Clonazione shuttle basata su CRISPR: un metodo di clonazione ad alto rendimento

Descriviamo il nostro protocollo per un metodo di clonazione ad alto rendimento, CRISPRshuttle. Che comporta il trasferimento di frammenti di DNA bersaglio tra vettori senza la necessità di amplificazione PCR dei frammenti di DNA. Tecniche esistenti come l'infusione gateway e l'amplificazione PCR con clonaggio univettoriale. Questo approccio richiede procedure specifiche per i frammenti, tra cui la progettazione primaria e la convalida delle secrezioni. Questi tag sono laboriosi e richiedono molto tempo. La navetta CRISPR elimina la PCR durante il trasferimento di frammenti di DNA bersaglio tra vettori in reazioni sequenziali in provetta. Questo metodo supera la necessità di una manipolazione specifica del frammento e quindi accelera la costruzione del campione.

[Narratore] Per iniziare, preparare una miscela master per un determinato numero di reazioni digestive combinando i reagenti mostrati sullo schermo. Disporre i tubi da 0,2 millilitri correttamente etichettati in un blocco di raffreddamento di alluminio su ghiaccio. Preparare la miscela master per il numero N di reazioni mescolando quantità appropriate di CAS9, sgRNA, 10, tampone CAS9 e acqua trattata con DEPC. Mescolare accuratamente il master mix e centrifugarlo. Aliquotare 3,75 microlitri della miscela master in ciascuna provetta di reazione. Aggiungere 0,75 microlitri di plasmide PLX 304 ORF 0,03 micromolare a ciascuna provetta miscelata accuratamente e incubare le provette a 37 gradi Celsius per un'ora. Preparare una master mix combinando 0,14 microlitri di pBIDC-UASC-pLXvect linearizzato da 3,36 micromolari e 1,8 microlitri di master mix di assemblaggio Gibson. Mescolare accuratamente il master mix e centrifugarlo. Ora aliquote 1,94 microlitri della miscela master in ogni tubo. Aggiungere 1,66 microlitri di plasmide scisso CAS9 in ciascuna provetta. Mescolare accuratamente e incubare a 50 gradi Celsius per un'ora. Scongelare le cellule batteriche competenti sul ghiaccio. Aliquotare 10 microlitri di cellule scongelate in ciascuna provetta pre-raffreddata da 1,5 millilitri. Mescolare delicatamente 10 microlitri di cellule competenti con un microlitro di prodotto di assemblaggio Gibson. Mettere i tubi sul ghiaccio per 30 minuti. Scaldare i tubi a 42 gradi Celsius per un minuto, quindi raffreddarli con ghiaccio per due minuti. Aggiungere 100 microlitri di SOC preriscaldato in ogni provetta e agitare a 250 giri/min per un'ora a 37 gradi Celsius. Infine, posizionare le cellule su piastre di agar LB contenenti 15 microgrammi per millilitro di cloramfenicolo e incubarle per una notte a 37 gradi Celsius. Questa figura mostra i risultati rappresentativi dell'analisi di restrizione dei plasmidi UAS-cDNA/ORF generati utilizzando il sistema CRISPRshuttle. In questa analisi, la digestione di restrizione di 15 costrutti UAS-cDNA/ORF con PVU2 ha rivelato che tutti i campioni mostravano i modelli di frammenti attesi a circa 1072 coppie di basi e 1.820 coppie di basi.