Microscopia elettronica a trasmissione come tecnica di visualizzazione per l'analisi della plasticità sinaptica circadiana nella corteccia del barile del topo

Siamo interessati alla plasticità neurale, in particolare ai cambiamenti circadiani nella plasticità delle sinapsi, dei neuroni e delle cellule gliali. Stiamo cercando di rispondere alla domanda su come le sinapsi si trasformano durante il giorno e la notte e in condizioni patologiche. Gli sviluppi più recenti nel nostro campo di studi riguardano l'utilizzo di vari strumenti genetici per manipolare l'espressione genica, utilizzando anche metodi per visualizzare i cambiamenti nel cervello, così come esiste un numero crescente di modelli animali per studiare le malattie neurodegenerative. Abbiamo scoperto, utilizzando il microscopio a trasmissione elettronica, che il numero di sinapsi nella corteccia cilindrica dei topi cambia durante il giorno e la notte. E questo ritmo è anche circadiano, almeno in caso di sinapsi inibitorie. Poiché le sinapsi inibitorie, aumentano di numero durante la notte, mentre le sinapsi eccitatorie aumentano durante il giorno. Cambiamenti simili li abbiamo trovati nel cervello del moscerino della frutta. In questa specie, anche il numero di sinapsi cambia durante il giorno e la notte. Inoltre, abbiamo riscontrato cambiamenti strutturali nella forma dei neuroni e delle cellule gliali.

[Narratore] Per iniziare, prendi il cervelletto del topo e dividi il cervello in due emisferi. Scegli una semisfera e orientala in modo che le sezioni possano essere tagliate tangenzialmente alla corteccia del barile. Quindi, tagliare le sezioni a uno spessore di 60 micrometri e trasferirle in una soluzione contenente tampone fosfato molare 0,1 molare e fissativo in un rapporto di uno a cinque. Esamina le sezioni al microscopio ottico e raccogli solo quelle sezioni che mostrano chiaramente la corteccia del campo a botte. Usando un pennello, trasferisci delicatamente le sezioni in una piccola capsula di Petri di vetro. Sciacquare le sezioni cerebrali con cacodilato molare da 0,1 molari. Quindi, fissare le sezioni in tetrossido di osmio all'1% in tampone cacodilato molare 0,1 con ferricianuro di potassio all'1,5%. Una volta che le sezioni sono state sciacquate in acqua distillata, utilizzare una siringa con un filtro da 25 millimetri per erogare lentamente etanolo al 70% contenente l'1% di acetato di uranile in ciascuna piastra di Petri con fazzoletti. Dopo l'incubazione notturna in etanolo al 70% a quattro gradi Celsius, lavare i fazzoletti in etanolo all'80%, 90% e 100%. Quindi, lavare i fazzoletti due volte in ossido di propilene per 10 minuti ciascuno. Quindi, sostituire l'ossido di propilene con due millilitri di una miscela uno-a-uno di resina Poly/Bed e ossido di propilene. Coprire con un coperchio e incubare per 40 minuti. Incorporare le sezioni cerebrali in due millilitri di una miscela tre a uno di resina Poly/Bed e ossido di propilene. Coprire e lasciare agire per 1,5 ore. Quindi, tagliare la pellicola ACLAR in pezzi che corrispondano alle dimensioni di un vetrino standard. Utilizzando una pipetta di plastica, applicare un piccolo volume di resina su ciascun pezzo di pellicola ACLAR. Con un pennello, trasferire le sezioni del cervello dalla capsula di Petri alla resina sulla pellicola ACLAR. Incorporare ogni sezione tra due film ACLAR e incubare per polimerizzare. Utilizzando un microscopio ottico con un obiettivo a due tempi, fotografare le sezioni cerebrali incorporate. Per aprire le immagini, fare clic su File e apri, selezionare le immagini tenendo premuto Maiusc e fare clic su Apri. Inizia a impilare le immagini dalla corteccia. Fare clic con il pulsante destro del mouse sul livello 1 in ogni immagine, selezionare Duplica livello e immettere il numero dell'immagine come nome nella finestra di dialogo. Scegli un'immagine come file di destinazione e fai clic su OK. Quindi, usa lo strumento Sposta per allineare manualmente le immagini e regola l'orientamento con Modifica, Trasforma, Ruota o Capovolgi secondo necessità. Per regolazioni più precise, utilizzare Modifica, Trasforma, Distorci e spostare gli angoli singolarmente in modo che corrispondano ai punti di riferimento anatomici. Impostate il metodo di fusione del livello superiore da sovrapporre nel pannello Livelli per facilitare l'allineamento. In ogni sezione che mostra la corteccia del barile, usa uno stereomicroscopio per identificare il barile selezionato e taglialo insieme a quello adiacente usando una lama di rasoio. Dopo aver incorporato la sezione in un blocco di resina, raccogli le sezioni ultrasottili su griglie di nichel a fessura singola rivestite di Formvar. Dopo aver allineato lo stack di immagini GST come illustrato in precedenza, definire l'area di analisi. Fare clic su Livello, quindi su Nuovo e Livello, quindi fare clic su OK. Seleziona lo strumento Rettangolo, vai su Livello, Stile livello, Traccia. Impostate il colore, lo spessore e la posizione del tratto all'interno, quindi fate clic su OK. A questo punto, disegnare un rettangolo per definire il limite dell'analisi e selezionare Riempimento 0%. Per aggiungere un nuovo livello per le annotazioni, selezionare Livello, Nuovo, Livello, quindi fare clic su OK. Utilizzare lo strumento pennello per contrassegnare le sinapsi su questo livello. Usa gli strumenti Zoom e Mano per garantire la precisione durante l'annotazione. Ora apri la pila di immagini destinata alla ricostruzione 3D. Seleziona lo strumento Ritaglia, contrassegna la regione contenente il dorso dendritico attraverso la pila e premi Invio per ritagliare quella regione in tutti i livelli visibili. Per rendere visibile un solo livello alla volta, attivate o disattivate l'icona a forma di occhio nel pannello Livelli. Fare clic su File, Salva con nome, assegnare un nome al file, selezionare il formato JPG e fare clic su OK per salvare separatamente ogni immagine ritagliata. Aprire il software di ricostruzione 3D. Prima di caricare, fare clic su Z sul gizmo di navigazione o premere il tastierino numerico 7 per allineare la prospettiva del viewport. Quindi, per caricare le immagini, fai clic su Aggiungi, Immagine, Riferimento, quindi seleziona la prima immagine e fai doppio clic per confermare. Per posizionare l'immagine TEM finale lungo l'asse z, fare clic sull'immagine. Nel pannello Proprietà oggetto nella barra laterale destra, inserisci il valore appropriato nel campo Posizione Z. Per distribuire uniformemente tutte le immagini lungo l'asse z, selezionare tutti gli oggetti dell'immagine. Premere Fine per aprire il pannello Fine. Andate alla scheda Modifica (Edit) e fate clic su Distribuisci Z (Distribute Z) per spaziarli automaticamente in base allo spessore della sezione. Per delineare manualmente la forma della spina dendritica su ciascuna immagine TEM utilizzando una singola curva per immagine, fare clic su Aggiungi, Curva e Cerchio. Per spostare il cerchio, tieni premuto g, trascina il mouse, quindi fai clic per confermare il posizionamento. Tieni premuto s per regolare le dimensioni, quindi fai clic per confermare. Quindi, ridimensiona l'oggetto per allinearlo alla forma della spina dendritica. A questo punto, modificare la forma curva per adattarla al bordo della colonna vertebrale. Selezionare un punto di controllo, premere g, spostare il punto e fare clic per confermare. Utilizzare i tasti g o s secondo necessità per regolare i punti della maniglia, perfezionando la direzione e l'intensità della curva. Per aggiungere ulteriori dettagli, tieni premuto Maiusc e seleziona due punti di controllo adiacenti. Quindi fare clic con il pulsante destro del mouse e scegliere Suddividi per inserire un nuovo punto tra di loro. Una volta che la curva delinea accuratamente la spina dorsale, accedi alla scheda Layout, fai clic con il pulsante destro del mouse sull'oggetto cerchio di Bézier e scegli Duplica oggetto senza muovere il mouse. Per collegare gli spigoli dell'oggetto unito e formare una mesh chiusa, accedere alla scheda Modellazione. Premere 2 per passare alla modalità di selezione del bordo. Fare clic su Seleziona, Tutto, fare clic con il pulsante destro del mouse e scegliere Bridge Edge Loops per collegare gli anelli del bordo. Per riempire lo spazio vuoto nella parte superiore dell'oggetto, deseleziona tutto facendo clic su accanto ad esso. Tieni premuto Alt e fai clic su uno spigolo della sporgenza superiore per selezionare l'intero loop. Fare clic con il pulsante destro del mouse e scegliere Estrusione spigoli, quindi trascinare verso l'alto lungo l'asse z. Ora, premi s, sposta il mouse verso l'interno per ridurre il nuovo ciclo e fai clic per confermare. Con il loop ancora selezionato, fare clic con il pulsante destro del mouse e scegliere Nuova faccia da spigoli. Per smussare la struttura finale, vai alla scheda Modificatori nella barra laterale destra. Fare clic su Aggiungi modificatore, passare a Genera e selezionare Superficie di suddivisione. Impostare la finestra e i livelli di rendering su uno per un'uniformità uniforme. Per assegnare il colore alle singole strutture, selezionare l'oggetto desiderato. Apri la scheda Materiale nella barra laterale destra, fai clic su Nuovo e imposta il colore di base. Selezionare l'oggetto luce per regolare l'illuminazione della scena. Tenere premuto g, spostare il mouse per riposizionare la luce e fare clic per confermare la nuova posizione. Per posizionare la fotocamera per il rendering, orientare la finestra in modo che sia rivolta verso la spina dendritica come dovrebbe apparire nell'output finale. Premi Ctrl + Alt + 0 del tastierino numerico per agganciare la fotocamera alla vista corrente. Regola l'inquadratura della fotocamera selezionandola, tenendo premuto g e spostandola per perfezionare l'inquadratura. La corteccia somatosensoriale del topo era identificabile anche nelle sezioni del cervello non colorate e l'intero campo del barile poteva essere ricostruito utilizzando strumenti digitali nonostante la distribuzione dei singoli barili su più sezioni. Immagini TEM ultrasottili consecutive hanno permesso di classificare in modo affidabile le sinapsi in tipi eccitatori o inibitori sulla base di prove visive seriali. La ricostruzione tridimensionale delle spine dendritiche da sezioni seriali ha permesso la visualizzazione della morfologia della colonna vertebrale, rivelando diverse forme, come spine sottili, a fungo, tozze e intermedie. Le forme della colonna vertebrale sono state quantificate in base a misurazioni, tra cui la lunghezza della colonna vertebrale, la lunghezza del collo e i diametri della colonna vertebrale, della testa e del collo.