Name: High Throughput, assoluta determinazione del contenuto di una proteina selezionato presso i livelli del tessuto utilizzando quantitativi Dot Blot analisi (QDB) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Impara la quantificazione assoluta delle proteine con l'analisi QDB su tessuti di topo. Questo metodo semplice e ad alto rendimento consente la validazione affidabile dei biomarcatori in proteomica.

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Questo lavoro è supportato da Taishan studiosi Construction Engineering (G.T.), The Shandong eccellente Young Scientist Award (ZR2016JL026 a G. T.), National Natural Science Foundation of China (31771284, 3167070448 e 81641108), Shandong Provinciale naturale la ricerca scientifica (ZR2016JL026, 2017GSF18103), Shandong provincia scienza e tecnologia piano (J14LE01 e J15LK03), plan(2015ZH083) di scienza e tecnologia di Yantai e Binzhou medica ricerca fondi Università scientifica (BY2013KYQD17, BY2013KYQD18), il Consiglio di ricerca svedese concedere 621-2011-4423 e 2015-4870. Questo lavoro è sponsorizzato dal "Yantai doppia cento talenti piano" e "Yantai Hi-Tech Zone Blu oceano talento piano".

Tutte le procedure di animali effettuate in linea con direttiva Use di Binzhou Medical University animale e approvate dal Consiglio di revisione etica di Binzhou Medical University.
1. preparazione del campione
<ol><li>Prendere del tessuto del mouse di 50 mg in un tubo da 1,5 mL. Aggiungere 200 µ l di tampone di lisi (50 mM Hepes, pH 7.4, 137 mM NaCl, 5 mM EDTA, 5 mM EGTA, 1 mM MgCl2, 10mm Na2P2O7, 1% Triton X-100, 10% glicerolo), supplementato con inibitori di proteasi e fosfatasi (100 mM NaF, 0,1 mM phenylmethylsulfonyl fluoro, 5 µ g/mL pepstatin, 10 µ g/mL leupeptina, aprotinina 5 µ g/mL).</li>
	<li>Omogeneizzare il tessuto con un omogeneizzatore per 1 min sul ghiaccio.</li>
	<li>Centrifugare per 10 min 8 000 x g a 4 ° C.</li>
	<li>Raccogliere il surnatante in nuove provette (1,5 mL) e togliere 1 µ l per analisi di concentrazione di proteina con kit di BCA. Nota: Tutti i buffer di lisi comunemente utilizzati per l'analisi western blot e Dot blot possono essere utilizzati per l'analisi QDB.</li>
</ol>2. determinare la specificità dell'anticorpo
<ol><li>Preparare campione lisati (20 µ g) nella sezione 1.4, IgG gratis BSA (20 µ g), proteina standard (600 pg), per l'analisi western blot. Nota: IgG gratis BSA viene utilizzato come controllo negativo e la proteina standard è usato come controllo positivo. La specificità dell'anticorpo è dimostrata mostrando una banda di giusta dimensione utilizzando l'analisi di western blot.</li>
</ol>3. definizione della gamma lineare dell'analisi QDB
<ol><li>Sciogliere la proteina standard con ddH2O. Diluire la proteina ad una concentrazione di 1.200 pg / µ l.</li>
	<li>Diluire il concentrato della proteina da campioni preparati in sezione 1.4 a 4 µ g / µ l.</li>
	<li>Sciogliere la BSA con ddH2O. Diluire la proteina ad una concentrazione di 1.200 pg / µ l e 4 µ g / µ l.</li>
	<li>Una serie di diluizione di proteina standard e campioni preparati sono stati preparati con la Guida di tabella 1 e tabella 2.</li>
	<li>Miscelare 10 µ l diluizione proteina standard o diluizione preparati campioni e 10 µ l 2 x tampone di caricamento (120 millimetri Tris-HCl pH 6.8, 20% glicerolo, 4% SDS, 0,2% blu di bromofenolo, 200 mM DTT) insieme.</li>
</ol><table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>S1 (0pg / µ l)</td>
			<td>S2 (33.3pg / µ l)</td>
			<td>S3 (100pg / µ l)</td>
			<td>S3 (300pg / µ l)</td>
			<td>S5 (600pg / µ l)</td>
			<td>S6 (1200pg / µ l)</td>
		</tr>
<tr>
<td>protein(1200pg/µl) standard</td>
			<td>0</td>
			<td>1.39</td>
			<td>4.17</td>
			<td>12.5</td>
			<td>25</td>
			<td>50</td>
		</tr>
<tr>
<td>IgG BSA gratis (4pg / µ l)</td>
			<td>50</td>
			<td>48,61</td>
			<td>45,83</td>
			<td>37.5</td>
			<td>25</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>totale</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1. Schema di diluizione per curva standard della proteina.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>X1 (0µg / µ l)</td>
			<td>X2 (0.25µg / µ l)</td>
			<td>X3 (0.5µg / µ l)</td>
			<td>X4 (1 µ g / µ l)</td>
			<td>X5 (2 µ g / µ l)</td>
			<td>X6 (4 µ g / µ l)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sample(4µg/µl)</td>
			<td>0</td>
			<td>3.125</td>
			<td>6.25</td>
			<td>12.5</td>
			<td>25</td>
			<td>50</td>
		</tr>
<tr>
<td>IgG BSA(4µg/µl) gratis</td>
			<td>50</td>
			<td>46.875</td>
			<td>43,75</td>
			<td>37.5</td>
			<td>25</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>totale</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 2. Schema di diluizione per campioni preparati
<ol start="6"><li>Riscaldare le miscele a 85 ° C per 5 min.</li>
</ol>4. il processo di analisi QDB
<ol><li>
Applicazione di esempio
	<ol>
<li>Il QDB piastra per evitare il fondo del piatto toccando la superficie del tavolo di supporto. Per esempio, è possibile utilizzare una casella di punta di pipetta vuoto come supporto.</li>
		<li>Caricare fino a 2 µ l del campione al centro della membrana nella parte inferiore dell'unità individuali della piastra QDB.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
La piastra di secchezza
	<ol>
<li>La piastra QDB caricata per 1 h di lasciare la camera temperato (RT) o in alternativa lasciare la piastra caricata a 37 ° C per 15 min in uno spazio ben ventilato.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
La piastra di blocco
	<ol>
<li>Immergere la piastra QDB nel buffer di trasferimento (0,039 M glicina, 0,048 M Tris, 0,37% SDS, 20% alcool metilico) e scuotere delicatamente la piastra per 10 s.</li>
		<li>Sciacquare la piastra QDB delicatamente con TBST (Tris-buffered saline, 0.1% Tween 20) tre volte e poi lavare la piastra per 5 min in TBST sotto agitazione costante.</li>
		<li>Bloccare la piastra QDB con tampone bloccante (5% di latte scremato in TBST (100 µ l/pozzetto) per 1 h sotto agitazione costante.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Incubazione dell'anticorpo primario
	<ol>
<li>Diluire l'anticorpo primario in tampone bloccante ad una concentrazione selezionata (da 1:500 a 1:5 000) e aggiungere 100 µ l a ciascun pozzetto individuo di una piastra ben 96 ordinaria. Inserire la piastra QDB nella piastra ben 96 e incubare le piastre combinate sia per 2 h a temperatura ambiente o durante la notte a 4 ° C sotto agitazione costante.</li>
		<li>In alternativa, posizionare la piastra QDB all'interno di una scatola e riempire la casella con tampone bloccante 2-3 mm sopra la parte di membrana della piastra se lo stesso anticorpo è usato per tutta la piastra. Aggiungere l'anticorpo primario alla concentrazione selezionata e incubare la piastra sia per 2 h a temperatura ambiente o durante la notte a 4 ° C di sotto agitazione costante.</li>
		<li>Sciacquare la piastra delicatamente con TBST per tre volte prima viene lavata con TBST per tre volte, ogni volta per 5 min sotto agitazione costante.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Incubazione dell'anticorpo secondario
	<ol>
<li>Diluire l'anticorpo secondario in tampone bloccante la concentrazione selezionata (da 1:1, 000 a 01:50, 000), e a entrambi aliquota 100 µ l/pozzetto in una piastra ben 96 o in una casella come descritto in sezione 4.4.2 e poi incubare la piastra QDB all'interno sia il pla ben 96 caricato te o la casella per 1h a RT in agitazione costante.</li>
		<li>Sciacquare la piastra QDB delicatamente 3 volte con TBST, poi lavare la piastra per 3 volte, 5 minuti ciascuno con TBST sotto agitazione costante.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Quantificazione
	<ol>
<li>Preparare substrato di chemiluminescenza (ECL) seguendo le istruzioni del produttore.</li>
		<li>Substrato di ECL aliquota in un 96 ben piatto (100 µ l/pozzetto) e inserire la piastra QDB all'interno della piastra ben 96 per 2 min sotto agitazione costante.</li>
		<li>Rimuovere la piastra QDB dalla piastra ben 96 e agitare brevemente per togliere il liquido in eccesso. Posizionare la piastra su una micropiastra bianca.</li>
		<li>Accendere il lettore di micropiastre e selezionare "piastra con coperchio" sull'interfaccia utente prima di posizionare le piastre combinate (piastra QDB + adattatore piatto bianco) all'interno del lettore di micropiastre per quantificazione. Nota: Assicurarsi di utilizzare la piastra per microtitolazione bianca, non trasparente come un adattatore per evitare qualsiasi interferenza dalla piastra. Assicurarsi di scegliere "piatto con copertura" per evitare inceppamenti della macchina quando combinato piastre (QDB piastra + 96 ben piastra adattatore) sono collocati all'interno del lettore di micropiastre.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Renart, J., Reiser, J., Stark, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+of+proteins+from+gels+to+diazobenzyloxymethyl-paper+and+detection+with+antisera%3A+a+method+for+studying+antibody+specificity+and+antigen+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: a method for studying antibody specificity and antigen structure.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (7), 3116-3120 (1979).</li>
<li>Burnette, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22Western+blotting%22%3A+electrophoretic+transfer+of+proteins+from+sodium+dodecyl+sulfate--polyacrylamide+gels+to+unmodified+nitrocellulose+and+radiographic+detection+with+antibody+and+radioiodinated+protein+A%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">"Western blotting": electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A.</a> Anal Biochem. 112 (2), 195-203 (1981).</li>
<li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets%3A+procedure+and+some+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li>
<li>Uhlen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+proposal+for+validation+of+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A proposal for validation of antibodies.</a> Nat Methods. 13 (10), 823-827 (2016).</li>
<li>Hawkes, R., Niday, E., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dot-immunobinding+assay+for+monoclonal+and+other+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A dot-immunobinding assay for monoclonal and other antibodies.</a> Anal Biochem. 119 (1), 142-147 (1982).</li>
<li>Engvall, E., Perlmann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme-linked+immunosorbent+assay+%28ELISA%29.+Quantitative+assay+of+immunoglobulin%5BTitle%5D)+AND+%22G.+Immunochemistry%22%5BJournal%5D)">Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Quantitative assay of immunoglobulin.</a> G. Immunochemistry. 8 (9), 871-874 (1971).</li>
<li>Engvall, E., Jonsson, K., Perlmann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme-linked+immunosorbent+assay.+II.+Quantitative+assay+of+protein+antigen%2C+immunoglobulin+G%2C+by+means+of+enzyme-labelled+antigen+and+antibody-coated+tubes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Enzyme-linked immunosorbent assay. II. Quantitative assay of protein antigen, immunoglobulin G, by means of enzyme-labelled antigen and antibody-coated tubes.</a> Biochim Biophys Acta. 251 (3), 427-434 (1971).</li>
<li>Paweletz, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+phase+protein+microarrays+which+capture+disease+progression+show+activation+of+pro-survival+pathways+at+the+cancer+invasion+front%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Reverse phase protein microarrays which capture disease progression show activation of pro-survival pathways at the cancer invasion front.</a> Oncogene. 20 (16), 1981-1989 (2001).</li>
<li>Tibes, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+phase+protein+array%3A+validation+of+a+novel+proteomic+technology+and+utility+for+analysis+of+primary+leukemia+specimens+and+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">Reverse phase protein array: validation of a novel proteomic technology and utility for analysis of primary leukemia specimens and hematopoietic stem cells.</a> Mol Cancer Ther. 5 (10), 2512-2521 (2006).</li>
<li>Solier, C., Langen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody-based+proteomics+and+biomarker+research+-+current+status+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Antibody-based proteomics and biomarker research - current status and limitations.</a> Proteomics. 14 (6), 774-783 (2014).</li>
<li>Tian, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+dot+blot+analysis+%28QDB%29%2C+a+versatile+high+throughput+immunoblot+method%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Quantitative dot blot analysis (QDB), a versatile high throughput immunoblot method.</a> Oncotarget. 8 (35), 58553-58562 (2017).</li>
</ol>

Gli autori Yunyun Zhang, Wenfeng Zhang e Jiandi Zhang sono dipendenti di Zestern Biotechniques che produce lastre QDB utilizzate in questo articolo. Wenfeng Zhang e Yunyun Zhang dichiarare il conflitto di interessi, e Jiandi Zhang ha presentato domande di brevetto. Gli altri non sostengono interessi concorrenti.

Tra tutte le tecniche attuali di immunoassay disponibili di analisi della proteina tranne ELISA, analisi QDB sono l'unico metodo per ottenere contenuto assoluto di una proteina specifica a livello cellulare e tessutale in un formato di throughput elevato. Anche se con standard con etichetta isotopo stabile, spettrometria di massa è in grado di raggiungere quantificazione assoluta di alcune proteine, questo metodo non è ancora progettato per alte prestazioni. In questo studio, abbiamo dimostrato il processo di analisi QDB raggiungere assoluta determinazione del livello della proteina CAPG nei tessuti del mouse tra cui rene, milza e la prostata. CAPG livelli sono stati trovati per essere tra 200 a 360 pg/g nei tessuti del rene del mouse, 460 a 650 pg/g in milze del mouse e 330 a 390 pg/g nei tessuti della prostata del mouse.
Rispetto a ELISA, QDB analisi richiede sforzi minimi per essere sviluppato in un normale laboratorio. In primo luogo, la piastra QDB è basato su una membrana di nitrocellulosa per eliminare il passo di rivestimento in ELISA. In secondo luogo, analisi QDB richiede solo uno invece di due anticorpi specifici in un sandwich ELISA. In terzo luogo, la capacità di legame di membrana di nitrocellulosa rispetto la superficie della piastra ELISA consente inoltre la membrana sopportare i passaggi di lavaggio rigorose in genere utilizzati nell'analisi di immunoblot per ridurre le interferenze di sfondo. Questa funzione è molto utile per analizzare complicati lisati preparato dalle cellule e tessuti. Al contrario, a causa della capacità di associazione relativamente basso delle piastre ELISA, la riduzione dello sfondo quando si analizzano complicati lisati cellulari e tissutali diventa una vera e propria sfida nel processo inerente allo sviluppo.
Analisi QDB possono essere adottata facilmente in qualsiasi laboratorio con l'accesso di un anticorpo specifico. Tuttavia, è importante ricordare che la specificità dell'anticorpo è un termine relativo, limitato da fattori tra cui la specie, i tipi di tessuto e delle cellule. Come illustrato nella Figura 1A, CAPG anticorpo è specifico quando si analizzano lisato da prostata, milza e rene del topo e diventa ancora non specifici quando si analizza il fegato di topo. In realtà, abbiamo trovato ordinariamente un anticorpo ad essere specifici per il tipo di un tessuto, ma non sempre specifiche per altro tipo di tessuto dalla stessa specie. Così, l'analisi western blot preventiva è necessario garantire la specificità dell'analisi QDB. Infatti, la relativa specificità dell'anticorpo può essere la causa di risultati falsi, spesso associati all'analisi ELISA, come non importa quanto sforzo dell'azienda di produzione può avere speso per garantire la specificità del test, non può esaurire tutte le possibili tipi di campioni gli utenti possono scegliere di analizzare l'utilizzo dei loro prodotti di ELISA.
Come con tutti i test immunologici, un potenziale problema con il metodo di analisi QDB è la mancanza di coerenza della qualità dell'anticorpo commerciale. Anche se la qualità apparente di un anticorpo dalla stessa azienda (stesso catalogo numero ecc.) viene utilizzato, ci potrebbero essere grandi differenze da un acquisto a un altro a causa della variabilità lotto. Pertanto, a meno che nella qualità dell'anticorpo disponibile è raggiunto piena fiducia, ri-che caratterizza l'anticorpo su ogni acquisto è importante.
In sintesi, forniamo qui un protocollo dettagliato e un esempio quando si utilizza il metodo di analisi QDB per raggiungere assoluta determinazione quantitativa di una proteina specifica a livello tissutale. Indichiamo che il metodo di analisi QDB è un comodo strumento per chiunque sia interessato a resa elevata, l'analisi di immunoblot quantitativa. Sua capacità di raggiungere l'assoluta determinazione del contenuto di una specifica proteina a livello cellulare e tissutale anche distinguere questa tecnica da immunoblot tradizionali tecniche. Questa funzionalità consente la combinazione ed il confronto dei risultati delle analisi multiple, un passo necessario soprattutto nei più grandi studi di popolazione e la realizzazione di studi di associazione relativa al livello della proteina nel prossimo futuro.

A fianco con gli avanzamenti emozionanti nella ricerca genomica negli ultimi anni, campo di ricerca biomedica testimonia anche l'avanzamento significativo nella ricerca proteomica. Con l'aumento dell'accumulo di dati biologici a entrambi di genomica e proteomica livelli, utilizzando strumenti bioinformatici per analizzare questi dati è diventata il fulcro della ricerca biomedica in futuro percepibile. Di conseguenza, il successo di bioinformatical ricerca genera domanda di maggiore e migliore qualità dei dati della comunità di ricerca biologica e medica, un'attività può essere raggiunto solo attraverso avanzamento tecnica in genomica e proteomica livelli.
Spettrometria di massa (MS) e l'analisi di immunoblot sono attualmente prevalente due tecniche di analisi della proteina. MS ha dominato la ricerca proteomica negli ultimi anni per consentire l'analisi di migliaia di singole proteine contemporaneamente. Le tecniche basate su immunoblot, tra cui il western blot e macchia del puntino, d'altra parte, hanno anche svolto un ruolo significativo nella ricerca della proteina anche dal suo invenzione1,2,3,4, 5. Enzima collegata dell'immunosorbente (ELISA) dosaggio5,6,7 e fase inversa proteina microarray (RPPM)8,9 può essere considerato il formato elevato throughput di immunoblot analisi. Tuttavia, tutti questi metodi di immunoassay, tranne ELISA, misurano il livello di espressione relativa di una proteina specifica. Il carattere relativo di questi metodi diventerà un vero problema per gli studi di popolazione, come l'analisi deve essere fatto allo stesso tempo, impedendo qualsiasi gli sforzi per aumentare la dimensione del pool attraverso analisi multiple. Inoltre, i risultati derivati da questi studi sono solo semi-quantitativi, complicando così eventuali sforzi di bioinformatica nell'analisi dei dati. Nel frattempo, anche se ELISA è adatta per analisi assoluta throughput elevato di campioni della proteina, questa tecnica sembra di affrontare sfide in ambienti complessi come le cellule o tessuti a causa della sua capacità di legare basso e multiplexing10.
Abbiamo sviluppato un metodo di immunoblot adatto per gli studi di popolazione con le caratteristiche chiave di essere conveniente, ad alta velocità effettiva, quantitativa e adatto per assoluta determinazione del tenore di proteine e denominato questa macchia del puntino quantitativa di tecnica analisi (QDB)11. In questo studio, presentiamo un protocollo dettagliato per analisi QDB e dimostrare il metodo di determinazione del contenuto di proteina assoluta di una proteina specifica, CAPG, in tre tessuti del mouse differenti tra cui rene, milza e la prostata. Pensiamo che questo protocollo dettagliato illustra bene la fattibilità e la convenienza di questo metodo e fornire indicazioni su come evitare i trabocchetti potenziali nella pratica di questo metodo.

<table><tbody><tr><td>Lettore di micropiastre</td><td>Tecan</td><td>Tecan Infinite 200 PRO</td><td></td></tr><tr><td>QDB plate</td><td>Yantai Zestern Co.Ltd</td><td></td><td>Le piastre sono disponibili su richiesta a scopo di verifica tramite e-mail o visitando www.zestern.net.</td></tr><tr><td>Perossidasi AffiniAsino puro Anti-coniglio IgG (H+L) (min X Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rat, Shp Sr Prot)</td><td>jackson</td><td>&nbsp; 711-035-152</td><td></td></tr><tr><td>Substrato di chemiluminescenza potenziato</td><td>Thermo</td><td>32134</td><td></td></tr><tr><td>Coniglio anti-CAPG&nbsp;</td><td>Sino Biologic Inc</td><td>14213-T52</td><td></td></tr><tr><td>Proteina CAPG</td><td>Sino Biologic Inc</td><td>14213-HNAE</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Nacl</td><td>Tianjin Ruiji Jin special Chemical Co., Ltd</td><td>10461220</td><td></td></tr><tr><td>Mgcl2</td><td>Tianjin Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>20120802</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E9884-500G</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>BNN1913</td><td></td></tr><tr><td>Na2P2O7</td><td>Haituo test di medicina cinese</td><td>20160914</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Sigma</td><td>G7757</td><td></td></tr><tr><td>fenilmetilsulfonilfluoruro</td><td>Sigma</td><td>P7626-5G</td><td></td></tr><tr><td>pepstatina</td><td></td><td>Sigma Z290033</td><td></td></tr><tr><td>leupeptin</td><td>Sigma</td><td>L2884</td><td></td></tr><tr><td>aprotinina</td><td>Sigma</td><td>A3428</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCL</td><td>Sigma</td><td>T6455</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma</td><td>L5750-500G</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>43815-1G</td><td></td></tr><tr><td>Blu Bromfenolo</td><td>Sigma</td><td>B-0126</td><td></td></tr><tr><td>NaF</td><td>Sigma</td><td>S7920</td><td></td></tr></tbody></table>

high throughput, assoluta determinazione del contenuto di una proteina selezionato presso i livelli del tessuto utilizzando quantitativi dot blot analisi (qdb)

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis (QDB)

In mancanza di un conveniente, metodo immunoblot quantitativa, high throughput per assoluta determinazione del contenuto di una specifica proteina a livello cellulare e tissutale significativamente ostacola il progresso della ricerca proteomica. Risultati derivati dalle tecniche di immunoblot attualmente disponibili sono anche relativi, impedendo qualsiasi sforzo di combinare studi indipendenti con un'analisi su larga scala di campioni della proteina. In questo studio, dimostriamo il processo di analisi di quantitativi dot blot (QDB) per raggiungere quantificazione assoluta in un formato di throughput elevato. Utilizzando uno standard di proteina commercialmente disponibili, siamo in grado di determinare il contenuto assoluto di tappatura proteina actina, gelsolin-come (CAPG) nei campioni della proteina preparato da tre tessuti di diverso tipo di mouse (rene, milza e prostata) insieme ad una dettagliata spiegazione dei dati sperimentali. Vi proponiamo l'analisi QDB come metodo immunoblot conveniente, quantitativi, ad alta velocità effettiva di quantificazione assoluta delle singole proteine a livello cellulare e tissutale. Questo metodo sarà sostanzialmente di aiuto biomarcatore validazione e verifica di percorso nelle varie aree di ricerca biologica e medica.

La determinazione della quantità assoluta di proteine tra cui la proteina CAPG nel tessuto del mouse richiede sia un anticorpo specifico e una proteina purificata come standard. La gamma lineare delle analisi della proteina standard sia i lisati deve inoltre essere stabilito prima di qualsiasi analisi su larga scala. La gamma lineare dell'anticorpo è altamente dipendente dell'anticorpo di per sé, e la gamma di diluizione appropriata di un anticorpo specifico devono essere verificati da ogni singolo utente.
Abbiamo determinato in primo luogo la specificità dell'anticorpo CAPG in rene del topo, milza e prostata tessuti mediante analisi western blot con il controllo negativo (IgG gratis BSA) e il controllo positivo (proteina CAPG commercialmente disponibile) (Figura 1A). L'anticorpo anti-CAPG era specifico contro lisati da mouse milza, cuore, muscolo e prostata (una banda rilevata). Fasce non specifiche sono state osservate nei lisati dal rene e fegato. Tuttavia, nel rene lisato, le fasce non specifiche sono state significativamente più debole rispetto alla banda specifica, che suggerisce che l'anticorpo è adatto per l'analisi del tessuto del rene. Successivamente, la gamma lineare della proteina standard e la quantità di lisati per le analisi sono state determinate mediante due curve dose di fianco a fianco. Una proteina CAPG disponibile in commercio è stata diluita in serie come indicato in tabella 1 in base alle nostre esperienze passate e i lisati di tessuto del rene del mouse, della milza e della prostata sono stati diluiti anche basato sulla quantità di proteine totali nei lysates determinato di un kit di determinazione della proteina totale BCA. Due studi a dose sono stati eseguiti fianco a fianco e tracciati insieme nella Figura 1B. La quantità appropriata di lisati di rene del topo, la milza e la prostata sono stati scelti in base sui segnali QDB misurati con il lettore di micropiastre in unità arbitrarie. La lettura originale per questo esperimento è mostrata nella tabella 3.
Nell'ultimo passaggio, lo standard di proteina CAPG diluito serialmente e i lisati dal rene del topo, milza e della prostata sono stati caricati sulla piastra QDB. In questo caso, abbiamo scelto di carico 0.3 µ g/campione per lisati dal rene del topo e della milza e 1 µ g/campione per lisati da analisi di prostate di mouse, come a questi livelli, la lettura di QDB era almeno 20 volte sopra il fondo mentre ben all'interno della gamma lineare dell'analisi basato sulla curva dose di entrambi i lisati e la proteina standard. La piastra è stato sottoposto al protocollo QDB descritto prima la piastra è stata quantificata direttamente tramite il lettore di micropiastre. Utilizzando la proteina purificata in serie diluita di CAPG, potremmo stabilire una curva dose-risposta, l'equazione e R2 dall'analisi di regressione semplice utilizzando il software disponibile (ad esempio Microsoft office excel). Il QDB segnali da lisati di reni del mouse, milze e prostate sono state convertite nella quantità assoluta di proteine CAPG in questi lisati mediante l'equazione stabilita, e i risultati sono stati corretti dalla quantità della proteina totale, in questo caso, 0,3 µ g di lisati da milze del mouse e reni e 1 µ g di lisati da prostate del mouse, per la concentrazione finale della proteina CAPG in questi tessuti come pg / µ g. I risultati sono mostrati in Figura 1C con la lettura originale illustrata nella tabella 4.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56885/56885fig1.jpg"> Figura 1 . Risultato rappresentativo di un'analisi QDB per determinare i livelli assoluti di CAPG in tre tessuti di topo (rene, milza e della prostata). R. esaminando la specificità dell'anticorpo di coniglio anti-CAPG utilizzando lisati di tessuto del mouse preparato dalla milza, cuore, muscolo, rene, fegato e prostata mediante western blot analisi con il controllo negativo (IgG gratis BSA) e il controllo positivo (commercialmente proteina CAPG disponibile). B. definire le analisi di gamma lineare di QDB dell'anticorpo di coniglio anti-CAPG utilizzando lisati preparato dalla prostata, rene, milza e usando purificato ricombinante proteina CAPG standard. I risultati sono stati mediamente di triplici copie. C. assoluta determinazione dei livelli di CAPG nei lysates preparato da prostate, milza e reni del mouse. Ogni barra rappresenta un tessuto da un mouse individuo. I risultati sono stati la media dei tre esemplari. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/56885/56885fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Table 3" src="/files/ftp_upload/56885/56885table3.jpg"> Tabella 3: Il risultato di lettore di micropiastre degli studi dose usando entrambi diluito serialmente, pool lysates dalle milze del mouse, i reni e prostate e proteina CAPG ricombinante purificata.
<img alt="Table 4" src="/files/ftp_upload/56885/56885table4.jpg">
Tabella 4: Risultato da lettore di micropiastre dell'analisi QDB del livello assoluto CAPG in reni del mouse (8), milze (4) e prostate (5) utilizzando una proteina ricombinante CAPG come standard.

Qui dimostriamo un dettagliato processo di analisi di quantitativi dot blot (QDB) determinando il contenuto assoluto di una proteina mirato, tappatura proteina actina, gelsolin-come (CAPG), in tre tessuti di diverso tipo di mouse. Dimostriamo un throughput elevato, la tecnica di immunoblot conveniente, quantitativa per la convalida di biomarcatore a livello cellulare e tissutale.

High Throughput, assoluta determinazione del contenuto di una proteina selezionato presso i livelli del tessuto utilizzando quantitativi Dot Blot analisi (QDB)

Lacking a convenient, quantitative, high throughput immunoblot method for absolute determination of the content of a specific protein at cellular and ...

Questo metodo può essere chiamato ELISA a livello tissutale per prendere le distanze dalla tradizionale quantificazione semiquantitativa relativa del contenuto proteico a livello cellulare e tissutale, che è attualmente la norma nei laboratori di ricerca e nel campo della diagnostica clinica. I principali vantaggi di questa tecnica possono essere descritti in tre parole: ad alto rendimento, quantitativo e assoluto. Se dovessimo aggiungere un'altra parola, sarebbe semplice.Le implicazioni di questa tecnica si estendono al campo della proteomica, mentre la verifica dei biomarcatori può essere ottenuta in formato ad alto rendimento. Questo metodo ha ampie applicazioni in tutto il campo della ricerca e della clinica. La quantificazione della quantità di proteine a livello cellulare e tissutale è ancora primitiva al momento.In generale, le persone che non conoscono questo metodo non avranno problemi ad apprendere questa tecnica ed è piuttosto semplice e richiede competenze di laboratorio minime per essere eseguita. Siamo entusiasti di dimostrare la sua affidabilità, semplicità e accuratezza della tecnica utilizzando il modello animale. I campioni possono essere preparati con qualsiasi metodo tradizionale di preparazione dei campioni utilizzando qualsiasi tampone di lisi comunemente usato nel laboratorio di ricerca con o senza detergente come MP40 o Triton X.In nostro caso, utilizziamo il tampone di lisi Triton X.Metti una fetta di tessuto da cinque a 100 milligrammi in una provetta da 1,5 millilitri. Successivamente, aggiungere 200 microlitri di tampone di lisi integrato con inibitori della proteasi e della fosfatasi. Quindi, omogeneizzare il tessuto con un omogeneizzatore per un minuto sul ghiaccio.Quindi centrifugare il campione per 10 minuti a 8.000 volte g a quattro gradi Celsius. Raccogliere il surnatante in nuove provette ed estrarre un microlitro per misurare la quantità totale di proteine nel lisato proteico utilizzando un kit per la determinazione delle proteine come un test BCA. Incubare per 30 minuti a 37 gradi Celsius, quindi misurare l'assorbanza a 562 nanometri su un lettore di micropiastre.In questa fase, utilizzando una proteina ricombinante con concentrazione nota come standard, diluire la proteina a una concentrazione di 12.000 picogrammi per microlitro come soluzione madre. Nel frattempo, diluire il lisato del campione preparato a quattro microgrammi per microlitro. Per ottenere risultati più affidabili, si consiglia di utilizzare una miscela di lisati campione per evitare qualsiasi differenza tra i singoli campioni.Diluire in serie sia la proteina standard che i campioni preparati per uno studio della dose tipica. La BSA è stata integrata per garantire quantità approssimativamente uguali di proteine caricate per ciascun campione. Successivamente, mescolare 10 microlitri di proteina standard diluita in serie o di lisati campione con 10 microlitri di tampone di caricamento 2X.Quindi scaldare il composto a 85 gradi Celsius per cinque minuti. In questa procedura, posizionare una scatola vuota dei puntali della pipetta sotto la piastra QDB per evitare che la parte inferiore della piastra tocchi la superficie del tavolo. Caricare fino a due microlitri di campione al centro della membrana nella parte inferiore di una singola unità della piastra QDB.Non lasciare mai che la parte inferiore della piastra QDB tocchi alcuna superficie durante il caricamento e non caricare troppo per il singolo pozzetto. Nella nostra esperienza, non più di quattro microlitri per pozzetto. Quindi, lasciare la piastra QDB caricata per un'ora a temperatura ambiente o lasciare la piastra caricata a 37 gradi Celsius per 15 minuti in uno spazio ben ventilato.Per bloccare la piastra, immergere la piastra QDB nel tampone di trasferimento e agitarla delicatamente per 10 secondi. Successivamente, sciacquare delicatamente la piastra QDB con TBST tre volte e quindi lavare la piastra per cinque minuti in TBST agitando costantemente. Successivamente, bloccare la piastra QDB con tampone di blocco per un'ora sotto agitazione costante.Ora, diluire l'anticorpo primario nel tampone bloccante a una concentrazione scelta e aggiungerne 100 microlitri a ogni singolo pozzetto di una normale piastra da 96 pozzetti. Inserire la piastra QDB nella piastra a 96 pozzetti e incubare le piastre combinate per due ore a temperatura ambiente o durante la notte a quattro gradi Celsius sotto agitazione costante. Successivamente, sciacquare delicatamente la piastra con TBST tre volte prima di lavarla con TBST tre volte ogni volta per cinque minuti agitando costantemente.Quindi, diluire l'anticorpo secondario nel tampone bloccante alla concentrazione scelta e aliquotare 100 microlitri in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti. Quindi incubare la piastra QDB all'interno della piastra caricata a 96 pozzetti per un'ora a temperatura ambiente sotto agitazione costante. Sciacquare delicatamente la piastra QDB tre volte con TBST e poi lavare la piastra tre volte cinque minuti ciascuna con TBST sotto agitazione costante.Per la quantificazione, preparare il substrato ECL e aliquotarlo in una piastra da 96 pozzetti a 100 microlitri per pozzetto. Quindi inserire la piastra QDB all'interno della piastra a 96 pozzetti per due minuti agitando costantemente. Successivamente, rimuovere la piastra QDB dalla piastra a 96 pozzetti e agitare brevemente per rimuovere il liquido in eccesso.Successivamente, posizionare la piastra su una piastra per microtitolazione bianca. Quindi, accendere il lettore di micropiastre e selezionare la piastra con coperchio sull'interfaccia utente prima di posizionare le piastre combinate all'interno del lettore di micropiastre per la quantificazione. Assicurati di scegliere la piastra con coperchio per evitare errori.Questa figura mostra la specificità dell'anticorpo anti-CAPG del coniglio utilizzando lisati di tessuto di topo preparati da milza, cuore, muscoli, reni, fegato e prostata con analisi western blot. È stato definito l'intervallo lineare dell'analisi QDB degli anticorpi anti-CAPG di coniglio utilizzando lisati preparati da prostata, rene, milza e utilizzando lo standard proteico CAPG ricombinante purificato. I risultati sono stati una media di triplicati.E qui è mostrata la determinazione assoluta dei livelli di CAPG nei lisati preparati da reni, milza e prostata di topo. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in quattro-24 ore se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di utilizzare un anticorpo specifico predeterminato per l'intera procedura.Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come l'analisi biostatistica, al fine di rispondere a ulteriori domande, raggiungibili solo attraverso la misurazione assoluta del contenuto proteico individuale a livello cellulare o tissutale. Sin dal suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della ricerca proteomica per esplorare la relazione putativa dei biomarcatori proteici con varie malattie a livello di popolazione. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire l'analisi QDB in formato ad alto rendimento.Non dimenticare che lavorare con tessuti umani o animali può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come l'uso di guanti.

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