Microscopia multiarmonica simultanea ad autofluorescenza senza marcatura

Questo protocollo presenta una guida passo passo per la tecnica microscopica SLAM (Simultaneous Label-free Autofluorescence Multi-harmonic), inclusi dettagli su come generare la sorgente di luce laser, preparare un campione di tessuto, condurre l'imaging e analizzare i dati. SLAM fa progredire la microscopia non lineare misurando quattro contrasti complementari privi di marcatura per studiare il microambiente tissutale.

La microscopia multiarmonica ad autofluorescenza simultanea senza marcatura, o microscopia SLAM, acquisisce informazioni uniche nei campioni biologici misurando le interazioni non lineari con la luce. Nel nostro laboratorio, utilizziamo questa tecnica per studiare la vita e la malattia su scala microscopica. Osserviamo uno spostamento verso l'imaging multimodale label-free, che offre informazioni più ricche sulle strutture e le dinamiche cellulari e tissutali, evitando al contempo la tossicità e consentendo contrasti e correlazioni complementari tra le modalità.

I microscopi non lineari all'avanguardia label-free acquisiscono un segnale alla volta, rischiando disallineamenti, danni fotografici e molti processi simultanei. Lo SLAM supera questi problemi consentendo un contrasto multimodale rigorosamente coregistrato, garantendo dati spaziali e temporali affidabili. Questa tecnica consente l'eccitazione e il rilevamento simultanei di quattro canali in un microscopio multifotone.

Utilizzo della fibra di cristallo fotonico per ampliare gli impulsi per SHG, THG e fluorescenza a due e tre fotoni. SLAM acquisisce informazioni multiplex metaboliche, strutturali e di segnalazione cellulare dinamica senza artefatti di allineamento o etichette esogene, consentendo un'analisi quantitativa standardizzata dei tessuti. Le sue applicazioni spaziano dalla biologia fondamentale, alla ricerca traslazionale e alla scoperta di biomarcatori in oncologia, neurodegenerazione e rigenerazione tissutale.

Per iniziare, utilizzare uno spettrometro o un analizzatore di spettro ottico per misurare il laser dopo lo specchio parabolico e verificare la generazione di supercontinuum della fibra di cristallo fotonico. Ruotare la piastra intermedia dopo il divisore di fascio polarizzatore per ottimizzare la larghezza del supercontinuum. Accendere l'autocorrelatore al microscopio.

Nel software, impostare il rivelatore sul rivelatore interno e regolare l'intervallo di scansione su 5 picosecondi per acquisire l'intera larghezza dell'autocorrelazione dell'impulso. Sbloccare il laser e allineare l'autocorrelatore al raggio in uscita dal pulsatore fino a quando non viene visualizzato un segnale. Assicurarsi che l'otturatore 2 sia chiuso.

Quindi applicare il mezzo di immersione appropriato, come acqua o olio, sulla lente dell'obiettivo. Posizionare il rivelatore esterno dell'autocorrelatore sul tavolino del microscopio e posizionarlo direttamente sopra l'obiettivo. Ora accendi gli specchi del galvanometro a scansione per impostare la loro tensione a 0.

Aprire l'otturatore e utilizzare un bersaglio fluorescente per confermare che il raggio raggiunga il rilevatore esterno. Impostare il rilevatore di autocorrelatore in modo che sia il rilevatore esterno. Quindi regolare la posizione del palco fino a quando non appare il segnale.

Regolare i coefficienti polinomiali dello shaper di impulsi per ridurre al minimo in modo iterativo l'ampiezza dell'impulso misurata dall'autocorrelatore. Man mano che l'ampiezza dell'impulso diminuisce, ridurre di conseguenza l'intervallo di scansione per migliorare l'accuratezza e la visualizzazione della funzione di autocorrelazione. Assicurarsi che l'ingresso del laser alla fibra di cristallo fotonico sia bloccato e accendere il laser.

Lasciare riscaldare il laser per 30 minuti. Verificare che il percorso del raggio sia libero da ostruzioni, quindi posizionare un misuratore di potenza ottica nel percorso del raggio appena prima della fibra di cristallo fotonico. Premere il pulsante di controllo per aprire l'otturatore 1 e misurare la potenza in ingresso.

Richiudere l'otturatore 1. Spostare il misuratore di potenza all'uscita della fibra di cristallo fotonico dopo lo specchio parabolico. Aprire l'otturatore 1 e utilizzare lo stadio a tre assi in ingresso per massimizzare la potenza di uscita.

Lascia che la fibra di cristallo fotonico si riscaldi per 10 minuti, quindi massimizza nuovamente la potenza di uscita utilizzando lo stadio a tre assi e registra la trasmissione del PCF. Spostare il misuratore di potenza dopo il filtro a densità neutra e ruotare il filtro per regolare la potenza del laser che raggiunge il campione. Moltiplicare la potenza misurata per la trasmittanza dell'ottica rimanente per determinare la potenza del campione.

Ora, accendi i galvanometri e il palco. Avviare il software di acquisizione e inserire i parametri di imaging desiderati. Posizionare il campione sul tavolino utilizzando lo stesso mezzo di immersione applicato in precedenza alla lente dell'obiettivo.

Quindi spegni le luci della stanza e chiudi le tende per evitare che la luce ambientale entri. Quindi, accendere gli alimentatori del rivelatore e gli amplificatori. Chiudere la scatola luminosa che circonda il tavolino del microscopio.

Utilizzare gli interruttori di controllo elettronici per aprire manualmente le tapparelle del rilevatore 3-6. Nel software di acquisizione, premere l'opzione Fare clic per avviare l'acquisizione per avviare l'imaging SLAM. Regolare la messa a fuoco del microscopio utilizzando la manopola del controller del tavolino fino a quando il campione non è chiaramente visibile.

Utilizzare il joystick sul controller del tavolino del microscopio per trovare il campo visivo desiderato. Una volta posizionato, fare clic su Interrompi e ripristina. Nella scheda Salvataggio, imposta Salva dati su Sì.

Quindi premere sull'opzione Fare clic per avviare l'acquisizione e attendere il completamento dell'imaging. Per manipolare il campione durante l'imaging, chiudere gli otturatori del rivelatore e utilizzare una torcia o una lampada frontale per l'illuminazione. Dopo le regolazioni, tornare alla configurazione di imaging.

Per terminare l'acquisizione dell'immagine, chiudere le tapparelle del rilevatore, spegnere i rilevatori e solo successivamente accendere le luci della stanza. Bloccare il laser utilizzando l'otturatore 1, quindi spegnere il laser. Spegnere i galvanometri e il tavolino e chiudere il software di acquisizione.

Smaltire il campione di tessuto in modo appropriato e pulire la postazione di lavoro. Una fibra di cristallo fotonico correttamente tagliata mostrava una faccia terminale piatta perpendicolare al suo asse e una faccia pulita. Le fibre di cristallo fotonico scarsamente tagliate mostravano tagli angolati, facce scheggiate e graffi o detriti pronunciati sulla superficie.

Una manipolazione impropria o una contaminazione provocava l'accumulo visibile di sporco e particolato attorno alla superficie della fibra che oscurava il modello del foro dell'aria. Un nucleo bruciato con regioni scure indicava una fibra di cristallo fotonico danneggiata alla fine della sua vita. Lo spettro del supercontinuum si estendeva a circa 975-1, 175 nanometri con una sommità piatta e modulazioni spettrali distinte.

L'autocorrelazione dell'impulso dopo la compressione ha mostrato un profilo simmetrico con un semimassimo stretto a tutta larghezza, indicando una buona forma dell'impulso. Le sorgenti di supercontinuum correttamente funzionanti hanno prodotto forti segnali di seconda e terza armonica. Un supercontinuum ristretto ha comportato la perdita dell'intensità del segnale della terza armonica pur mantenendo il segnale della seconda armonica.

L'assenza di forma dell'impulso ha ridotto drasticamente tutti i segnali non lineari, producendo un'immagine debole e a basso contrasto. Il successo dell'imaging SLAM del tessuto renale ex vivo ha mostrato strutture nefroniche distinte con molteplici segnali ottici forti, tra cui la generazione di terza armonica e la fluorescenza NADPH. Le fibre di collagene interstiziale renale erano identificabili tramite forti segnali di generazione di seconda armonica.

L'immagine del rapporto redox indicava un elevato metabolismo mitocondriale aerobico nei tubuli prossimali della corteccia renale rispetto al midollo. Una seconda mappa del rapporto redox ha confermato la variazione spaziale del metabolismo ossidativo e glicolitico, rafforzando l'utilizzo differenziale di energia all'interno del tessuto.