Ottimizzazione dell'erogazione di vescicole extracellulari utilizzando un'impalcatura biostampata in 3D con guaina centrale per la gestione delle ferite croniche

Lo scopo della ricerca è quello di sviluppare un design avanzato di medicazione bioattiva per ferite per un'efficace gestione delle ferite croniche. Lo scaffold garantirà il controllo, la degradazione e l'efficiente somministrazione locale delle vescicole extracellulari.

L'attuale protocollo mira a superare i limiti della medicazione convenzionale nella gestione dell'infiammazione cronica. In particolare, la mancanza di controllo, degradazione e rilascio tempestivo delle vescicole extracellulari.

Questo protocollo offre un approccio sintonizzabile per fornire agenti terapeutici, compresi i geni, in modo tempestivo per varie applicazioni.

Tutti i risultati forniscono nuove informazioni sulla personalizzazione di un'impalcatura per vari tipi di ferite e sul miglioramento delle terapie rigenerative caricando le vescicole extracellulari con specifiche molecole bioattive.

Il nostro laboratorio sta per costruire una piattaforma di ricerca traslazionale per affrontare la guarigione delle ferite diabetiche.

[Narratore] Per iniziare, scongelare rapidamente una fiala di cellule staminali mesenchimali in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius. Rimuovere la fiala quando rimane un piccolo frammento di ghiaccio. Trasferire l'intero contenuto del flaconcino di cellule staminali mesenchimali in una provetta conica da 15 millilitri contenente un terreno completo. Centrifugare le celle a 200 G per cinque minuti a temperatura ambiente. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in un millilitro di terreno completo di preriscaldamento. Quindi trasferire le cellule in un pallone T25 contenente quattro millilitri di terreno completo. Inclinare delicatamente il pallone T25 per assicurarsi che le celle siano distribuite uniformemente. Incubare il pallone a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Quando le celle hanno raggiunto il 70-80% di confluenza, aspirare il terreno esaurito dal pallone T25. Aggiungere tre millilitri di PBS fresco al pallone per rimuovere eventuali cellule residue. Quindi, aggiungere un millilitro di soluzione di tripsina allo 0,25% al pallone e incubare. Monitora il distacco delle cellule al microscopio con un ingrandimento di 4x. A questo punto, aggiungere quattro millilitri di terreno di preriscaldamento completo al pallone e pipettare su e giù sulla superficie fino a staccarlo. Quindi trasferire la sospensione cellulare in una centrifuga da 15 millilitri due. Dopo la centrifugazione, risospendere il pellet di cella in un terreno fresco e completo e contare le cellule. Quindi trasferire le cellule in un pallone T75 con una densità di semina di 5.000 cellule per centimetro quadrato. Incubare il pallone T75 a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Dopo 72 ore, raccogliere il terreno condizionato dalle cellule per l'isolamento delle vescicole extracellulari. Per isolare le vescicole extracellulari o EV, centrifugare i 13 millilitri di terreno condizionato raccolto a 800 G per 15 minuti per rimuovere i detriti cellulari. Utilizzare un filtro per siringa da 0,22 micrometri per filtrare il surnatante e rimuovere le particelle di grandi dimensioni. Ora aggiungere cinque millilitri di tampone di precipitazione al mezzo condizionato filtrato. Agitare accuratamente la miscela per assicurarsi che sia omogenea. Incubare la miscela per una notte a quattro gradi Celsius per consentire alle vescicole extracellulari di precipitare. Quindi centrifugare il composto a 3,220 g per 30 minuti a 20 gradi Celsius. Assicurarsi che i tubi siano bilanciati. Scartare con cura il surnatante senza disturbare il pellet e centrifugare nuovamente per cinque secondi. Ora risospende delicatamente il pellet EV in 200 microlitri di PBS per evitare di danneggiare le vescicole. Eseguire il western blotting per rilevare i marcatori specifici delle vescicole extracellulari, inclusi CD63, CD81 e CD9. Preparare una soluzione fresca di alginato di sodio al 4,5% in acqua ultrapura sterile. Mescolare la soluzione per una notte a 60 gradi Celsius per garantire la completa dissoluzione. Successivamente, sciogliere la carbossimetilcellulosa in acqua ultrapura sterile per ottenere una soluzione al 3,8%. Centrifugare gli inchiostri bio preparati a 3.220 g per 10 minuti a 25 gradi Celsius per rimuovere le bolle che potrebbero interferire con il processo di stampa. Ora usa un miscelatore a siringa e mescola tre millilitri della soluzione preparata di alginato di sodio con le vescicole extracellulari marcate o il controllo Dialimmi. Mescolare delicatamente per garantire una sospensione uniforme. Utilizzare un altro miscelatore a siringa per combinare un millilitro di carbossimetilcellulosa con una soluzione di alginato di liasi appena preparata in acqua ultrapura sterile per ottenere una concentrazione finale di 0,5 milliunità per millilitro. Caricare contemporaneamente l'inchiostro bio EV in alginato di sodio nella parte centrale e il bioink in alginato di carbossimetilcellulosa Liasi nella parte della guaina della siringa. Avvia il software della stampante 3D bio. Selezionare una forma cilindrica con un motivo di riempimento diagonale per creare la struttura dell'impalcatura. Impostate il diametro del cilindro su 20 millimetri e l'altezza su 1,1 millimetri. Configurare la dimensione dei pori su un millimetro. Impostare la velocità di pompaggio dell'anima e dell'ugello della guaina su un millimetro al secondo con uno spessore di 0,25 millimetri per strato. Configura la velocità di movimento a sei millimetri al secondo e stampa quattro strati a temperatura ambiente. Utilizzare un umidificatore con aerosol di cloruro di calcio per reticolare l'impalcatura durante il processo di estrusione. Iniziare a stampare l'impalcatura su pellicola di poliestere. Posizionare l'ugello dell'umidificatore a circa 20 centimetri di distanza dalla testa di estrusione per garantire un'efficace reticolazione. Immergere l'impalcatura in una soluzione di cloruro di calcio al 2,2% per 10 minuti per completare la reticolazione. Sciacquare l'impalcatura tre volte con acqua ultrapura sterile per rimuovere l'eccesso di cloruro di calcio e l'inchiostro biologico non legato. Radere la pelle dorsale su un topo diabetico OCTA anestetizzato con un tagliacapelli elettrico evitando irritazioni o lesioni alla pelle. Ora crea una ferita cutanea circolare a tutto spessore di sei millimetri sulla superficie dorsale di ciascun topo. Posizionare delicatamente l'impalcatura 3D Bioprinted contenente vescicole extracellulari marcate con PKH sul letto della ferita. Assicurarsi che l'impalcatura copra completamente la superficie della ferita e premere leggermente con una pinza sterile per ridurre al minimo le sacche d'aria. Trasferire i topi anestetizzati al sistema di imaging IVIS a due, quattro, otto ore e 24 ore dopo l'impianto. Nella procedura guidata di imaging, selezionare l'opzione di imaging a fluorescenza e attivare i filtri di eccitazione ed emissione per il colorante PKH. Regola le impostazioni della fotocamera, incluso il campo visivo e l'altezza del soggetto per ottimizzare il rilevamento del segnale. Inizia ad acquisire le immagini, salva i dati risultanti. Quindi rilascia i segnali fluorescenti dalle EV etichettate. Le EV dell'alginato nell'impalcatura della carbossimetilcellulosa alginato liasi hanno mostrato un profilo di rilascio più rapido rispetto alle EV dell'alginato nella sola carbossimetilcellulosa, in particolare nei punti temporali di due e quattro ore.