High Throughput, assoluta determinazione del contenuto di una proteina selezionato presso i livelli del tessuto utilizzando quantitativi Dot Blot analisi (QDB)

Qui dimostriamo un dettagliato processo di analisi di quantitativi dot blot (QDB) determinando il contenuto assoluto di una proteina mirato, tappatura proteina actina, gelsolin-come (CAPG), in tre tessuti di diverso tipo di mouse. Dimostriamo un throughput elevato, la tecnica di immunoblot conveniente, quantitativa per la convalida di biomarcatore a livello cellulare e tissutale.

Questo metodo può essere chiamato ELISA a livello tissutale per prendere le distanze dalla tradizionale quantificazione semiquantitativa relativa del contenuto proteico a livello cellulare e tissutale, che è attualmente la norma nei laboratori di ricerca e nel campo della diagnostica clinica. I principali vantaggi di questa tecnica possono essere descritti in tre parole: ad alto rendimento, quantitativo e assoluto. Se dovessimo aggiungere un'altra parola, sarebbe semplice.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono al campo della proteomica, mentre la verifica dei biomarcatori può essere ottenuta in formato ad alto rendimento. Questo metodo ha ampie applicazioni in tutto il campo della ricerca e della clinica. La quantificazione della quantità di proteine a livello cellulare e tissutale è ancora primitiva al momento.

In generale, le persone che non conoscono questo metodo non avranno problemi ad apprendere questa tecnica ed è piuttosto semplice e richiede competenze di laboratorio minime per essere eseguita. Siamo entusiasti di dimostrare la sua affidabilità, semplicità e accuratezza della tecnica utilizzando il modello animale. I campioni possono essere preparati con qualsiasi metodo tradizionale di preparazione dei campioni utilizzando qualsiasi tampone di lisi comunemente usato nel laboratorio di ricerca con o senza detergente come MP40 o Triton X.In nostro caso, utilizziamo il tampone di lisi Triton X.

Metti una fetta di tessuto da cinque a 100 milligrammi in una provetta da 1,5 millilitri. Successivamente, aggiungere 200 microlitri di tampone di lisi integrato con inibitori della proteasi e della fosfatasi. Quindi, omogeneizzare il tessuto con un omogeneizzatore per un minuto sul ghiaccio.

Quindi centrifugare il campione per 10 minuti a 8.000 volte g a quattro gradi Celsius. Raccogliere il surnatante in nuove provette ed estrarre un microlitro per misurare la quantità totale di proteine nel lisato proteico utilizzando un kit per la determinazione delle proteine come un test BCA. Incubare per 30 minuti a 37 gradi Celsius, quindi misurare l'assorbanza a 562 nanometri su un lettore di micropiastre.

In questa fase, utilizzando una proteina ricombinante con concentrazione nota come standard, diluire la proteina a una concentrazione di 12.000 picogrammi per microlitro come soluzione madre. Nel frattempo, diluire il lisato del campione preparato a quattro microgrammi per microlitro. Per ottenere risultati più affidabili, si consiglia di utilizzare una miscela di lisati campione per evitare qualsiasi differenza tra i singoli campioni.

Diluire in serie sia la proteina standard che i campioni preparati per uno studio della dose tipica. La BSA è stata integrata per garantire quantità approssimativamente uguali di proteine caricate per ciascun campione. Successivamente, mescolare 10 microlitri di proteina standard diluita in serie o di lisati campione con 10 microlitri di tampone di caricamento 2X.

Quindi scaldare il composto a 85 gradi Celsius per cinque minuti. In questa procedura, posizionare una scatola vuota dei puntali della pipetta sotto la piastra QDB per evitare che la parte inferiore della piastra tocchi la superficie del tavolo. Caricare fino a due microlitri di campione al centro della membrana nella parte inferiore di una singola unità della piastra QDB.

Non lasciare mai che la parte inferiore della piastra QDB tocchi alcuna superficie durante il caricamento e non caricare troppo per il singolo pozzetto. Nella nostra esperienza, non più di quattro microlitri per pozzetto. Quindi, lasciare la piastra QDB caricata per un'ora a temperatura ambiente o lasciare la piastra caricata a 37 gradi Celsius per 15 minuti in uno spazio ben ventilato.

Per bloccare la piastra, immergere la piastra QDB nel tampone di trasferimento e agitarla delicatamente per 10 secondi. Successivamente, sciacquare delicatamente la piastra QDB con TBST tre volte e quindi lavare la piastra per cinque minuti in TBST agitando costantemente. Successivamente, bloccare la piastra QDB con tampone di blocco per un'ora sotto agitazione costante.

Ora, diluire l'anticorpo primario nel tampone bloccante a una concentrazione scelta e aggiungerne 100 microlitri a ogni singolo pozzetto di una normale piastra da 96 pozzetti. Inserire la piastra QDB nella piastra a 96 pozzetti e incubare le piastre combinate per due ore a temperatura ambiente o durante la notte a quattro gradi Celsius sotto agitazione costante. Successivamente, sciacquare delicatamente la piastra con TBST tre volte prima di lavarla con TBST tre volte ogni volta per cinque minuti agitando costantemente.

Quindi, diluire l'anticorpo secondario nel tampone bloccante alla concentrazione scelta e aliquotare 100 microlitri in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti. Quindi incubare la piastra QDB all'interno della piastra caricata a 96 pozzetti per un'ora a temperatura ambiente sotto agitazione costante. Sciacquare delicatamente la piastra QDB tre volte con TBST e poi lavare la piastra tre volte cinque minuti ciascuna con TBST sotto agitazione costante.

Per la quantificazione, preparare il substrato ECL e aliquotarlo in una piastra da 96 pozzetti a 100 microlitri per pozzetto. Quindi inserire la piastra QDB all'interno della piastra a 96 pozzetti per due minuti agitando costantemente. Successivamente, rimuovere la piastra QDB dalla piastra a 96 pozzetti e agitare brevemente per rimuovere il liquido in eccesso.

Successivamente, posizionare la piastra su una piastra per microtitolazione bianca. Quindi, accendere il lettore di micropiastre e selezionare la piastra con coperchio sull'interfaccia utente prima di posizionare le piastre combinate all'interno del lettore di micropiastre per la quantificazione. Assicurati di scegliere la piastra con coperchio per evitare errori.

Questa figura mostra la specificità dell'anticorpo anti-CAPG del coniglio utilizzando lisati di tessuto di topo preparati da milza, cuore, muscoli, reni, fegato e prostata con analisi western blot. È stato definito l'intervallo lineare dell'analisi QDB degli anticorpi anti-CAPG di coniglio utilizzando lisati preparati da prostata, rene, milza e utilizzando lo standard proteico CAPG ricombinante purificato. I risultati sono stati una media di triplicati.

E qui è mostrata la determinazione assoluta dei livelli di CAPG nei lisati preparati da reni, milza e prostata di topo. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in quattro-24 ore se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di utilizzare un anticorpo specifico predeterminato per l'intera procedura.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come l'analisi biostatistica, al fine di rispondere a ulteriori domande, raggiungibili solo attraverso la misurazione assoluta del contenuto proteico individuale a livello cellulare o tissutale. Sin dal suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della ricerca proteomica per esplorare la relazione putativa dei biomarcatori proteici con varie malattie a livello di popolazione. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire l'analisi QDB in formato ad alto rendimento.

Non dimenticare che lavorare con tessuti umani o animali può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come l'uso di guanti.