Name: Cell-Free Dot Blot come piattaforma di immunodosaggio pratica e adattabile per il rilevamento della risposta anticorpale in sieri umani e animali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-23T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: Scopri la tecnica cell-free dot blot per l'immunodosaggio accessibile e adattabile nei sieri umani e animali. Questo metodo offre una piattaforma diagnostica rapida e conveniente per rilevare risposte anticorpali.

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Tutti gli esperimenti sui criceti sono stati eseguiti presso il National Microbiology Laboratory (NML) presso l'Agenzia per la salute pubblica del Canada, approvati dal Canadian Science Centre for Human and Animal Health e seguendo le linee guida del Canadian Council on Animal Care. Tutti i campioni di siero/plasma umano sono stati ottenuti commercialmente per test interni o forniti da collaboratori clinici all'NML per test indipendenti presso l'NML.
1. Progettazione e preparazione di pattern di espressione lineare (LET) dell'antigene
<ol>
	<li>Progettare i LET di espressione cell-free per l'antigene bersaglio sulla base delle istruzioni di Norouzi et al.7 e contenenti uno SpyTag N/C-terminale come descritto in Norouzi et al.5. NOTA: Qui forniamo i dettagli per la preparazione della proteina nucleocapside SARS-CoV-2 (NP, aminoacidi 2-419).<ol>
		<li>Assicurarsi che il LET per il SARS-CoV-2 NP (Figura 1 e File supplementare 1) contenga siti Ter 5' e 3' con una sequenza di tamponi di 50 coppie di basi prima del promotore T7 e dopo il codone di stop.</li>
		<li>Etichettare la proteina NP sull'N-terminale con il suo 6-SpyTag-TEV.</li>
		<li>Ottenere la sequenza proteica dal database UniProt (codice di accesso P0DTC9) e ottimizzarla per l'espressione basata su E. coli utilizzando lo strumento di ottimizzazione del codone IDT8. Ordina questa sequenza per la sintesi commerciale come un frammento di DNA a filamento singolo risospeso in acqua a 10 ng/μL. NOTA: Il sito di scissione della proteasi TEV e il tag His6 non sono caratteristiche essenziali nel progetto LET.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>La PCR amplifica il frammento di DNA con il Ter FW universale (GGCTCCGAATAAGTATGTTGTAACTAAAGTGCGGCC ACGATGCGTCCGGCGTAGAGGATCG) e Ter RV (CCGAGGCAATAAGTATGTTGTAACTAAAGTGCTCAG CTTCCTTTCGGGCTTTGTTAGCAGCC) utilizzando il kit DNA polimerasi ad alta fedeltà (vedere la Tabella dei materiali)<ol>
		<li>Impostare una reazione da 100 μL come segue: 75 μL di acqua priva di nucleasi, 20 μL di tampone DNA polimerasi 5x, 2 μL di dNTP da 10 mM (concentrazione finale 200 μM), 0,5 μL di primer Ter-FW da 100 μM, 0,5 μL di primer Ter-RV da 100 μM, 1 μL di LET a filamento singolo da 10 ng/μL, 1 μL(2U) di DNA polimerasi.</li>
		<li>Utilizzare le seguenti impostazioni PCR: denaturazione iniziale a 98 °C per 30 s; 35 cicli: 98 °C per 6 s, 60 °C per 15 s, 72 °C per 90 s; mantenere a 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Purificare il prodotto PCR utilizzando un kit di purificazione PCR commerciale, verificarne la qualità eseguendo un campione su un gel di agarosio all'1% e misurarne la concentrazione su uno spettrofotometro UV-Vis. NOTA: I prodotti grezzi della PCR possono anche essere utilizzati direttamente per l'espressione libera da cellule. Tuttavia, la purificazione consente una procedura più standardizzata.</li>
</ol>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67973/67973fig01.jpg"> 
Figura 1: Modello di espressione lineare per SARS-CoV-2-NP. Uno schema che rappresenta le caratteristiche del modello di DNA lineare His-SpyTag-SARS-CoV-2 NP. Gli elementi chiave del modello DNA sono etichettati. La sequenza codificante per la proteina di interesse, in questo caso la NP, è posta sotto il controllo trascrizionale di un promotore T7 per un'espressione efficiente. All'N-terminale, alla proteina NP viene aggiunto uno SpyTag per la rilevazione specifica utilizzando il reagente di rilevamento SpyCatcher2-Apex2. I siti x6His-tag e TEV proteasici, sebbene inclusi come parte del progetto generale LET, sono superflui ai fini del CFDB. Ai termini del modello lineare di DNA, i siti Ter "a monte" e "a valle", ciascuno preceduto da rispettive 50 sequenze tampone di 50 coppie di basi, sono inclusi per la protezione mediata da Tu contro la degradazione del DNA esonucleolitico nel lisato libero da cellule. Abbreviazioni: NP = proteina nucleocapside; LET = modello di espressione lineare; TEV = virus dell'incisione del tabacco; CFDB = macchia a punti senza cellule. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67973/67973fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
2. Purificazione della proteina reporter SpyCatcher2-Apex2
<ol>
	<li>Utilizzare il plasmide pET24b-SpyCatcher2-Apex2, originariamente costruito in Norouzi et al.5 (sequenza completa nel file supplementare 2 e mappa plasmidica nella figura supplementare S1) per preparare la proteina reporter SpyCatcher2-Apex-2.</li>
	<li>Preparare piastre di agar e brodo di lisogenia (LB) contenente 50 μg/mL di kanamicina. Trasformare le cellule BL21 (DE3) di E. coli con il plasmide pET24b-SpyCatcher2-Apex2. Inoculare una singola colonia in una coltura LB starter da 15 ml e far crescere durante la notte a 37 °C con agitazione a 250 giri/min.</li>
	<li>Il giorno successivo, aggiungere 10 mL di coltura starter in 500 mL di terreno LB fresco contenente 50 μg/mL di kanamicina. Incubare a 37 °C agitando a 250 giri/min fino a quando la coltura raggiunge una densità ottica a 600 nm di 0,6-0,8 (~3 h).</li>
	<li>Indurre l'espressione di SpyCatcher2-Apex2 integrando la coltura con 0,5 mM di isopropil-β-D-1-tiogalattopiranoside e 1 mM di acido 5-aminolevulinico cloridrato. Ridurre la temperatura di crescita a 30 °C e lasciare incubare la coltura per altre 4 ore.</li>
	<li>Raccogliere i batteri mediante centrifugazione a 8.000 × g per 15 minuti. Procedere alla lisi cellulare o in alternativa conservare il pellet a -80 °C fino al momento dell'utilizzo.</li>
	<li>Risospendere il pellet in 20 mL di tampone di lisi contenente 50 mM di Tris-HCl (pH 7,8), 300 mM di NaCl, 1 mg/mL di lisozima, una compressa di inibitore della proteasi priva di EDTA e 1 mM di ditiotreitolo (DTT). Lisare le cellule mediante sonicazione al 50 % di ampiezza con intervalli di 5 s ON e 10 s OFF per un tempo totale di ON di 3 minuti.</li>
	<li>Chiarificare il lisato mediante centrifugazione a 20.000 × g per 1 ora a 4 °C. Passare il surnatante attraverso un filtro per siringa da 0,2 μm.</li>
	<li>Aggiungere cloruro di emina a una concentrazione finale di 250 μM al lisato chiarificato e incubare per una notte a 4 °C. Procedere alla purificazione delle proteine. NOTA: L'incubazione con cloruro di emina massimizza l'incorporazione dell'eme nella perossidasi Apex-2 per un'attività enzimatica ottimale.</li>
	<li>Aggiungere 2,5 mL di resina di Ni al lisato chiarificato e incubare a 4 °C agitando delicatamente per 45 minuti. Applicare la miscela su una colonna di flusso per gravità e lavare la resina con 50 mL di tampone Tris (50 mM Tris-HCl (pH 7,8), 300 mM NaCl e 1 mM DTT).</li>
	<li>Eluire la proteina SpyCatcher2-Apex2 in 25 mL di tampone Tris contenente 400 mM di imidazolo. Il concentrato e il tampone scambiano l'eluato in tampone Tris utilizzando un'unità di filtro centrifuga, con l'obiettivo di ottenere un volume finale di 0,5-1,0 mL.</li>
	<li>Utilizzare il coefficiente di estinzione molare di SpyCatcher2-Apex2 (27.390 M-1 cm-1) per determinare la concentrazione proteica su uno spettrofotometro UV-Vis. Aggiungere glicerolo ad una concentrazione finale del 40% e conservare le aliquote a -20 °C. NOTA: Si prevede che questo protocollo produca circa 40 mg di SpyCatcher2-Apex2 altamente puro e attivo, sufficienti per 400 esecuzioni CFDB su una dimensione standard di 96 campioni di blot.</li>
	<li>Per il rilevamento di proteine SpyTagged utilizzando il western blot9 convenzionale e per gli esperimenti CFDB, bloccare sempre le membrane nel latte in polvere scremato al 5% in 1x soluzione salina tamponata con Tris contenente lo 0,05% di Tween-20 (TBST). Utilizzare la proteina SpyCatcher2-Apex2 a una concentrazione finale di 10 μg/mL in soluzione bloccante. NOTA: Il reporter SpyCatcher2-Apex2 richiede una soluzione di chemiluminescenza avanzata (ECL) per lo sviluppo del segnale. La soluzione ECL può essere ottenuta in commercio o preparata internamente secondo le istruzioni di Mruk et al.10. La soluzione finale di ECL è composta da 0,4 mM di acido p-cumarico, 2,5 mM di luminolo e 0,015% di H2O2 in 100 mM di Tris-HCl (pH 8,6).</li>
</ol>
3. Produzione cell-free e controllo di qualità degli antigeni
<ol>
	<li>Preparare e assemblare un lisato di espressione cellulare libero BL21 di E. coli BL21 e i componenti di reazione seguendo le istruzioni in Levine et al.11 e Norouzi et al.5. Integrare la miscela di reazione finale con 5 μM di proteina Tus e 1,2 μM di RNA polimerasi T7 come segue per una reazione rappresentativa di 100 μL: 14,6 μL di soluzione A, 14 μl di soluzione B, 33,3 μl di lisato BL21 di E. coli , 2,5 μl di proteina Tus 200 mM, 1,2 μl di RNA polimerasi T7 da 100 mM, 1 μL di stampo di DNA lineare da 1,5 μM, 33,4 μL di acqua priva di nucleasi. NOTA: Vedere il file supplementare 3 per le istruzioni chiave sulla preparazione di un lisato libero da cellule BL21 di E. coli e la tabella supplementare S1 per una ricetta dettagliata delle soluzioni A e B. Il sistema di espressione libera da cellule di E. coli può anche essere preparato utilizzando protocolli alternativi o ottenuto commercialmente, purché la reazione sia integrata con Tus e RNA polimerasi T7.</li>
	<li>Eseguire un test iniziale di espressione su scala di 5 μL aggiungendo il 10% (v/v) di prodotto PCR grezzo alla reazione priva di cellule in una provetta per PCR. Incubare senza agitare a 30 °C per 15 ore.</li>
	<li>Verificare la qualità dell'espressione dell'antigene NP caricando 1 μL della reazione libera da cellule su un gel di poliacrilammide dodecil solfato di sodio al 12% (SDS-PAGE) e successivamente trasferirlo su una membrana di nitrocellulosa per il western blot come descritto al punto 2.12. Utilizzare la proteina reporter SpyCatcher2-Apex2 per la marcatura dei blot tramite SpyTag e, facoltativamente, un anticorpo commerciale specifico (in questo caso un anti-SARS-CoV-2-NP) contro l'antigene bersaglio.</li>
	<li>Assemblare una reazione priva di cellule su scala da 1 mL con prodotto LET purificato da 15 nM da utilizzare per il test CFDB. Incubare la miscela di espressione in una provetta conica da 15 mL agitando a 80 giri/min per 15 ore a 30 °C. Controllare la qualità dell'espressione utilizzando il western blot e conservare aliquote da 50 μl a -20 °C.</li>
</ol>
4. Campioni di siero
<ol>
	<li>Ottenere campioni di siero (o plasma) umano/animale da fonti commerciali o collaboratori clinici o internamente utilizzando procedure standard e seguendo le linee guida del comitato etico istituzionale per la ricerca umana o del comitato per la cura e l'uso degli animali. Assicurarsi che siano state adottate adeguate misure di pretrattamento dei campioni per attenuare i rischi di contaminazione. NOTA: Le misure di pretrattamento possono includere il trattamento solvente-detergente, l'inattivazione del calore e l'analisi dei marcatori virali trasmissibili per via ematica. È disponibile un protocollo utile per l'isolamento del siero e del plasma dal sangue intero12. Come con altre piattaforme di immunodosaggio, i campioni di siero raccolti precocemente (&lt;3 settimane) dopo l'infezione iniziale o l'insorgenza della malattia non dovrebbero contenere livelli adeguati di risposta anticorpale e i loro risultati devono essere trattati con cautela.</li>
	<li>Per la verifica della qualità dei reagenti SARS-CoV-2 NP CFDB, utilizzare il pannello di riferimento internazionale dell'Organizzazione mondiale della sanità (OMS) del National Institute for Biological Standards and Control (NIBSC) per l'immunoglobulina anti-SARS-CoV-2, che contiene campioni x1 pre-COVID-19 e x4 positivi al SARS-CoV-2 con livelli variabili di immunoglobuline anti-NP13. In alternativa, utilizzare campioni di siero sani e positivi precaratterizzati provenienti da altre fonti.</li>
	<li>Per gli esperimenti CFDB, ottenere o preparare un campione di controllo negativo raggruppando più (&gt;3) campioni di siero sano per aumentare l'accuratezza e facilitare l'analisi e l'interpretazione dei risultati.</li>
</ol>
5. Procedura CFDB (Cell-Free Dot Blot)
<ol>
	<li>Scaricare e stampare il file di immagine della griglia master (Figura S2 supplementare). La griglia principale è un modello di 6 x 6 cm contenente 12 x 12 cerchi di 2 mm di diametro ciascuno e fornisce una capacità di spotting simile a una piastra a 96 pozzetti.</li>
	<li>Inserire saldamente la griglia tra due strati di pellicola sigillante adesiva per piastre PCR e tagliarla a misura lungo i bordi esterni della griglia. Utilizzare un punzone per biopsia da 2 mm per incavare ogni cerchio contrassegnato. NOTA: Questa griglia principale può essere riutilizzata più volte dopo la pulizia con etanolo al 70%.</li>
	<li>Tagliare un pezzo di membrana in nitrocellulosa di 6,5 x 6,5 cm e posizionarlo sotto la griglia principale su una superficie pulita, fissando l'installazione con nastro adesivo come mostrato nella Figura 2 e nella Figura S3 supplementare. Utilizzare un pennarello per contrassegnare le posizioni del cerchio più esterno sulla membrana di nitrocellulosa da utilizzare come guida per tagliare la membrana dopo l'individuazione del campione.</li>
	<li>Diluire i campioni di siero 1/10 in 1x soluzione salina tamponata con fosfato (pH 7,4). Utilizzare una micropipetta per erogare volumi triplicati di 0,4 μl di ciascun campione sulla membrana in nitrocellulosa in posizioni predeterminate della griglia. Ci vorranno circa 15 secondi per punto per l'erogazione. NOTA: Assicurarsi di includere sia i campioni di controllo negativi che quelli positivi con ogni test, poiché ciò sarà necessario per l'analisi dei risultati.</li>
	<li>Attendere 10 minuti a temperatura ambiente affinché i campioni macchiati si leghino e si asciughino. Usando una pinzetta, recupera con cura la membrana di nitrocellulosa e taglia lungo i cerchi esterni contrassegnati.</li>
	<li>Bloccare la membrana in 10 mL di soluzione bloccante (5% di latte scremato in polvere in TBST) in una piastra di Petri da 10 cm per 30 minuti a temperatura ambiente, agitando delicatamente a 100 giri/min.</li>
	<li>Scongelare e aggiungere 50 μl di aliquota della miscela di espressione dell'antigene libero da cellule a 5 mL di soluzione bloccante in una piastra di Petri da 10 cm. Trasferire la membrana direttamente in questa soluzione contenente antigene e incubare a temperatura ambiente per 1 ora, agitando a 100 giri/min. NOTA: Questa sarà la fase di rilevamento principale in cui l'antigene SpyTagged si legherà alle posizioni dei punti contenenti anticorpi, se presenti.</li>
	<li>Sciacquare la membrana, lavare per 5 minuti e risciacquare nuovamente in TBST prima di procedere alla fase di rilevamento secondaria.</li>
	<li>Incubare la membrana in 10 mL di tampone bloccante contenente 10 μg/mL di proteina purificata SpyCatcher2-Apex2, per 1 ora agitando a 100 giri/min.</li>
	<li>Risciacquare la membrana e lavare 2 x 5 min in TBST, con un risciacquo finale in TBS.</li>
	<li>Incollare e fissare un pezzo di parafilm su un'area di lavoro pulita vicino allo strumento di imaging blot. Rimuovere il liquido in eccesso picchiettando la membrana con una pinzetta e posizionare la membrana sopra il parafilm.</li>
	<li>Aggiungere immediatamente 3 mL (100 μL/cm2) di soluzione ECL sulla parte superiore della membrana e incubare a temperatura ambiente per esattamente 90 s.</li>
	<li>Asciugare immediatamente la membrana e trasferirla a uno strumento di imaging compatibile con la chemiluminescenza per la visualizzazione dei risultati. NOTA: Il tempo di imaging ottimale può variare a seconda degli strumenti. Si consiglia di utilizzare le impostazioni predefinite del tempo di acquisizione automatica dello strumento e, in caso di assenza, di utilizzare campioni di siero precaratterizzati per ottimizzare il tempo di acquisizione dell'immagine.</li>
	<li>Utilizzare la funzione di analisi delle immagini dello strumento per ottenere intensità spot, anche per tre posizioni vuote (sfondo) sulla membrana di nitrocellulosa; Mantenere un volume di misurazione costante per punto. Esporta i dati in un foglio di calcolo, ricordando di etichettare correttamente ogni posizione del punto.</li>
	<li>Calcolare la media e la deviazione standard (SD) delle intensità spot triplicate. Quindi, sottrarre il fondo della membrana di nitrocellulosa da tutti i campioni.</li>
	<li>Utilizzare la seguente equazione per ottenere un valore di cut-off per l'interpretazione dei risultati -/+: (Media dei controlli negativi) + (3 x SD dei controlli negativi). Considerare i campioni positivi se la loro intensità media scende al di sopra del valore di cut-off e negativi se la loro intensità media scende al di sotto del valore di cut-off. NOTA: Uno schema della procedura CFDB è fornito nella Figura 3.</li>
</ol>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67973/67973fig02.jpg"> 
Figura 2: Assemblaggio CFDB. Uno schema della griglia master CFDB e della configurazione dell'assemblaggio della membrana NC. La griglia master è sovrapposta alla membrana NC per fornire un modello regolare e indirizzabile per l'individuazione e l'immobilizzazione dei campioni di siero. Abbreviazioni: CFDB = cell-free dot blot; NC = nitrocellulosa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67973/67973fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67973/67973fig03.jpg"> 
Figura 3: Una rappresentazione schematica del flusso di lavoro CFDB. In un test CFDB, una piccola quantità (&lt;0,4 μl) di campioni di siero diluiti 10x viene dispensata manualmente su una membrana di nitrocellulosa pretagliata (pannello sinistro) in posizioni discrete e indirizzabili (pannello centrale). Depositare un campione di siero per punto in punti triplicati e immobilizzare il contenuto proteico, compreso il serbatoio totale di anticorpi del siero, sul substrato solido NC (macchie beige nel pannello centrale). In questo esempio, gli anticorpi anti-NP contenuti nei campioni di siero possono essere prima legati dal reagente di rilevamento primario CFDB SpyTag-NP e infine rilevati dal reagente di rilevamento secondario CFDB SpyCatcher2-Apex2 (bolla ingrandita nel pannello di destra). Questa cifra è stata presa da Norouzi et al.5. Abbreviazioni: CFDB = cell-free dot blot; NP = proteina nucleocapside; LET = modello di espressione lineare. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67973/67973fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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<li>Smith, M. T., Berkheimer, S. D., Werner, C. J., Bundy, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lyophilized+Escherichia+coli-based+cell-free+systems+for+robust%2C+high-density%2C+long-term+storage%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Lyophilized Escherichia coli-based cell-free systems for robust, high-density, long-term storage.</a> Biotechniques. 56 (4), 186-193 (2014).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Scala DNA da 1 kb</td><td>NEB</td><td>N3232</td><td>Utilizzato come marcatore dimensionale per gel di agarosio</td></tr><tr><td>20 aminoacidi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>LAA21-1KT</td><td>Un componente della reazione libera da cellule Soluzione B</td></tr><tr><td>Punzone per biopsia da 2 mm&nbsp;</td><td>Integra Miltex</td><td>33-31-P/25</td><td>Per la preparazione della griglia master CFDB</td></tr><tr><td>Acido 5-aminolevulinico cloridrato&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3785</td><td>Precursore dell'eme per l'induzione della polvere di agarosio SpyCatcher2-Apex2</td></tr><tr><td></td><td>BioShop</td><td>AGA002</td><td>Per l'analisi elettroforetica dell'anticorpo</td></tr><tr><td>DNA anti-SARS-CoV2-Nucleocapside</td><td>Sinobiologico</td><td>40588-T62</td><td>Per la rilevazione del WB dell'antigene NP prodotto senza cellule</td></tr><tr><td>Bio-Rad ChemiDoc&nbsp; XRS+</td><td>Bio-Rad</td><td>N/A</td><td>Gel imager instrument</td></tr><tr><td>Concentratori centrifughi</td><td>Cytiva</td><td>28-9323-60</td><td>Per la concentrazione e lo scambio di tamponi di proteine</td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Eppendorf</td><td>EP022628257</td><td>Per la raccolta di colture batteriche</td></tr><tr><td>Coenzima A sale di sodio idrato (CoA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3144</td><td>Un componente della reazione priva di cellule Soluzione A</td></tr><tr><td>Standard proteico pre-colorato a colori (ampio intervallo)</td><td>NEB</td><td>P7719</td><td>Utilizzato come marcatore dimensionale per gel SDS-PAGE Pannello di</td></tr><tr><td>siero Covid-19</td><td>RayBiotech</td><td>CoV-PosSet</td><td>Sieri pre-caratterizzati per la verifica e l'ottimizzazione di reagenti/condizioni</td></tr> <tr><td>CFDBD-(&meno;)-Acido 3-fosfoglicerico sale disodico (3-PGA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8877</td><td>Un componente della reazione libera da cellule Soluzione B</td></tr><tr><td>Ditiotreitolo (DTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10197777001</td><td>Componente dei tamponi</td></tr><tr><td>E. coli 5-alfa</td><td>NEB</td><td>C2987&nbsp;</td><td>per preparazione di plasmidi</td></tr><tr><td>E. coli BL21&nbsp;</td><td>NEB</td><td>C2530&nbsp;</td><td>Per la preparazione di lisati privi di cellule</td></tr><tr><td>E. coli BL21 (DE3)</td><td>NEB</td><td>C2527&nbsp;</td><td>Per l'espressione di SpyCatcher2-Apex2</td></tr><tr><td>Compressa inibitore della proteasi senza EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11836153001</td><td>Un componente del tampone di lisi di E. coli</td></tr><tr><td>Eppendorf&nbsp; Nuovo Brunswick&nbsp; Innova 43/43R Incubatore</td><td>Eppendorf</td><td>EPM1320</td><td>Incubatore per la crescita di cellule di E. coli per l'espressione proteica e la preparazione di lisato privo di cellule</td></tr><tr><td>Acido folinico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47612</td><td>Un componente della soluzione di reazione senza cellule A</td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9012</td><td>Componente del tampone di conservazione SpyCatcher2-Apex2</td></tr><tr><td>Cloruro di emina&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9039&nbsp;</td><td>Per l'integrazione di Heme di SpyCatcher2-Apex2</td></tr><tr><td>Perossido di idrogeno 30%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1009</td><td>Per la produzione di reagenti ECL</td></tr><tr><td>Software di laboratorio di immagini</td> Software <td>di 1709690</td><td>Bio-Rad</td><td>per lo strumento di imaging in gel ChemiDoc</td></tr><tr><td>Isopropil-b-D-1-tiogalattopiranoside</td><td>Bioshop</td><td>IPT001</td><td>Per l'induzione di SpyCatcher2-Apex2 expressikon</td></tr><tr><td>Kanamycin Sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60615</td><td>Per la preparazione di colture batteriche SpyCatcher2-Apex2</td></tr><tr><td>LB agar</td><td>BioShop</td><td>LBL406</td><td>Per la crescita di E. coli</td></tr><tr><td>LB brodo</td><td>BioShop</td><td>LBL407</td><td>Per la crescita di E. coli</td></tr><tr><td>luminol&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4685</td><td>Per la produzione di reagenti ECL</td></tr><tr><td>Lisozima</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876</td><td>Per la lisi delle cellule batteriche</td></tr><tr><td>Acetato di magnesio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5661</td><td>Un componente della reazione senza cellule Soluzione B</td></tr><tr><td>NEBExpress Resina Ni&nbsp;</td><td>NEB</td><td>S1428S</td><td>Per la purificazione di SpyCatcher2-Apex2</td></tr><tr><td>Latte in polvere scremato</td><td>Bioshop</td><td>SKI400</td><td>Per il blocco delle membrane WB e CFDB Parafilm</td></tr><tr><td></td><td>Bemis</td><td>2099-1337410</td><td>Per l'incubazione ECL di CFDB blots</td></tr><tr><td>acido p-cumarico&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9008</td><td>Per la produzione di reagenti ECL</td></tr><tr><td>pET24b-SpyCatcher2-Apex2 plasmide</td><td>Pardee Laboratory</td><td>N/A</td><td>Utilizzato per l'espressione della proteina SpyCatcher2-Apex2</td></tr><tr><td>Piastra di Petri</td><td>Fisherbrand</td><td>FB0875712</td><td>Contenitore per l'incubazione della membrana WB e CFDB&nbsp;</td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato 10%</td><td>BioShop</td><td>PBS405</td><td>Componente dei tamponi</td></tr><tr><td>Glutammato di potassio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1501</td><td>Un componente della reazione libera da cellule Soluzione B</td></tr><tr><td>Ossalato di potassio monoidrato (acido ossalico)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>223425</td><td>Un componente della reazione senza cellule Soluzione A</td></tr><tr><td>Gel SDS-PAGE prefabbricato</td><td>BioRad</td><td>4561036EDU</td><td>Per l'analisi elettroforetica della proteina</td></tr><tr><td>Q5 DNA polimerasi ad alta fedeltà&nbsp;</td><td>NEB</td><td>M0491&nbsp;</td><td>Per l'amplificazione PCR di LET</td></tr><tr><td>Kit di purificazione QIAquick PCR&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td>Per la purificazione dei LET</td></tr><tr><td>Set di soluzioni ribonucleotidiche</td><td>NEB</td><td>N0450S</td><td>Un componente della soluzione di reazione senza cellule A</td></tr><tr><td>Latte scremato in polvere</td><td>BioShop</td><td>SKI400</td><td>Utilizzato come agente bloccante per western blot e CFDB</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9625</td><td>Un componente dei tamponi per la purificazione delle proteine</td></tr><tr><td>Sonicatore</td><td>Qsonica</td><td>Q500</td><td>Per la lisi delle cellule batteriche</td></tr><tr><td>Spermidina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2626</td><td>Un componente della reazione libera da cellule Soluzione A</td></tr><tr><td>Filtro per siringa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLGSR33SS</td><td>Per la sterilizzazione di tamponi e soluzioni</td></tr><tr><td>Termociclatore</td><td>BioRad</td><td>T100</td><td>Strumento per l'incubazione delle reazioni di PCR</td></tr><tr><td>Trasferimento dell'RNA (tRNA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8759</td><td>Un componente della soluzione di reazione senza cellule Soluzione salina</td></tr><tr><td>tamponata Tris</td><td>Thermo Scientific</td><td>J60764. K2</td><td>Componente del tampone di lavaggio WB e CFDB</td></tr><tr><td>Base Trizma</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>Per la produzione di tampone tris</td></tr><tr><td>Tunair SS-5012 Half-Baffle Shake Flask, 2,5 L</td><td>Cole-Parmer</td><td>RK-01835-39</td><td>Recipiente per la crescita di cellule di E. coli per l'espressione proteica e la preparazione di lisato senza cellule</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>BioShop</td><td>TWN510</td><td>Componente del tampone di lavaggio WB e CFDB</td></tr><tr><td>Pinzetta</td><td>Almedic</td><td>7728-A10-100</td><td>Per la manipolazione</td></tr> dello <tr><td>spettrofotometro UV-Vis</td> a membrana CFDB NC <td>Thermo Scientific</td><td>13400518</td><td>Utilizzato per la misurazione della concentrazione di acido nucleico e DNA e della coltura batterica OD</td></tr><tr><td>OMS Gruppo di riferimento internazionale per l'immunoglubulina anti-SARS-CoV-2</td><td>NISBC</td><td>20/268</td><td>Sieri pre-caratterizzati per la verifica e l'ottimizzazione di reagenti/condizioni</td></tr> <tr><td>CFDB&beta;-Nicotinamide adenina dinucleotide idrato (NAD)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10127965001</td><td>Componente A della soluzione di reazione libera da cellule A</td></tr></tbody></table>

cell-free dot blot come piattaforma di immunodosaggio pratica e adattabile per il rilevamento della risposta anticorpale in sieri umani e animali

Cell-Free Dot Blot as a Practical and Adaptable Immunoassay Platform for the Detection of Antibody Response in Human and Animal Sera

Amplificazione PCR del modello di espressione lineare per l'antigene target Per amplificare con PCR il SARS-CoV-2 NP LET, sono stati utilizzati primer universali Ter in avanti e indietro come descritto nella sezione 1.2 del protocollo e 1 μL del prodotto è stato controllato su un gel di agarosio (Figura 4) prima di procedere alla purificazione del prodotto per PCR.
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Cell-Free Dot Blot come piattaforma di immunodosaggio pratica e adattabile per il rilevamento della risposta anticorpale in sieri umani e animali

The string of global pathogenic outbreaks over the past two decades has highlighted the importance of serosurveillance strategies. Immunoassay platforms ...

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Immunologia e Infezioni

Utilizzo di microsfere Luminex Corporation xMAP tecnologia, abbiamo sviluppato il immunoenzimatico Multiplexed fluorimetrico (MFIA) per sierosorveglianza di varie specie di animali da laboratorio. Il MFIA è un microarray sospensione dove antigene, controllo di tessuto o immunoglobuline sono legati covalentemente a microsfere di polistirene codice colore. Il metodo di prova MFIA così come i vari argomenti di risoluzione dei problemi è indirizzata.

Multiplex fluorimetrico Metodologia di test immunoenzimatico e risoluzione dei problemi

Questo video descrive una tecnica di immunodosaggio che utilizza microsfere magnetiche fluorescenti accoppiate con diversi antigeni per rilevare simultaneamente vari isotipi di anticorpi in un campione di siero. Il test è utile per comprendere la sieroconversione durante un'infezione o dopo la vaccinazione.

Saggio Immunobead Multianalita: una tecnica di immunodosaggio basata sul flusso per la rilevazione concomitante di più sottotipi di anticorpi in un campione di siero umano

Questo protocollo descrive lo sviluppo di due anticorpi monoclonali (mAb) di classe IgG fortemente reattivi alla mioglobina dei cetacei. Questi mAb vengono applicati su una striscia reattiva immunocromatografica all'oro colloidale basata sul formato a sandwich per differenziare il Mb dei cetacei dalla foca e da altri animali.

Sviluppo di una striscia reattiva Immunocromatografico oro colloidale-based per il rilevamento di Cetacei mioglobina

Il sangue periferico umano è comunemente usato per la valutazione della risposta immunitaria umorale. Qui vengono descritti i metodi per isolare le cellule B umane dal sangue periferico, differenziare le cellule B umane in cellule B secernenti anticorpi (ASC) in coltura ed enumerare le IgM- e IgG-ASC totali tramite un test ELISpot.

L&#39;isolamento, la differenziazione e quantificazione di Human anticorpo-secernenti cellule B da sanguigno: ELISpot come una lettura funzionale del umorale immunità

Dimostriamo una tecnologia di chip di snap per l'esecuzione di test immunologici cross-reactivity-gratis multiplex panino semplicemente schioccando due diapositive. Un'apparecchiatura di snap è utilizzata per il trasferimento in modo affidabile i reagenti da microarray a DNA-microarray. Il chip di snap può essere utilizzato per eventuali reazioni biochimiche che richiedono colocalizzazione di reagenti diversi senza la contaminazione incrociata.

Chip a scatto per immunodosaggi panino multiplex Cross-reactivity e Spotter-free

Qui dimostriamo un dettagliato processo di analisi di quantitativi dot blot (QDB) determinando il contenuto assoluto di una proteina mirato, tappatura proteina actina, gelsolin-come (CAPG), in tre tessuti di diverso tipo di mouse. Dimostriamo un throughput elevato, la tecnica di immunoblot conveniente, quantitativa per la convalida di biomarcatore a livello cellulare e tissutale.

High Throughput, assoluta determinazione del contenuto di una proteina selezionato presso i livelli del tessuto utilizzando quantitativi Dot Blot analisi (QDB)

In questo articolo, descriviamo un protocollo per caratterizzare le risposte di isotipo dell'immunoglobulina (Ig) T-dipendenti e T-indipendente in topi usando ELISA. Questo metodo usato da solo o in combinazione con flusso cytometry permetterà ai ricercatori di identificare le differenze nelle risposte di isotipo Ig B cellulo-mediata nei topi dopo immunizzazione antigene T-dipendente e T-indipendente.

Caratterizzazione delle risposte di isotipo dell'immunoglobulina timo-dipendenti e indipendenti del timo in topi usando l'analisi enzima-collegata dell'immunosorbente

Questo articolo descrive un metodo conveniente per monitorare i cambiamenti dinamici nei titoli anticorpali per due isotipi di immunoglobuline contemporaneamente (IgA, IgM o IgG) derivanti da una risposta immunitaria all'infezione o alla vaccinazione da SARS-CoV-2. Questo "Multianalyte Covid-19 Immune Response Panel" impiega tre test immunologici indiretti costruiti su microsfere codificate che vengono lette utilizzando un lettore multiplex basato sul flusso con funzionalità "dual-channel".

Monitoraggio dinamico della sieroconversione utilizzando un test multianalyte immunobead per Covid-19

Questo protocollo descrive una metodologia per la preparazione di perle di lattice per saggi che utilizzano anticorpi IgY per la rilevazione dell'antigene.

Standardizzazione di un test citometrico a perline basato su anticorpi tuorlo d'uovo

I test immunologici basati su sangue intero forniscono uno strumento semplice ed efficiente in termini di risorse per analizzare l'immunità antigene-specifica a fini diagnostici e di ricerca. Questo articolo fornisce un protocollo ottimizzato basato su sangue intero con doppia co-stimolazione per un'analisi completa dell'immunità dell'ospite ai patogeni fungini e virali, inclusa una versione a basso volume per pazienti pediatrici e piccoli animali.

Saggio su sangue intero con doppia co-stimolazione per l'analisi antigene-specifica dell'immunità dell'ospite a patogeni fungini e virali

Presentiamo un test ELISA sandwich convalidato utilizzando nuovi anticorpi monoclonali anti-HER2. Questo test consente una quantificazione precisa della proteina HER2 legata alle cellule e rilasciata da cellule in coltura in vitro e altri campioni, inclusi sangue e tessuti.

Saggio immunochimico convalidato per la determinazione completa del recettore 2 del fattore di crescita epidermico umano rilasciato e legato alle cellule

Scopri la tecnica cell-free dot blot per l'immunodosaggio accessibile e adattabile nei sieri umani e animali. Questo metodo offre una piattaforma diagnostica rapida e conveniente per rilevare risposte anticorpali.

Cell-Free Dot Blot come piattaforma di immunodosaggio pratica e adattabile per il rilevamento della risposta anticorpale in sieri umani e animali (Video) | JoVE Journal

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