Name: Clonazione shuttle basata su CRISPR: un metodo di clonazione ad alto rendimento (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-13T13:20:00.000+00:00
Duration: 4 min 25 s
Description: Scopri la clonazione shuttle basata su CRISPR per l'ingegneria genetica. Questo metodo ad alto rendimento trasferisce frammenti di DNA tra vettori senza PCR, riducendo tempi e risorse nelle manipolazioni genetiche complesse.

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<ol><li>Hartley, J. L., Temple, G. F., Brasch, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+cloning+using+in+vitro+site-specific+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">DNA cloning using in vitro site-specific recombination.</a> Genome Res. 10 (11), 1788-1795 (2000).</li>
<li>Brasch, M. A., Hartley, J. L., Vidal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orfeome+cloning+and+systems+biology%3A+Standardized+mass+production+of+the+parts+from+the+parts-list%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Orfeome cloning and systems biology: Standardized mass production of the parts from the parts-list.</a> Genome Res. 14 (10B), 2001-2009 (2004).</li>
<li>Zhu, B., Cai, G., Hall, E. O., Freeman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-fusion+assembly%3A+Seamless+engineering+of+multidomain+fusion+proteins%2C+modular+vectors%2C+and+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">In-fusion assembly: Seamless engineering of multidomain fusion proteins, modular vectors, and mutations.</a> Biotechniques. 43 (3), 354-359 (2007).</li>
<li>Liu, Q., Li, M. Z., Leibham, D., Cortez, D., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+univector+plasmid-fusion+system%2C+a+method+for+rapid+construction+of+recombinant+DNA+without+restriction+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">The univector plasmid-fusion system, a method for rapid construction of recombinant DNA without restriction enzymes.</a> Curr Biol. 8 (24), 1300-1309 (1998).</li>
<li>Marsischky, G., Labaer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Many+paths+to+many+clones%3A+A+comparative+look+at+high-throughput+cloning+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Many paths to many clones: A comparative look at high-throughput cloning methods.</a> Genome Res. 14 (10b), 2020-2028 (2004).</li>
<li>Wei, P., Xue, W., Zhao, Y., Ning, G., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-based+modular+assembly+of+a+UAS-cDNA%2FORF+plasmid+library+for+more+than+5500+Drosophila+genes+conserved+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">CRISPR-based modular assembly of a UAS-cDNA/ORF plasmid library for more than 5500 Drosophila genes conserved in humans.</a> Genome Res. 30 (1), 95-106 (2020).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-based+shuttle+cloning+of+1%2C397+human+genes+into+UAS+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biochim+Biophys+Sin+%28Shanghai%29%22%5BJournal%5D)">CRISPR-based shuttle cloning of 1,397 human genes into UAS vectors.</a> Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). , (2025).</li>
<li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+public+genome-scale+lentiviral+expression+library+of+human+ORFs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A public genome-scale lentiviral expression library of human ORFs.</a> Nat Methods. 8 (8), 659-661 (2011).</li>
<li>Wang, J. W., Beck, E. S., Mccabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modular+toolset+for+recombination+transgenesis+and+neurogenetic+analysis+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A modular toolset for recombination transgenesis and neurogenetic analysis of Drosophila.</a> PLoS One. 7 (7), e42102(2012).</li>
<li>Christie, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+DNA+cleavage+using+CRISPR-SpRYgests%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Precise DNA cleavage using CRISPR-SpRYgests.</a> Nat Biotechnol. 41 (3), 409-416 (2023).</li>
<li>Li, S. Y., Zhao, G. P., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-brick%3A+A+new+standard+for+assembly+of+biological+parts+using+Cpf1%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">C-brick: A new standard for assembly of biological parts using Cpf1.</a> ACS Synth Biol. 5 (12), 1383-1388 (2016).</li>
<li>Lei, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CCTL+%28Cpf1-assisted+cutting+and+taq+DNA+ligase-assisted+ligation%29+method+for+efficient+editing+of+large+DNA+constructs+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The CCTL (Cpf1-assisted cutting and taq DNA ligase-assisted ligation) method for efficient editing of large DNA constructs in vitro.</a> Nucleic Acids Res. 45 (9), e74(2017).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Polvere di agar</td><td>Base chimica</td><td>KBS-001H</td><td></td></tr><tr><td>Agarosio</td><td>Sangon</td><td>A600014-0100</td><td></td></tr><tr><td>Sistema automatizzato di analisi digitale delle immagini su gel</td><td>Tanon</td><td>Tanon-2500B</td><td></td></tr><tr><td>Cloramfenicolo</td><td>Sangon</td><td>A100230-0010</td><td></td></tr><tr><td>Kit di estrazione del gel E.Z.N.A.</td><td>Omega</td><td>D2500-02</td><td></td></tr><tr><td>Mini kit di DNA plasmidico E.Z.N.A. I</td><td>Omega</td><td>D6942-02</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI-HF</td><td>NEB</td><td>R3101S</td><td></td></tr><tr><td>Assemblaggio Gibson Master Mix</td><td>NEB</td><td>E2611S</td><td></td></tr><tr><td>Kit di sintesi rapida di RNA ad alto rendimento HiScribe T7</td><td>NEB</td><td>E2050</td><td></td></tr><tr><td>NEBuilder HiFi DNA Assemblaggio Master Mix</td><td>NEB</td><td>E2621X</td><td></td></tr><tr><td>Termociclatore PCR</td><td>Gene lungo</td><td>T20</td><td></td></tr><tr><td>Platino SuperFi II DNA polimerasi</td><td>Termo Scientifico</td><td>12361010</td><td></td></tr><tr><td>PvuII-HF</td><td>NEB</td><td>R3151L</td><td></td></tr><tr><td>Q5 Hot Start ad alta fedeltà 2x Master Mix</td><td>NEB</td><td>Codice: M0494</td><td></td></tr><tr><td>S. pyogenes Cas9</td><td>Script GenScript</td><td>Z03386</td><td></td></tr><tr><td>Incubatrice a scuotimento</td><td>Zhichu</td><td>ZQLY-180V</td><td></td></tr><tr><td>Spettrofotometro</td><td>Shimadzu</td><td>BioSpec-nano</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligasi</td><td>Promega</td><td>Motore M1801</td><td></td></tr><tr><td>Trans 10 Cellula Chimicamente Competente</td><td>TransGen</td><td>CD101-02</td><td></td></tr><tr><td>Triptone</td><td>Ossoide</td><td>LP0042</td><td></td></tr><tr><td>XbaI</td><td>NEB</td><td>R0145S</td><td></td></tr><tr><td>Estratto di lievito</td><td>Ossoide</td><td>LP0021</td><td></td></tr></tbody></table>

clonazione shuttle basata su crispr: un metodo di clonazione ad alto rendimento

CRISPR-based Shuttle Cloning: A High-throughput Cloning Method

Abbiamo utilizzato CRISPRshuttle per costruire una collezione di plasmidi UAS-cDNA/ORF che copre 1.397 geni umani conservati in Drosophila7. L'analisi delle restrizioni ha rivelato che CRISPRshuttle raggiunge un'efficienza del 94,5% per l'utilizzo di vettori di destinazione compatibili con CRISPRshuttle contenenti due sequenze ripetitive e del 96,1% per l'utilizzo di vettori di destinazione senza sequenze ripetitive7. I nostri dati hanno dimostrato che generalmente...

Clonazione shuttle basata su CRISPR: un metodo di clonazione ad alto rendimento

The development of genome-wide plasmid libraries using existing genomic repositories serves as a pivotal prerequisite for systematic functional ...

Descriviamo il nostro protocollo per un metodo di clonazione ad alto rendimento, CRISPRshuttle. Che comporta il trasferimento di frammenti di DNA bersaglio tra vettori senza la necessità di amplificazione PCR dei frammenti di DNA. Tecniche esistenti come l'infusione gateway e l'amplificazione PCR con clonaggio univettoriale. Questo approccio richiede procedure specifiche per i frammenti, tra cui la progettazione primaria e la convalida delle secrezioni. Questi tag sono laboriosi e richiedono molto tempo. La navetta CRISPR elimina la PCR durante il trasferimento di frammenti di DNA bersaglio tra vettori in reazioni sequenziali in provetta. Questo metodo supera la necessità di una manipolazione specifica del frammento e quindi accelera la costruzione del campione.[Narratore] Per iniziare, preparare una miscela master per un determinato numero di reazioni digestive combinando i reagenti mostrati sullo schermo. Disporre i tubi da 0,2 millilitri correttamente etichettati in un blocco di raffreddamento di alluminio su ghiaccio. Preparare la miscela master per il numero N di reazioni mescolando quantità appropriate di CAS9, sgRNA, 10, tampone CAS9 e acqua trattata con DEPC. Mescolare accuratamente il master mix e centrifugarlo. Aliquotare 3,75 microlitri della miscela master in ciascuna provetta di reazione. Aggiungere 0,75 microlitri di plasmide PLX 304 ORF 0,03 micromolare a ciascuna provetta miscelata accuratamente e incubare le provette a 37 gradi Celsius per un'ora. Preparare una master mix combinando 0,14 microlitri di pBIDC-UASC-pLXvect linearizzato da 3,36 micromolari e 1,8 microlitri di master mix di assemblaggio Gibson. Mescolare accuratamente il master mix e centrifugarlo. Ora aliquote 1,94 microlitri della miscela master in ogni tubo. Aggiungere 1,66 microlitri di plasmide scisso CAS9 in ciascuna provetta. Mescolare accuratamente e incubare a 50 gradi Celsius per un'ora. Scongelare le cellule batteriche competenti sul ghiaccio. Aliquotare 10 microlitri di cellule scongelate in ciascuna provetta pre-raffreddata da 1,5 millilitri. Mescolare delicatamente 10 microlitri di cellule competenti con un microlitro di prodotto di assemblaggio Gibson. Mettere i tubi sul ghiaccio per 30 minuti. Scaldare i tubi a 42 gradi Celsius per un minuto, quindi raffreddarli con ghiaccio per due minuti. Aggiungere 100 microlitri di SOC preriscaldato in ogni provetta e agitare a 250 giri/min per un'ora a 37 gradi Celsius. Infine, posizionare le cellule su piastre di agar LB contenenti 15 microgrammi per millilitro di cloramfenicolo e incubarle per una notte a 37 gradi Celsius. Questa figura mostra i risultati rappresentativi dell'analisi di restrizione dei plasmidi UAS-cDNA/ORF generati utilizzando il sistema CRISPRshuttle. In questa analisi, la digestione di restrizione di 15 costrutti UAS-cDNA/ORF con PVU2 ha rivelato che tutti i campioni mostravano i modelli di frammenti attesi a circa 1072 coppie di basi e 1.820 coppie di basi.

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Le metodologie di targeting genico possono essere utilizzate per generare topi transgenici con alleli knockout, knock-in e marcati.  Qui, descriviamo un metodo migliorato di ricombinazione in E. coli, che chiamiamo "subclonaggio più inserimento", che può essere utilizzato per generare rapidamente vettori di targeting genico personalizzati.

Subcloning più Insertion (SPI) - A Novel Metodo recombineering per la costruzione rapida di gene targeting Vettori

Utilizzando assemblaggio DNA, vettori multipli CRISPR possono essere costruiti in parallelo in una singola reazione clonazione, rendendo la costruzione di un gran numero di CRISPR vettori un compito semplice. Pomodoro radici pelose sono un sistema eccellente modello per convalidare vettori CRISPR e generare materiali mutanti.

High-throughput CRISPR vettore Costruzione e caratterizzazione di modifiche del DNA da Generazione di Roots pomodoro Peloso

La tecnica qui descritta genotipizzazione, che accoppia fluorescente reazione a catena della polimerasi (PCR) per elettroforesi su gel capillare, permette high-throughput genotipizzazione di cloni knockout nucleasi-mediata. Elude limitazioni incontrate da altre tecniche di genotipizzazione ed è più conveniente rispetto ai metodi di sequenziamento.

Usando una tecnica fluorescente PCR-capillare elettroforesi su gel al genotipo CRISPR / Cas9 mediata Knockout Mutants in un formato high-throughput

Questo protocollo descrive i passaggi per la clonazione di singoli RNA guidati singoli in un unico concetto di RNA concatenatore di guida, che è di particolare utilità nella creazione di knockouts multi-gene usando la tecnologia CRISPR / Cas9. La generazione di doppie bocce in organoidi intestinali viene mostrata come possibile applicazione di questo metodo.

Un protocollo per il knockout dei geni multipli nei piccoli organoidi intestinali del mouse usando un concatemer CRISPR

Qui, un semplice, efficiente e conveniente metodo di clonazione sgRNA è descritta.

CRISPR guida RNA clonazione per sistemi mammiferi

Questo manoscritto descrive un cluster regolarmente intervallate breve palindromo si ripete (CRISPR) CRISPR Cas9 metodo basato per indagine semplice e rapida del ruolo di geni candidati multipli nella proliferazione delle cellule di leucemia mieloide acuta (LMA) in parallelo. Questa tecnica è scalabile e può essere applicata in altre linee cellulari di cancro pure.

Indagine delle dipendenze genetiche utilizzando dosaggi di concorrenza basati su CRISPR-Cas9

Questo protocollo descrive la trasflessazione di plasmide ad alto rendimento delle cellule dei mammiferi in una piastra di 384 pozzetto che utilizza la tecnologia di espulsione acustica delle goccioline. L'erogazione e il multiplexing del DNA, che richiedono molto tempo e richiedono errori, ma anche il reagente di trasfezione, sono basati su software ed eseguiti da un dispositivo nanodispenser. Le cellule vengono poi semiate in questi pozzi precompilati.

Plasmid di DNA ad alto throughput e trasfezione utilizzando la tecnologia di nanoedispensing acustico

Questo protocollo fornisce un metodo per facilitare la generazione di cambiamenti di nucleotidi eterozio o omozigo utilizzando CRISPR-CAS9 nelle cellule staminali pluripotenti umane.

Generazione di modifiche genomiche definite utilizzando CRISPR-CAS9 nelle cellule staminali pluripotenti umane

I sistemi CRISPR-Cas e le proteine anti-CRISPR sono stati integrati nello schema delle porte booleane in Saccharomyces cerevisiae. I nuovi piccoli circuiti logici hanno mostrato buone prestazioni e approfondito la comprensione sia dei fattori di trascrizione basati su dCas9/dCas12a che delle proprietà delle proteine anti-CRISPR.

Circuiti digitali genici basati su sistemi CRISPR-Cas e proteine anti-CRISPR

Presentiamo un protocollo per l'assemblaggio modulare basato su CRISPR (CRISPRmass), un metodo per la costruzione ad alto rendimento di librerie plasmidiche UAS-cDNA/ORF in Drosophila utilizzando risorse cDNA/ORF disponibili pubblicamente. CRISPRmass può essere applicato alla modifica di varie librerie di plasmidi.

Assemblaggio modulare basato su CRISPR per la costruzione ad alto rendimento di una libreria di plasmidi UAS-cDNA/ORF

La linea cellulare THP-1 è ampiamente utilizzata come modello per studiare le funzioni dei monociti/macrofagi umani in varie aree di ricerca legate alla biologia. Questo articolo descrive un protocollo per l'ingegneria efficiente basata su CRISPR-Cas9 e l'isolamento di cloni di singole cellule, che consente la produzione di dati fenotipici robusti e riproducibili.

Knockout genico mediato da CRISPR-Cas9 basato sull'elettroporazione in cellule THP-1 e isolamento di cloni a singola cellula

Scopri la clonazione shuttle basata su CRISPR per l'ingegneria genetica. Questo metodo ad alto rendimento trasferisce frammenti di DNA tra vettori senza PCR, riducendo tempi e risorse nelle manipolazioni genetiche complesse.

Clonazione shuttle basata su CRISPR: un metodo di clonazione ad alto rendimento

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