Esecuzione di uno screening CRISPR knockout in vitro a livello di genoma in cellule T del recettore dell'antigene chimerico

La terapia con cellule Car T è un tipo innovativo di immunoterapia del cancro che ha portato a remissioni della durata di oltre un decennio. Tuttavia, i tassi di risposte durature sono ancora limitati. Con questo protocollo, miriamo a migliorare la nostra comprensione dei meccanismi alla base della resistenza e a creare strumenti per migliorare la risposta alla terapia con cellule CAR T.

Molti approcci sono attualmente in fase di impiego per migliorare la terapia con cellule CAR T, comprese le terapie combinate e l'ottimizzazione della progettazione CAR. Tuttavia, a causa della crescente evidenza che il profilo epigenetico dei prodotti a base di cellule T CAR pre-infusione è un'importante risposta determinante, le tecnologie di editing genetico sono diventate strumenti popolari.

L'editing genomico delle cellule CAR T ha dimostrato successo nella prevenzione delle tossicità e nell'aumento dell'espansione e della persistenza delle cellule CAR T negli studi preclinici e clinici. Il nostro protocollo per uno screening CRISPR knockout per l'intero genoma fornisce un approccio efficiente e imparziale per determinare le migliori modifiche genetiche per migliorare la funzione delle cellule T CAR.

Le perturbazioni geniche dell'intero genoma richiedono condizioni di selezione adeguate e su larga scala per essere efficaci. Per studiare lo sviluppo dell'esaurimento delle cellule T CAR, abbiamo appreso che dobbiamo stimolare oltre 80 milioni di cellule T CAR per due settimane per selezionare le modifiche genetiche ottimali.

Mentre il nostro protocollo è stato progettato per valutare lo sviluppo dell'esaurimento, questo protocollo può essere adattato per valutare lo sviluppo di altri meccanismi di resistenza. Completando gli screening dell'intero genoma in diversi contesti, potremmo eventualmente determinare le migliori modifiche per migliorare le risposte complessive alla terapia con cellule CAR T.

[Narratore] Dopo aver trasdotto le cellule T CAR con la libreria CRISPR, centrifugare i campioni a 300 g per cinque minuti a 4 gradi Celsius per lavarli. Aspirare il surnatante e risospendere i campioni in 20 millilitri di terreno di coltura a cellule T. Per conservare i campioni per il sequenziamento di nuova generazione, aliquotare una quantità sufficiente di cellule CAR T in una provetta conica da 50 millilitri per mantenere una rappresentazione dell'RNA guida di 500 cellule per RNA guida. Centrifugare il campione a 300 g per cinque minuti a 4 gradi Celsius. Quindi risospendere il pellet di cella in un millilitro di PBS e trasferirlo in una provetta da microcentrifuga da due millilitri. Lavare la provetta conica da 50 millilitri con un millilitro di PBS e trasferire il lavaggio nella stessa provetta da microcentrifuga. Quindi centrifugare i campioni a 500 g per cinque minuti a 4 gradi Celsius. Rimuovere il surnatante e conservare i pellet delle celle a -20 gradi Celsius. Per avviare la co-coltura, aggiungere cellule CAR T alle cellule JeKo-1 CD19-positive con un rapporto di uno a uno. Portare il volume totale della co-coltura a 160 millilitri con terreno di coltura a cellule T e conservare i campioni in un incubatore a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Per stimolare nuovamente le cellule CAR T, raccogliere le co-colture in provette coniche da 50 millilitri e centrifugare i campioni a 300 g per cinque minuti a 4 gradi Celsius. Risospendere ogni campione in 80 millilitri di terreno di coltura di cellule T e aggiungere 80 volte 10 alla potenza di sei cellule JeKo-1 in 80 millilitri di terreno di coltura di cellule T. Conservare i campioni in un incubatore a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Il giorno 15, per isolare le cellule CAR T dalla co-coltura, contare prima le cellule. Combinare un kit di selezione positiva per le cellule T CD4-positive con un kit di selezione positiva per le cellule T CD8-positive per isolare le cellule T dalle co-colture CAR T JeKo-1. Quindi contare le cellule T isolate. Per conservare i campioni per il sequenziamento di nuova generazione, aliquotare 33 volte 10 alla potenza di sei cellule T CAR in una provetta conica da 50 millilitri e centrifugare il campione a 300 g per cinque minuti a 4 gradi Celsius. Risospendere il pellet di cella in un millilitro di PBS e trasferirlo in una provetta da microcentrifuga da due millilitri. Quindi lavare la provetta conica da 50 millilitri con un millilitro di PBS e trasferire il lavaggio nella stessa provetta da microcentrifuga. Dopo aver centrifugato i campioni e rimosso il surnatante, conservare i pellet cellulari a -20 gradi Celsius. Per iniziare, isolare il DNA genomico da pellet di cellule T CAR congelate utilizzando un kit di isolamento del DNA genomico. Purificare il DNA genomico isolato attraverso la precipitazione dell'etanolo pre-raffreddando prima l'etanolo al 100% a -20 gradi Celsius. Aliquotare il DNA eluito in modo uniforme in diverse provette per microcentrifuga, assicurandosi che ogni aliquota sia compresa tra 200 e 250 microlitri. Aggiungere due volumi di etanolo pre-raffreddato al 100%, 0,1 volumi di acetato di sodio a tre molari e un microlitro di 20 milligrammi per millilitro di glicogeno. Incubare i campioni per una notte a -20 gradi Celsius. Il secondo giorno, centrifugare i campioni a 13.000 g per 20 minuti per pellettare il DNA precipitato. Rimuovere il surnatante e lavare i pellet con un millilitro di etanolo al 70% centrifugando a 7.500 g per 10 minuti. Dopo aver asciugato completamente il pellet, risospendere il pellet in 50 microlitri di acqua sterile. Per preparare il DNA genomico per il sequenziamento di nuova generazione, impostare una PCR con la miscela di reazione specificata mostrata qui. Quindi eseguire la PCR utilizzando le seguenti condizioni di ciclo. Estrarre le reazioni PCR per ciascun campione e purificare il prodotto PCR utilizzando un kit di purificazione PCR secondo le istruzioni del produttore. Eseguire tre microgrammi del prodotto PCR per ogni campione su un gel di agarosio al 2%. Rimuovere il prodotto della PCR dal gel estraendo il DNA utilizzando un kit di estrazione del gel secondo le istruzioni del produttore. Conservare i campioni estratti a -20 gradi Celsius.