Cell-Free Dot Blot come piattaforma di immunodosaggio pratica e adattabile per il rilevamento della risposta anticorpale in sieri umani e animali

Questo protocollo dimostra la tecnica del sangue a punti senza cellule, una piattaforma di immunodosaggio adattabile, accessibile e conveniente sviluppata in risposta alla pandemia di COVID-19. I metodi di immunodosaggio gold standard esistenti includono variazioni della tecnica ELISA e dei saggi a flusso laterale. C'è stato un notevole interesse nello sviluppo di nuovi test immunologici utilizzando tecnologie come le proteine divise riportate, le interfacce elettrochimiche e le nanoparticelle colloidali.

La sfida è che la maggior parte dei test immunologici gold standard sono inaccessibili alle comunità non centralizzate a causa della dipendenza da componenti e apparecchiature molecolari costose e sofisticate. Questa nuova tecnica di immunodosaggio CFDB può essere rapidamente adattata ai focolai emergenti. Utilizza attrezzature di laboratorio di base e si basa interamente su componenti molecolari che possono essere prodotti internamente e in contesti con risorse limitate.

Per iniziare, ottieni la sequenza proteica dal database UniProt utilizzando il codice di accesso P0DTC9. Codice sull'ottimizzazione della sequenza per l'espressione basata su ecoli utilizzando il codice IDT sullo strumento di ottimizzazione. Inserire la sequenza ottimizzata in un modello SnapGene per la spina dorsale del costrutto di espressione prima di ordinare la sequenza ottimizzata per la sintesi commerciale come un singolo frammento di DNA sospeso in acqua.

Eseguire un test iniziale di espressione su scala di cinque microlitri aggiungendo il 10% di prodotto PCR alla reazione priva di cellule ecoli BL21 in una provetta PCR. Incubare la reazione senza agitare a 30 gradi Celsius per 15 ore. Valutare la qualità dell'espressione della proteina nucleocapside o dell'antigene NP caricando un microlitro della reazione libera da cellule su un gel di pagina SDS al 12% e trasferirlo su una membrana di nitrocellulosa per il western blot.

Assemblare una reazione priva di cellule su scala di un millilitro utilizzando un modello di espressione lineare purificato a 15 nanomolari per il saggio dot blot privo di cellule Incubare la miscela di espressione in una provetta conica da 15 millilitri con agitazione a 80 giri/min per 15 ore a 30 gradi Celsius. Dopo aver valutato la qualità dell'espressione utilizzando western blot e aliquotando 50 microlitri della miscela di espressione, conservare le aliquote a meno 20 gradi Celsius. Utilizzare un'immagine a griglia principale, come mostrato, con un modello di sei per sei centimetri contenente cerchi di 12 per 12, ciascuno con un diametro di due millimetri, progettato per corrispondere alla capacità di individuazione di una piastra a 96 pozzetti.

Dopo aver stampato la griglia principale, inserire saldamente la griglia stampata tra due strati di pellicola adesiva per soffitto per piastre PCR, tagliare il sandwich a misura lungo i bordi esterni della griglia. Utilizzando un punzone per biopsia da due millimetri, incavare ogni cerchio contrassegnato sulla griglia. Tagliare un pezzo di membrana in nitrocellulosa di 6,5 x 6,5 centimetri, posizionarlo sotto la griglia master su una superficie pulita e fissarlo con del nastro adesivo.

Utilizzando un pennarello, segnare le posizioni del cerchio più esterno sulla membrana di nitrocellulosa da utilizzare come guida per tagliare la membrana dopo la spotting del campione. Diluire i campioni di siero da uno a 10 in PBS. Utilizzando una micropipetta, erogare volumi triplicati di 0,4 microlitri di ciascun campione sulla membrana di nitrocellulosa in posizioni predeterminate della griglia.

Lasciare legare e asciugare i campioni macchiati a temperatura ambiente per 10 minuti. Usando una pinzetta, recupera con cura la membrana di nitrocellulosa e tagliala lungo i cerchi esterni contrassegnati. Trasferire la membrana in una capsula di Petri da 10 centimetri contenente 10 millilitri di soluzione bloccante.

Incubare a temperatura ambiente per 30 minuti agitando delicatamente a 100 giri/min. Togliere dal congelatore l'aliquota di 50 microlitri della miscela di espressione dell'antigene libero da cellule e, dopo lo scongelamento, aggiungerla a cinque millilitri di soluzione bloccante in una capsula di Petri da 10 centimetri. Trasferire la membrana direttamente in questa soluzione contenente antigene e incubare a temperatura ambiente per un'ora, agitando a 100 giri/min.

Dopo un'ora, risciacquare e lavare la membrana in TBST contenente lo 0,05% di Tween 20. Successivamente, aggiungere alla membrana 10 millilitri di tampone bloccante contenente 10 microgrammi per millilitro di SpyCatcher purificato, due apici, due proteine, e posizionare la membrana in un piatto contenente SpyCatcher apex. Incubare per un'ora agitando a 100 giri/min Dopo aver risciacquato la membrana con soluzione fisiologica tamponata o TBS, lavare due volte per cinque minuti in TBST, seguito da un risciacquo finale in TBS.

Incollare e fissare un pezzo di parafilm su una superficie di lavoro pulita vicino allo strumento di imaging blot. Rimuovere il liquido in eccesso picchiettando la membrana e usando una pinzetta, posizionarla sopra il parafilm. Aggiungere immediatamente tre millilitri di chemiluminescenza potenziata o soluzione ECL sulla parte superiore della membrana e incubare a temperatura ambiente per esattamente 90 secondi.

Dopo aver asciugato la membrana con il picchietto, trasferirla in uno strumento di imaging compatibile con la chemiluminescenza. Utilizzare la funzione di analisi delle immagini dello strumento per ottenere intensità spot, anche per tre posizioni vuote sulla membrana di nitrocellulosa. Mantenere un volume di misurazione costante per punto.

Esporta i dati in un foglio di calcolo, garantendo la corretta etichettatura di ogni posizione del punto. Calcola la media e la deviazione standard delle intensità spot triplicate. Sottrarre il fondo della membrana di nitrocellulosa da tutte le misurazioni del campione.

Quindi, utilizzare l'equazione data per ottenere un valore limite per l'interpretazione di risultati positivi o negativi. Infine, traccia i dati sottratti in un grafico a barre. Un test di dot blot cell-free è stato eseguito sulla Sarah umana commerciale pre-caratterizzata, e in questa figura è presentata un'immagine del blot, insieme al grafico dell'intensità del segnale corrispondente.

Il test del dot blot privo di cellule ha identificato con successo tutti i campioni di controllo negativi e la maggior parte dei campioni positivi. I test indipendenti del test di macchia a punto libero da cellule presso il National Microbiology Laboratory hanno identificato correttamente tutti i 12 campioni di pazienti negativi e 12 positivi, confermandone la robustezza. Il test del dot blot privo di cellule ha anche rilevato risposte anticorpali nel criceto Sarah infettato da SARS-CoV-2, con segnali positivi osservati in 18 dei 24 campioni post-infezione raccolti cinque giorni dopo la reinfezione, mentre tutti i campioni pre-infezione sono rimasti negativi.