilizzando nastro conduttivo. Utilizzare un rivestimento sputter per coprire i campioni con uno strato (2-5 nm) di oro.</li>
	</ol></li>
	<li>Imaging<ol><li>Utilizzare il SEM ad emissione di campo freddo ad alta risoluzione per l'imaging. Impostare la tensione di accelerazione del SEM a 3 kV. Impostare la distanza di lavoro su 10 mm. Impostare l'ingrandimento su 1.000x per osservare il panorama. Impostare l'ingrandimento su 5.000x e 20.000x per individuare la membrana plasmatica e visualizzare il campione. NOTA: Il processo di visualizzazione dei macrofagi THP-1 differenziati da PMA tramite SEM è simile ad altri tipi di cellule e tessuti e dipende dagli strumenti utilizzati. La referenza14 fornisce un protocollo SEM dettagliato con video di accompagnamento.</li>
	</ol></li>
</ol>

Analisi dei meccanismi di morte cellulare attivati da LPS/ATP nelle cellule THP-1

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<li>Rao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyroptosis+in+inflammatory+diseases+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Pyroptosis in inflammatory diseases and cancer.</a> Theranostics. 12 (9), 4310-4329 (2022).</li>
<li>Huston, H. C., Anderson, M. J., Fink, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyroptosis+and+the+cellular+consequences+of+gasdermin+pores%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Pyroptosis and the cellular consequences of gasdermin pores.</a> Semin Immunol. 69, 101803(2023).</li>
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<li>Ketelut-Carneiro, N., Fitzgerald, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis%2C+pyroptosis%2C+and+necroptosis-Oh+my%21+The+many+ways+a+cell+can+die%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Apoptosis, pyroptosis, and necroptosis-Oh my! The many ways a cell can die.</a> J Mol Biol. 434 (4), 167378(2022).</li>
<li>Kakarla, R., Hur, J., Kim, Y. J., Kim, J., Chwae, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptotic+cell-derived+exosomes%3A+messages+from+dying+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Apoptotic cell-derived exosomes: messages from dying cells.</a> Exp Mol Med. 52 (1), 1-6 (2020).</li>
<li>Imre, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+death+signalling+in+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Signal%22%5BJournal%5D)">Cell death signalling in virus infection.</a> Cell Signal. 76, 109772(2020).</li>
<li>Zhan, C., Huang, M., Yang, X., Hou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MLKL%3A+Functions+beyond+serving+as+the+Executioner+of+Necroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">MLKL: Functions beyond serving as the Executioner of Necroptosis.</a> Theranostics. 11 (10), 4759-4769 (2021).</li>
<li>Lemke, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+macrophages+deal+with+death%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">How macrophages deal with death.</a> Nat Rev Immunol. 19 (9), 539-549 (2019).</li>
<li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+endotoxin+activates+the+coagulation+cascade+through+gasdermin+D-dependent+phosphatidylserine+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Bacterial endotoxin activates the coagulation cascade through gasdermin D-dependent phosphatidylserine exposure.</a> Immunity. 51 (6), 983-996 (2019).</li>
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<li>Dong, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+cell+surface+expression+of+phosphatidylserine+in+ovarian+carcinoma+effusions+using+the+annexin-V%2F7-AAD+assay%3A+clinical+relevance+and+comparison+with+other+apoptosis+parameters%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of cell surface expression of phosphatidylserine in ovarian carcinoma effusions using the annexin-V/7-AAD assay: clinical relevance and comparison with other apoptosis parameters.</a> Am J Clin Pathol. 132 (5), 756-762 (2009).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

In questo manoscritto, sono stati utilizzati due metodi per rilevare LPS e la morte indotta da ATP dei macrofagi THP-1 differenziati da PMA. È stata utilizzata la doppia colorazione con annessina V/7-AAD e i risultati sono stati analizzati mediante citometria a flusso dalla colorazione complessiva. Come per altre analisi citofluorimetriche, un gruppo di cellule non colorate e due gruppi di cellule colorate singolarmente sono stati impostati per escludere risultati falsi positivi e falsi negativi. I risultati mostrano che dopo la stimolazione di LPS/ATP, diverse cellule hanno perso l'integrità della membrana, indicando che potrebbe essersi verificata la morte cellulare. Questo metodo di rilevamento ci permette di valutare la morte cellulare da cellule intere. Vale la pena notare che la doppia colorazione con annessina V/7-AAD non è sufficiente per distinguere tra piroptosi, apoptosi e necroptosi. Nelle prime fasi di queste tre forme, la PS sarà esposta al di fuori della membrana plasmatica e la colorazione con annessina V è positiva. L'integrità della membrana viene persa durante la fase avanzata di queste tre forme e i risultati della colorazione mostrano una colorazione a doppia positività. Pertanto, abbiamo utilizzato il SEM per osservare ulteriormente le possibili forme di morte cellulare che potrebbero verificarsi.
Nell'apoptosi, si verifica la formazione di pori BAX/BAK sulla membrana esterna mitocondriale, il successivo restringimento cellulare e il blebbing della membrana cellulare. La necroptosi impiega MLKL per aprire i pori nella membrana cellulare, mentre il segnale della piroptosi attiva la gasdermin per formare pori nella membrana cellulare. Vale la pena notare che sia la piroptosi che la necroptosi sono accompagnate dalla rottura della membrana cellulare nella fase finale. Tuttavia, i pori della gasedermina sono molto più grandi dei pori MLKL, quindi i pori della gasdermina non hanno selettività ionica. Le cellule necroptotiche mostrano un significativo rigonfiamento della morfologia15. Alla fine terminano con la rottura della membrana. Indipendentemente dalla via di segnalazione a monte dell'attivazione della permeabilità della membrana cellulare, i cambiamenti nella membrana cellulare accompagnano queste tre forme di morte cellulare. Abbiamo usato il SEM per osservare ulteriormente la membrana cellulare, che fornisce un modo intuitivo per esaminare la morte cellulare. Abbiamo osservato le caratteristiche della piroptosi, tra cui il blebbing della membrana e la membrana di rottura, e la necroptosi, tra cui il rigonfiamento cellulare e la membrana di rottura, coerenti con le caratteristiche studiate da precedenti ricercatori15. Abbiamo osservato il blebbing della membrana e il restringimento cellulare, coerenti con le caratteristiche dell'apoptosi studiate da precedenti ricercatori16.
In studi precedenti, la combinazione di LPS e ATP è stata spesso utilizzata per indurre la piroptosi. È interessante notare che abbiamo osservato caratteristiche di apoptosi e necroptosi. Sebbene tutte e tre le forme possano verificarsi nella morte cellulare indotta da LPS/ATP, studi precedenti hanno dimostrato che la piroptosi rimane la modalità di morte dominante. L'LPS è uno dei pattern molecolari associati ai patogeni più caratterizzati. L'ATP rilasciato dalle cellule morenti, ha un'alta concentrazione all'interno della cellula. L'ATP extracellulare è uno dei pattern molecolari associati al pericolo17. LPS/ATP è un classico metodo di stimolazione in due fasi per indurre la piroptosi. La ricerca ha dimostrato che l'aggiunta di ATP alle cellule stimolate da LPS può attivare rapidamente la caspasi-118, mentre il silenziamento del gene della caspasi-1 può invertire significativamente la morte cellulare indotta da LPS/ATP19. In studi precedenti, abbiamo anche trovato l'attivazione indotta da LPS/ATP di proteine bersaglio apoptotiche e necroptotiche20,21. Sebbene LPS/ATP sia un classico induttore della piroptosi, può anche indurre apoptosi e necroptosi.
In effetti, queste tre forme spesso non esistono in modo indipendente e la diafonia tra gli stadi del segnale. Ad esempio, le proteine gasdermin prendono di mira i mitocondri per promuovere il rilascio di citocromo c e migliorare la via apoptotica mitocondriale22. L'attivazione della caspasi-3 può scindere la gasdermina E e quindi innescare la piroptosi23. Uno studio suggerisce che la segnalazione MLKL/PIPK3 è coinvolta nell'attivazione degli inflammasomi NLRP324. Questo complesso cross-talk ha portato al concetto di PANoptosi, definita come una via infiammatoria programmata di morte cellulare regolata dal complesso PANoptosoma con caratteristiche chiave di piroptosi, apoptosi e/o necroptosi che non possono essere spiegate da nessuna di queste vie di morte cellulare programmata da sola25. Quando è stato proposto il concetto di PANoptosi, gli scienziati hanno descritto il verificarsi della morte cellulare programmata in modo più completo, questo evidenzia anche la complessità della morte cellulare programmata. Nel frattempo, questo indica anche i limiti di questo metodo di ricerca. Sebbene la piroptosi sia considerata dominante nella morte cellulare indotta da LPS/ATP, non è possibile determinare la proporzione di queste forme di morte o se esistano tutte, anche coinvolgendo altre forme di morte programmata. Questa può essere un'area da indagare in futuro.
Questo protocollo si basa sulla LPS e sulla morte indotta da ATP dei macrofagi. Abbiamo descritto un metodo di test dall'insieme all'individuo, che è applicabile anche ad altri modelli e cellule. I risultati indicano che le cellule potrebbero aver subito piroptosi, apoptosi o necroptosi, che non si limita alla piroptosi, aiutando i ricercatori a comprendere meglio la morte cellulare dopo la stimolazione di LPS e ATP e a scegliere un metodo sperimentale migliore. In studi precedenti, l'annessina V/7-AAD o l'annessina V/PI a doppia colorazione erano comunemente usate per indicare l'insorgenza dell'apoptosi26,27, alcuni ricercatori l'hanno utilizzata anche per studiare l'apoptosi28. In effetti, non possiamo distinguere tra i tre tipi di morte cellulare attraverso queste doppie colorazioni. Questo protocollo ricorda ai ricercatori, in particolare ai principianti, che la doppia colorazione con annessina V/7-AAD o annessina V/PI non può valutare il tipo di morte cellulare. Può solo mostrare il danno cellulare e la morte nel suo insieme o indicare che la cellula potrebbe aver subito una qualche forma di morte. In ricerche più mirate, è necessario introdurre un gruppo di controllo che inibisce altre morti per dimostrare che la morte programmata in modo definitivo è a portata di mano. Allo stesso modo, ulteriori ricerche meccanicistiche indagheranno sugli obiettivi critici di diverse morti programmate.
Inoltre, durante la preparazione dell'esperimento, abbiamo scoperto che attualmente esistono molte procedure sperimentali dettagliate per il SEM di cellule aderenti, con poca descrizione delle cellule sospese. Qui forniamo una descrizione più dettagliata del metodo di preparazione del campione per le cellule sospese. Il passaggio 5.5 è un passaggio necessario per facilitare l'immobilizzazione delle cellule sospese sui vetrini delle cellule. Le operazioni successive devono essere eseguite delicatamente per evitare il distacco delle cellule. Oltre alla soluzione di allume di cromo, anche la poli-L-lisina può immobilizzare le cellule.

La morte cellulare è un processo fisiologico fondamentale in tutti gli organismi viventi. Negli ultimi anni, studi sostanziali hanno dimostrato che la morte cellulare è coinvolta nell'immunità e nell'equilibrio all'interno dell'organismo. Studiare la morte cellulare ci aiuta a comprendere meglio l'insorgenza e lo sviluppo delle malattie. Sono state descritte diverse forme di morte cellulare programmata e sono stati identificati alcuni bersagli chiave in questi processi. La piroptosi, l'apoptosi e la necroptosi sono le tre vie di morte cellulare programmata geneticamente definite coinvolte nell'equilibrio interno e nella malattia1.
La piroptosi è caratterizzata dalla formazione di pori di membrana e dal rilascio di contenuto cellulare. Le caspasi attivate o granzimi scindono le gasdermine per separare i loro domini N-terminali, che poi oligomerizzano, si legano alla membrana e formano pori 2,3,4. Il poro di gasdermin fornisce un canale di secrezione atipico attraverso le membrane cellulari, con conseguente risposta cellulare a valle, tra cui il rilascio di contenuto e l'afflusso di ioni 2,3,4. Alla fine, le cellule alla fine subiscono la rottura della membrana plasmatica e la lisi piptotica facilitata dalla ninferina-15. Nell'apoptosi, Bax e Bak attivati formano oligomeri sulla membrana esterna mitocondriale e rilasciano citocromo C, che è regolato da un equilibrio tra proteine proapoptotiche e antiapoptotiche della famiglia BCL-2, caspasi iniziatrici (caspasi-8, -9 e -10) e caspasi effettrici (caspasi-3, -6 e -7)1,6,7. I cambiamenti morfologici dell'apoptosi includono il blebbing della membrana, il restringimento cellulare, la frammentazione nucleare, la condensazione della cromatina e la formazione di corpi apoptotici 6,8. La serina/treonina-proteina chinasi 1 (RIPK3) che interagisce con il recettore e il dominio chinasi a linea mista (MLKL) sono due componenti fondamentali a valle del meccanismo necroptotico1. RIPK3 recluta e fosforila MLKL, p-MLKL oligomerizza, si associa con la membrana cellulare, avvia perforazioni di membrana, provoca afflusso di ioni, aumenta l'osmolarità intracellulare e infine la rottura cellulare 6,9. Gasdermins e MLKL si legano alla membrana plasmatica e mediano rispettivamente la piroptosi e la necroptosi, mentre BAX/BAK media l'apoptosi legandosi alla membrana esterna dei mitocondri6.
Sebbene ogni percorso abbia meccanismi ed esiti specifici, portano a cambiamenti simili sulla membrana cellulare. In circostanze normali, la fosfatidilserina (PS) è localizzata solo nel lembo interno della membrana plasmatica. Tuttavia, nelle prime fasi della piroptosi, dell'apoptosi e della necroptosi, il PS sarà esposto, al di fuori della membrana plasmatica. La caspasi-3/caspasi-7 attiva le famiglie TMEM16 e XKR, che porta a una membrana cellulare asimmetrica ed esternalizza il PS durante l'apoptosi10. L'afflusso di Ca2+ mediato da Gasdermin D e MLKL porta alla perdita della simmetria del doppio strato fosfolipidico sulla membrana cellulare e all'esposizione di PS. L'esposizione avviene prima della perdita dell'integrità della membrana cellulare11,12. Sulla base dei cambiamenti simili nella membrana di questi tre tipi di morte cellulare programmata, utilizziamo la citometria a flusso per analizzare la doppia colorazione dell'annessina V/7-amminoactinomicina D (7-AAD) per rilevare la morte cellulare. L'annessina V, una proteina legante i fosfolipidi calcio-dipendente, ha un'elevata affinità per la PS, che può fungere da sonda sensibile per rilevare la PS esposta sulla superficie della membrana plasmatica13. Il 7-AAD è una colorazione di acido nucleico che non può passare attraverso l'intera membrana cellulare. È simile allo ioduro di propidio (PI), un colorante di acidi nucleici comunemente usato. Hanno caratteristiche di fluorescenza simili, ma 7-AAD ha uno spettro di emissione più ristretto e meno interferenze con altri canali di rivelazione. A causa di queste somiglianze, non è sufficiente distinguere tra piroptosi, apoptosi e necroptosi. Abbiamo usato la citometria a flusso per rilevare la morte cellulare da cellule intere. Un secondo metodo viene utilizzato per catturare la membrana cellulare utilizzando la microscopia elettronica a scansione (SEM) per osservare le possibili forme di morte cellulare nelle singole cellule.
Abbiamo stabilito un modello di deposizione lipidica differenziata da lipopolisaccaride (LPS) e adenosina trifosfato (ATP) indotta da forbolo-12-miristato-13-acetato (PMA) in un modello di macrofagi monociti umani (THP-1) per osservare la morte cellulare. Questo protocollo si concentra sull'osservazione della morte cellulare piuttosto che sullo studio dei meccanismi.

<table><tbody><tr><td>Soluzione di enzima pancreatico allo 0,25% (escluso EDTA)</td><td>BOSTER Biological Technology co.ltd</td><td>PYG0068</td><td></td></tr><tr><td>provetta a fondo tondo in polistirene da 5 mL</td><td>CORNING</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>provetta da centrifuga da 5 mL</td><td>Labgic Technology Co., Ltd.</td><td>BS-50-M</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 6 pozzetti </td><td>Sorfa Life Science Research Co., Ltd</td><td>220100</td><td></td></tr><tr><td>Kit di analisi dell'apoptosi dell'annessina V-PE/7-AAD</td><td>Absin (Shanghai) Tecnologia biologica co.ltd</td><td>abs50007</td><td>Annexin V-PE, 7-AAD, 5× Tampone legante, apoptosi Soluzione di controllo positivo</td></tr><tr><td>per celcoltura CO2 incubatore</td><td>Esco (Shanghai) Enterprise Development Co., Ltd.</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>piatto per colture cellulari, 100 mm</td><td>Sorfa Life Science Research Co., Ltd</td><td>230301</td><td></td></tr><tr><td>Cellometro K2 Contatore cellulare fluorescente</td><td>Nexcelom Bioscience LLC</td><td>Cellometro K2</td><td></td></tr><tr><td>Cellometro SD100 Camere di conteggio</td><td>Nexcelom Bioscience LLC</td><td>CHT4-SD100-002</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd</td><td>L530</td><td></td></tr><tr><td>allume di cromo </td><td>Guangdong Wengjiang Reagente chimico Co., Ltd.</td><td></td><td></td>PA04354</tr><tr><td>occhiali da vista, 9 mm</td><td>Labgic Technology Co., Ltd.</td><td>BS-09-RC</td><td></td></tr><tr><td>essiccatore a punto critico</td><td>Quorum Technologies</td><td>K850</td><td></td></tr><tr><td>dimetilsolfossido BOSTER</td><td>Biological Technology co.ltd</td><td>PYG0040</td><td></td></tr><tr><td>microscopio elettronico fissativo</td><td>Servicebio Technology co.ltd </td><td>G1102</td><td>2,5% dialdeide glutarica, 100 mM sali di fosforo bilancia</td></tr><tr><td>elettronica</td><td>SHIMADZU</td><td>ATX124</td><td></td></tr><tr><td>etanolo assoluto</td><td>Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd</td><td>citometro a flusso 2021033102</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>FACSCanto <img alt="Equazione 1" src="/files/ftp_upload/66831/66831eq01.jpg" style="margine: auto; "></td><td></td></tr>software di <tr><td>analisi per citometria a flusso</td><td>Becton,Dickinson and Company</td><td>BD FACSDivaTM Software</td><td></td></tr><tr><td>gelatina</td><td>Guangdong Wengjiang Chemical Reagent Co., Ltd.</td><td>PA00256 </td><td></td></tr><tr><td>Microscopio elettronico a scansione ad emissione di campo freddo ad alta risoluzione</td><td>TITACHI</td><td>Regulus 8100</td><td></td></tr><tr><td>linea cellulare monocitica umana THP-1</td><td>Procell Life Science&amp; Fornitore verificato - Technology Co., Ltd.</td><td>CL0233</td><td></td></tr><tr><td>microscopio invertito </td><td>Leica Microsystems Co., Ltd</td><td>DMi1</td><td></td></tr><tr><td>IR Vortex Mixer</td><td>VELP Scientifica Srl</td><td>ZX4</td><td></td></tr><tr><td>lipopolisaccaride </td><td>Pechino Solarbio Scienza &amp; Tecnologia Co., Ltd.</td><td>L8880</td><td>LPS è derivato da Escherichia coli 055:B5</td></tr><tr><td>Na2ATP</td><td>Pechino Solarbio Science &amp; Tecnologia Co., Ltd.</td><td>A8270</td><td></td></tr><tr><td>forbolo-12-miristato-13-acetato </td><td>Pechino Solarbio Scienza &amp; Tecnologia Co., Ltd.</td><td>P6741</td><td></td></tr><tr><td>soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>Servicebio Technology co.ltd </td><td>G4202</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta</td><td>Eppendorf AG</td><td>N/A Puntali</td><td></td></tr> per <tr><td>pipette, 10 μ L</td><td>Servicebio Technology co., ltd </td>Puntali per pipette <td>T-10PL</td><td></td></tr><tr><td>, 1 mL</td><td>Servicebio Technology co.ltd </td>Puntali per pipette <td>T-1250L</td><td></td></tr><tr><td>, 200 &amp; L</td><td>Servicebio Technology co., ltd </td><td>T-200L</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 terreno di coltura completo</td><td>Procell Life Science&amp; Fornitore verificato - Technology Co., Ltd.</td><td>CM0233</td><td>RPMI-1640 + 10% FBS + 0,05mM β-mercaptoetanolo + 1% P/S</td></tr><tr><td>RPMI-1640 terreni di coltura </td><td>Shanghai  BasalMedia  Fornitore verificato - Technologies Co., LTD.</td><td></td><td></td>K211104</tr><tr><td>fluido guaina</td><td>BECKMAN COULTER</td><td>8546733</td><td></td></tr><tr><td>sputter coater</td><td>Cressington Scientific Instruments Ltd</td><td>108</td><td></td></tr><tr><td>bagnomaria termostatico</td><td>GUOHUA Electric Appliance CO., Ltd </td><td>HH-1</td><td></td></tr></tbody></table>

lps e morte indotta da atp dei macrofagi thp-1 differenziati da pma e sua validazione

LPS and ATP-induced Death of PMA-differentiated THP-1 Macrophages and its Validation

La morte cellulare è un processo fondamentale in tutti gli organismi viventi. Il protocollo stabilisce una deposizione lipidica differenziata da lipopolisaccaride (LPS) e adenosina trifosfato (ATP) indotta da forbolo-12-miristato-13-acetato (PMA) in un modello di macrofagi monociti umani (THP-1) per osservare la morte cellulare. L'LPS combinato con l'ATP è un classico metodo di induzione infiammatoria, spesso utilizzato per studiare la piroptosi, ma anche l'apoptosi e la necroptosi rispondono alla stimolazione da parte di LPS/ATP. In circostanze normali, la fosfatidilserina è localizzata solo nel lembo interno della membrana plasmatica. Tuttavia, nelle prime fasi della piroptosi, dell'apoptosi e della necroptosi, la membrana cellulare rimane intatta ed esposta alla fosfatidilserina e, nelle fasi successive, la membrana cellulare perde la sua integrità. Qui, la citometria a flusso è stata utilizzata per analizzare la doppia colorazione dell'annessina V e della 7-amminoattinomicina D (AAD) per rilevare la morte cellulare da intere cellule. I risultati mostrano che le cellule sostanziali sono morte dopo la stimolazione con LPS/ATP. Utilizzando la microscopia elettronica a scansione, osserviamo le possibili forme di morte cellulare nelle singole cellule. I risultati indicano che le cellule possono andare incontro a piroptosi, apoptosi o necroptosi dopo la stimolazione con LPS/ATP. Questo protocollo si concentra sull'osservazione della morte dei macrofagi dopo la stimolazione con LPS/ATP. I risultati hanno mostrato che la morte cellulare dopo la stimolazione di LPS e ATP non si limita alla piroptosi e che possono verificarsi anche apoptosi e apoptosi necrotica, aiutando i ricercatori a comprendere meglio la morte cellulare dopo la stimolazione di LPS e ATP e a scegliere un metodo sperimentale migliore.

I campioni di cellule sono stati trattati come descritto nel protocollo ed è stato effettuato il rilevamento con citometria a flusso. Le cellule normali non possono essere colorate con l'annessina V e il 7-AAD (annessina V-/7-AAD-). Nelle prime fasi della piroptosi, dell'apoptosi e della necroptosi, il PS era esposto e legato all'annessina V, ma la membrana cellulare era ancora intatta ed escludeva il 7-AAD dallo spazio extracellulare (annessina V+/7-AAD-). Nelle fasi successive, la membrana cellulare perde la sua integrità, le cellule vengono colorate contemporaneamente con Annessina V e 7-AAD, mostrando risultati doppi positivi (Annessina V+/7-AAD+). Le cellule necrotiche sono state colorate solo con 7-AAD (annessina V-/7-AAD+). La Figura 1 mostra che dopo la stimolazione con LPS/ATP, le cellule nella regione Q2 sono aumentate in modo significativo, indicando la morte cellulare.
Utilizziamo il SEM per catturare la superficie della membrana plasmatica, osservando direttamente le caratteristiche della membrana da una singola cellula. La Figura 2A mostra le cellule di controllo, la Figura 2B-D mostra le cellule dopo la stimolazione di LPS/ATP. Abbiamo osservato cellule con caratteristiche di piroptosi, tra cui blebbing e rottura della membrana (Figura 2B), cellule con caratteristiche apoptotiche, tra cui blebbing della membrana e restringimento cellulare (Figura 2C) e cellule con caratteristiche di necroptosi, tra cui rigonfiamento cellulare e rottura della membrana (Figura 2D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66831/66831fig01.jpg"> Figura 1: Rilevamento della doppia colorazione dell'annessina V/7-AAD mediante citometria a flusso. (A) Colorazione Annestina V negativa e 7-AAD negativa (Q4), Annessina V positiva e 7-AAD negativa doppia colorazione (Q3), Colorazione Annessina V positiva e 7-AAD positiva (Q2) e Colorazione Annessina V negativa e 7-AAD positiva (Q1). (B) Dati quantitativi per (A). I dati sono presentati come media ± SD (n=3), test t non appaiato, **p &lt; 0,01. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66831/66831fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66831/66831fig02.jpg"> Figura 2: Immagini al microscopio elettronico a scansione di macrofagi THP-1 differenziati con PMA. (A) Gruppo di controllo, ingrandimento 5.000x/20.000x. (B, C, D) Il gruppo LPS/ATP mostra blebbing della membrana, rottura della membrana (↑), rigonfiamento cellulare (↑) e restringimento cellulare (↑) con ingrandimento di 5.000x/20.000x. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66831/66831fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Questo protocollo si basa sulla LPS e sulla morte indotta da ATP dei macrofagi THP-1 differenziati da PMA. Utilizziamo la citometria a flusso per analizzare l'annessina V e la doppia colorazione 7-AAD per rilevare la morte cellulare, utilizzando l'intera cellula e impiegando la microscopia elettronica a scansione per osservare la morfologia della membrana cellulare.

LPS e morte indotta da ATP dei macrofagi THP-1 differenziati da PMA e sua validazione

Cell death is a fundamental process in all living organisms. The protocol establishes a lipopolysaccharide (LPS) and adenosine triphosphate (ATP)-induced ...

Stiamo affrontando i decessi introdotti da LPS e ATP di macrofagi THP-1 differenziati da PMA. I decessi introdotti da LPS e ATP non si limitano alla prioptosi, ma possono verificarsi anche apoptosi e necroptosi. Ciò contribuirà a una migliore comprensione della morte cellulare dopo la stimolazione di LPS e ATP e alla scelta di metodi sperimentali più adatti.La tecnologia Cryo-EM studia molte altre strutture nei tessuti, nelle cellule e nei microrganismi. Cryo-EM fornisce dati sulla struttura neo-nativa per diversi complessi molecolari. Ad esempio, l'utilizzo delle tecniche Cryo-Em per eseguire la ricostruzione 3D può aiutarci a comprendere ulteriormente le caratteristiche delle parti apoptotiche e necroptotiche.Sebbene la prioptosi sia considerata dominante nella LPS e nella morte cellulare introdotta da ATP, non è possibile determinare l'appropriazione di queste forme di morte o se esistano tutte. La convalida della morte cellulare diversificata e la loro misurazione saranno la nostra area di indagine in futuro.

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In questo video, dimostriamo il test di efferocitosi per studiare la clearance delle cellule apoptotiche utilizzando la microscopia confocale. L'efferocitosi è un processo in più fasi in cui le cellule apoptotiche vengono inghiottite dai fagociti e degradate all'interno di vescicole chiamate efferosomi. Questo protocollo fornisce un metodo per visualizzare porzioni internalizzate e non internalizzate di singole cellule apoptotiche e quantificare l'efferocitosi.

Saggio di efferocitosi cellulare fissa: un metodo per studiare l'assorbimento efferocitico delle cellule apoptotiche da parte dei macrofagi utilizzando la microscopia a fluorescenza

I macrofagi sono da tempo riconosciuti come una componente critica delle risposte immunitarie innate e adattative. La recente esplosione di conoscenze relative agli aspetti evolutivi, genetici e biochimici dell'interazione tra macrofagi e microbi ha rinnovato l'attenzione scientifica ai macrofagi. Questo articolo descrive un metodo per differenziare macrofagi da midollo osseo di topo.

Derivate dal midollo osseo macrofagi Production

Questo protocollo rappresenta un metodo efficiente e affidabile per transfettare umani THP-1 macrofagi con siRNA o il DNA plasmidico mediante elettroporazione con alta efficienza di trasfezione, pur mantenendo alta la vitalità delle cellule e la piena capacità dei macrofagi per la differenziazione e la polarizzazione.

Trasfezione altamente efficiente di umani THP-1 da macrofagi Nucleofection

Microparticelle di membrana-capannone cellule (MPS) sono vescicole biologici attivi che possono essere isolate e loro effetti fisiopatologici esaminato in vari modelli. Qui si descrive un metodo per la generazione di parlamentari provenienti dai linfociti T (LMPS) e per dimostrare il loro effetto pro-apoptotico sulle cellule epiteliali delle vie aeree.

Generazione di linfocitica microparticelle e rilevamento del loro effetto pro-apoptotico su cellule delle vie aeree epiteliali

Qui, descriviamo la purificazione di Legionella pneumophila (L. pneumophila) vescicole membrana esterna (OMVS) da colture liquide. Tali vescicole purificate sono poi utilizzati per il trattamento dei macrofagi per analizzare il loro potenziale pro-infiammatoria.

Legionella pneumophila membrana esterna Vescicole: Isolamento e analisi del loro potenziale pro-infiammatori sui macrofagi

La segnalazione di TLR (Toll-like receptor) ha un ruolo importante nella fisiopatologia di molte malattie infiammatorie umane e la regolazione delle risposte TLR mediante nanoparticelle bioattive è prevista per essere vantaggiosa in molte condizioni infiammatorie. Le cellule reporter THP-1 forniscono una piattaforma di screening versatile e robusta per identificare nuovi inibitori della segnalazione TLR.

Screening delle nanoparticelle bioattive in cellule immunitarie fagocitiche per gli inibitori della segnalazione di ricetrasmettitori simili

Descriviamo la rilevazione di NLRP3 inflammasome attivazione su base cellulare utilizzando la microscopia a fluorescenza e la macchiatura per active caspasi-1 e l'adattatore, ASC. Un test di rilascio di lattato deidrogenasi è presentato per rilevare pyroptotic lisi su base di popolazione. Queste tecniche possono essere adattate per studiare molti aspetti della biologia inflammasome.

Rilevamento di attivazione Inflammasome e morte delle cellule Pyroptotic in macrofagi murini derivate da midollo osseo

Questo protocollo fornisce ai ricercatori un metodo rapido e indiretto per misurare l'attività del fattore di trascrizione NF-B-B/AP-1 dipendente da TLR in una linea cellulare murina di macrofaci in risposta a una varietà di superfici polimeriche e strati proteici adzuolabili che modellano il microambiente implantare biomateriale.

Un analisi della cella del Macrophage Reporter per esaminare la segnalazione NF-kB/AP-1 mediata da un rata a tollo su superfici polimetiche

I macrofagi associati al tumore M2-like (TAM) sono associati alla progressione del tumore e alla prognosi sfavorevole nel cancro. Questo protocollo serve come guida dettagliata per differenziare e polarizzare in modo riproducibile le cellule simili ai monociti THP-1 in macrofagi simili a M2 entro 14 giorni. Questo modello è la base per studiare gli effetti antinfiammatori della TAM all'interno del microambiente tumorale.

Differenziazione e polarizzazione dei macrofagi in un fenotipo M2-like utilizzando una linea cellulare di leucemia THP-1 simile a un monocita umano

Questo protocollo descrive un metodo completo per valutare l'attivazione della caspasi (caspasi-1, caspasi-3, caspasi-7, caspasi-8, caspasi-9 e caspasi-11) in risposta a modelli di infezione, insulti sterili e cancro sia in vitro che in vivo (nei topi) per determinare l'inizio delle vie di morte cellulare, come piroptosi, apoptosi, necroptosi e PANoptosi.

Valutazione dell'attivazione della caspasi per valutare la morte delle cellule immunitarie innate

Utilizzando un modello ex vivo di espianti, piccoli pezzi della porzione rostrale del tessuto adiposo bianco viscerale di topi magri vengono coltivati per 7–10 giorni, permettendo l'induzione e lo studio dell'infiammazione del tessuto adiposo durante l'alimentazione ricca di grassi.

Un modello topino ex vivo per l'infiammazione del tessuto adiposo ad alto contenuto di grassi

Scopri i meccanismi di morte cellulare nei macrofagi THP-1 differenziati da PMA indotti da LPS e ATP. Questo metodo utilizza citometria a flusso e microscopia elettronica per rivelare pirptosi, apoptosi e necroptosi.

LPS e morte indotta da ATP dei macrofagi THP-1 differenziati da PMA e sua validazione

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