Profilazione spaziale completa di trascrittomi indipendenti dalla specie tramite Stereo-seq

La nostra ricerca si concentra sulla caratterizzazione dettagliata del microambiente tumorale ovarico per identificare biomarcatori predittivi e terapeutici. Ad esempio, vorremmo trovare marcatori per prevedere la risposta e la resistenza alla chemioterapia o nuovi bersagli terapeutici per trattamenti di seconda linea. Le sfide sperimentali includono la gestione del campione, la valutazione della qualità del campione e la durata del tempo necessario per la lavorazione del campione.

Mentre per l'analisi dei dati, le sfide includono aspetti come la scarsità dei dati, simile ad altri processi a singola cella, e anche la mappatura delle aree, in particolare delle regioni ripetitive. Dopo aver rimosso il N-Chip stereo-sequenziante dalla confezione, registra il numero di identificazione del chip. Senza toccare la superficie N-Chip, pulisci il vetrino del vetro con etanolo al 100%.

Utilizzando una micropipetta, applica con cura 10 microlitri di resina ceramica polimerizzabile ai raggi ultravioletti attorno al bordo del N-Chip stereo-sequenziante. Usa un tampone di schiuma sigillato per rimuovere l'eccesso di resina, lasciando solo una linea sottile intorno al bordo della scheggia. Inserisci il carrello nel dispositivo di polimerizzazione ultravioletta, assicurandoti che la superficie del chip non venga toccata.

Ora posiziona il chip applicato con resina sopra una maschera opaca sulla sorgente di luce ultravioletta da 405 nanometri per illuminare il retro del vetrino, e indurisci per cinque minuti. Dopo l'indurircimento, si utilizzano tamponi di schiuma sigillati imbevuti in etanolo di grado 100% molecolare, poi al 70% etanolo e infine acqua senza nucleasi per pulire il bordo applicato con resina. Immergi il chip tre volte in acqua fresca priva di nucleasi utilizzando un tubo conico da 50 millilitri.

Utilizzando aria compressa, asciugare il truciolo con tutta la forza dell'aria con un angolo di circa 60-80 gradi, muovendosi diagonalmente sulla superficie da circa cinque centimetri di distanza. Successivamente, applica 150 microlitri di soluzione di poli-L-lisina in modo uniforme su tutta la superficie del chip e incuba il chip per 10 minuti a temperatura ambiente. Poi rimuovi la soluzione di poli-L-lisina dal chip.

Dopo il secondo lavaggio, asciuga con cura i bordi del carrello senza toccare la superficie della scheggiatura. Asciuga saldamente il truciolo usando aria compressa come dimostrato prima. Durante la sezionazione del tessuto FFPE, non toccare direttamente il chip e copri solo l'80% del chip con un fazzolino.

Per preparare due microlitri di soluzione di colorazione del DNA a singolo filamento in un buffer SSC, diluire il reagente di DNA singolo filamento Qubit con un buffer SSC 5X. Creare una miscela master di soluzione di colorazione utilizzando una diluizione da uno a 20 di inibitore della ribonucleasi, una diluizione da uno a 200 della soluzione di DNA monofilamento e il volume rimanente con un buffer SSC 5X. Aggiungi 150 microlitri di soluzione di colorazione a ogni scheggiatura e incuba al buio a temperatura ambiente per cinque minuti.

Poi rimuovi delicatamente la soluzione macchiante dall'angolo di ogni scheggiatura usando una pipetta. Dopo aver lavato il truciolo due volte con 0,1X SSC buffer per 10-15 secondi, asciuga con cura i bordi della slitta. Aggiungi circa tre o cinque microlitri di glicerolo sul vetrino per montarlo.

Fai cadere un copricapo da circa un centimetro sopra il carrello, mantenendolo in linea e assicurandoti che non tocchi la superficie del chip. Cattura immagini fluorescenti di tessuto a singolo filamento colorato con DNA utilizzando un microscopio a campo ampio, garantendo una sovrapposizione del 10% tra le piastrelle dell'immagine. Unire le immagini acquisite in software di elaborazione immagini come ImageJ utilizzando prima la sovrapposizione teorica per generare posizioni approssimative delle tile, poi applicando la sovrapposizione computazionale di matching dei pixel per affinare la tiling.

Elabora le immagini cucite nel software StereoMap e verifica che il controllo qualità dell'immagine sia passato prima di continuare. Immergi il carrello di sequenziamento stereo in 30 millilitri di buffer SSC 0,1X finché il coperchissone non si stacca. Assicurati che il reagente di decrosslinking in FFPE sia a temperatura ambiente e ispezionalo per eventuali particelle.

Accendi il termociclatore e impostalo a 30 gradi Celsius per l'equilibrio, 95 gradi Celsius per un'incubazione di 30 minuti e mantieni infinito a quattro gradi Celsius. Assemblare la guarnizione della cassetta e inserire il chip di sequenziamento stereo nella cassetta. Poi aggiungi il reagente FFPE per la decrosslinking nel pozzo della cassetta slide stereo-sequencing, applica il nastro sigillante sulla cassetta e confermi che sia ben sigillata.

Inizia l'incubazione di 30 minuti a 95 gradi Celsius. Dopo 10 minuti, metti 25 millilitri di metanolo in un contenitore da 50 millilitri in un congelatore a 20 gradi Celsius, preparando circa un millilitro per vetrino per un uso successivo. Dopo aver rimosso il chip dal termociclatore, trasferisci la cassetta a slitta sul banco e stacca il nastro sigillante.

Utilizzando una pipetta, rimuovere e scartare il reagente FFPE per decrosslinking dalla cassetta. Una volta che il reagente è stato completamente rimosso, stacca la cassetta e la guarnizione e gettali via. Sotto una cappa esterile, asciuga il bordo della culina e applica una nuova camera in silicone se necessario.

Aggiungi 500 microlitri di metanolo raffreddato dal congelatore a 20 gradi Celsius, assicurandoti che l'intera sezione sia sommersa. Preriscaldare la soluzione PR su un blocco secco a 37 gradi Celsius per 10 minuti prima dell'uso. Dopo la fissazione, in una cappa fumante, rimuovere qualsiasi eccesso di metanolo dal vetrino e aspettare che il metanolo rimanente sul chip evapori.

Assemblare una nuova guarnizione terminale per cassetta. Una volta completata l'evaporazione, inserire il chip slide stereo-sequenziante nella cassetta. Aggiungi 200 microlitri di reagente di permeablizzazione preriscaldato al chip.

Applica il nastro sigillante sulla cassetta slide stereo-sequencing e assicurati che sia ben sigillata. Esegui la trascrizione inversa e poi il rilascio e purificazione del CDNA seguendo i passaggi mostrati qui. Preriscalda l'acqua priva di nucleasi a 37 gradi Celsius.

Rimuovi il sigillo dal chip. Pipetta vigorosamente in ogni angolo e al centro della scheggiatura sopra il fazzoletto senza raschiarlo o toccarlo. Raccogli tutto il mix gratuito di rilascio di DNA dal chip e trasferiscilo in un tubo centrifuga da 1,5 o 2,0 millilitri.

Aggiungi 350 microlitri di acqua preriscaldata senza nucleasi direttamente sulla superficie del chip. Pipetta vigorosamente con una pipetta più piccola, inclinando la punta per applicare la cicatranza senza toccare il tessuto o raschiare la scheggiatura. Combina il lavaggio con i 400 microlitri di miscela di rilascio di DNA complementare raccolti in precedenza, assicurandoti che venga unito solo il materiale di un singolo chip.

Posiziona 100 microlitri di acqua senza nucleasi sul chip. Sigilla il vetrino di sequenziamento stereo e conservalo in frigorifero fino alla fine del protocollo. La segmentazione a singola cellula utilizzando la pipeline SAW è stata ottenuta su sezioni FFPE, permettendo la mappatura su RNA non poliadenilati come tRNA, TRDMT1.

La visualizzazione spaziale interattiva ha mostrato tipi cellulari presunti utilizzando il software proprietario StereoMap, con cluster visualizzati in vari colori su una regione del tessuto ingrandita. L'espressione del tessuto intero dell'RNA non poliadenilato TRDMT1 è stata visualizzata utilizzando StereoPi. Gli adattamenti del protocollo affrontano problemi riscontrati nella profilazione spaziale della trascrivomica completa dei tessuti adiposi e fragili, migliorando l'adesione tissutale, l'accessibilità dell'RNA e la gestione delle stereo-seq su questi difficili tipi di tessuto.

Attualmente lo stereo-seq offre una risoluzione superiore rispetto ad altri metodi trascritomici spaziali, con una risoluzione di 500 nanometri rispetto a due micron. Fornisce inoltre una cattura imparziale necessaria per lo studio del microbioma, dei trascrizioni virali e non poliadenilate.