Name: Microscopia multiarmonica simultanea ad autofluorescenza senza marcatura (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-29T13:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: Scopri la microscopia SLAM per l'imaging multimodale senza marcatori in campioni biologici. Questa tecnica avanzata cattura quattro contrasti complementari simultanei per studiare il microambiente tessutale con precisione spaziale e temporale.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

La microscopia ottica non lineare sfrutta la risposta di un campione a un'intensa radiazione ottica (luce con campi elettrici superiori a 3 × 103 V/cm) per derivare il contrasto dell'immagine, dove la polarizzazione indotta (e quindi il segnale generato) dipende in modo non lineare dall'intensità incidente 1,2,3. Poiché questi contrasti multipli sono mediati da diverse interazioni luce-materia, la microscopia non lineare fornisce l'accesso simultaneo a informazioni uniche riguardanti sia la morfologia che il paesaggio chimico di un campione 1,2,3. Mentre le tecniche di microscopia tradizionali che prevedono un'interazione lineare con la luce di illuminazione consentono anche l'imaging quantitativo, la microscopia non lineare consente un approccio più multimodale, spesso con una migliore profondità di imaging e sezionamento ottico, causando anche meno fotodanni al campione4. Nel contesto delle applicazioni biomediche, come la valutazione intraoperatoria di tipo istologia del tessuto 5,6, questa tecnica consente il sondaggio diretto di biomolecole native, facilitando indagini senza soluzione di continuità di cellule viventi senza la necessità di marcatori esterni o modifiche. Questo approccio evita l'uso di tag, etichette7, molecole esogene, proteine fluorescenti geneticamente espresse o nanoparticelle, che non solo richiedono un lavoro esteso, ma hanno anche il potenziale di interrompere la biochimica nativa del campione e avere un impatto negativo sulle cellule o sui tessuti bersaglio 8,9,10. Pertanto, il microscopio non lineare funge da strumento analitico potente e genuino che fornisce immagini continue di strutture microscopiche senza alterare l'integrità chimica e strutturale del campione. Questa capacità apre un'ampia gamma di applicazioni, che vanno dalla diagnosi e dalla scoperta di farmaci alla segnalazione cellulare e alla biologia dei sistemi.
I contrasti multifotone come l'autofluorescenza a due fotoni (2PAF), l'autofluorescenza a tre fotoni (3PAF), la generazione di seconda armonica (SHG) e la generazione di terza armonica (THG) conferiscono vantaggi analitici nella caratterizzazione dei campioni. Il 2PAF è generato da flavine endogene, con la flavina adenosina dinucleotide (FAD) che è la più abbondante nei sistemi biologici11. Il 3PAF sfrutta l'eccitazione nel vicino infrarosso per visualizzare cromofori intrinseci come il NAD(P)H e consente l'imaging metabolico eludendo i problemi di fototossicità e attenuazione legati ai raggi UV12. L'SHG rivela specificamente strutture molecolari non centrosimmetriche come il collagene fibrillare (tipi I, II e III) e gli array proteici 13,14,15,16,17, fornendo informazioni strutturali 1. Infine, THG, sensibile alle interfacce e alle piccole caratteristiche strutturali, eccelle nell'imaging delle distribuzioni lipidiche e delle vescicole extracellulari 18,19,20,21,22.
Ciascuno di questi segnali di contrasto è stato esplorato in modo indipendente da gruppi di ricerca, stabilendo la nicchia per la microscopia non lineare multifotone come strumento affidabile e versatile per applicazioni biologiche 23,24,25,26. Questi sforzi sono stati guidati dagli inventori del microscopio 2PAF, che hanno sfruttato la loro tecnologia innovativa per ottenere nuove intuizioni sulla morfologia dei tessuti, sul metabolismo cellulare e persino sulle caratteristiche morfofunzionali di patologie come il morbo di Alzheimer e il cancro23. Il loro lavoro ha infine portato ad applicazioni rivoluzionarie nelle neuroscienze27,28. Negli anni successivi, diversi ricercatori hanno evidenziato la sensibilità dell'SHG ai cambiamenti nella matrice extracellulare, l'impalcatura che fornisce supporto strutturale alle cellule e che subisce sostanziali alterazioni durante la patogenesi del cancro29. In particolare, Campagnola et al.14,24,30,31 hanno dimostrato che la microscopia SHG consente la visualizzazione di assemblaggi macromolecolari e supramolecolari, rivelando dettagli come la disposizione, la concentrazione e il tipo di collagene che non sono rilevabili con le tecniche convenzionali basate sulla fluorescenza. Questi risultati hanno sottolineato il potenziale della microscopia SHG come strumento diagnostico praticabile in ambito clinico. Infine, la microscopia THG è stata applicata con successo per visualizzare gli strati retinici nei roditori alla risoluzione subcellulare25, mappare le strutture cerebrali32 e catturare la topografia multi-interfacciale dell'invasione delle cellule di melanoma33.
Queste implementazioni storiche della microscopia non lineare generalmente coinvolgevano un laser a femtosecondi (fs) accoppiato a un obiettivo ad alta apertura numerica (NA) per generare e raccogliere i segnali non lineari, che venivano poi diretti con uno specchio dicroico a un filtro passa-banda e raccolti con un tubo fotomoltiplicatore (PMT)34. Nonostante implementazioni simili, la maggior parte delle applicazioni si è concentrata sull'acquisizione di uno o al massimo due contrasti, trascurando gli altri. Per realizzare appieno il potenziale del microscopio multifotone, Boppart et al. hanno prima implementato l'acquisizione sequenziale di contrasti multipli non lineari 21,35,36,37, seguita dalla loro rilevazione simultanea 4,22,38,39,40,41. La tecnica risultante, nota come microscopia SLAM (Simultaneous Label-free Autofluorescence Multi-harmonic), co-registra spazialmente e temporalmente i segnali non lineari 2PAF, 3PAF, SHG e THG attraverso l'eccitazione single-shot e il rilevamento multiplex, ottenendo così una potenza analitica superiore. La co-localizzazione spazio-temporale di questi quattro canali fornisce dati altamente classificati e ricchi di funzionalità42, offrendo vantaggi rispetto ai dati acquisiti in sequenza, eliminando gli artefatti di movimento e garantendo una migliore registrazione delle immagini. Di conseguenza, la SLAM consente la generazione di caratteristiche composite, come i rapporti ottici di riduzione-ossidazione, che caratterizzano efficacemente le proprietà metaboliche 43,44,45. Inoltre, l'analisi combinata dei segnali tra le modalità facilita l'ingegnerizzazione di funzionalità aggiuntive basate sulla correlazione e la colocalizzazione dei canali. Ad esempio, Shi et al. hanno dimostrato l'importanza delle caratteristiche di colocalizzazione della microscopia SLAM nella classificazione accurata delle cellule ovariche di criceto cinese (CHO) utilizzate nella produzione farmaceutica42. In questo modo, SLAM getta le basi per quello che oggi è considerato lo stato dell'arte della microscopia multifotone, aprendo la strada a futuri progressi nel campo46.
In questo protocollo, descriviamo i componenti chiave di un microscopio SLAM (Figura 1) e descriviamo una metodologia passo dopo passo per la sua implementazione. Ciò include la generazione e la modellazione degli impulsi di eccitazione, la preparazione del campione di tessuto rappresentativo, le procedure di imaging e l'elaborazione, nonché la visualizzazione dei dati risultanti. Utilizzando la tecnologia standard e le tecniche consolidate, questo protocollo è universale, trasferibile e può essere facilmente riprodotto utilizzando sistemi ottici simili in diversi laboratori.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68637/68637fig1v2.jpg"> 
Figura 1: Il design ottico di un microscopio multiarmonico ad autofluorescenza senza marcatura (SLAM) simultaneo. Il laser a femtosecondi emette luce a 1040 nm in impulsi di 370 fs a una frequenza di ripetizione di 10 MHz. L'intensità e la polarizzazione del laser vengono attentamente controllate prima di pompare un cristallo fotonico per generare un supercontinuum. Gli impulsi vengono quindi compressi da un modellatore di impulsi e diretti in un microscopio a scansione laser personalizzato (dashed box). Gli specchi dicroici e i filtri passa-banda isolano i segnali non lineari generati dal campione prima che vengano rilevati da rivelatori di fotoni ad alta sensibilità come i tubi fotomoltiplicatori (PMT) o i fotorivelatori ibridi (HPD). Il design ottico si basa su un sistema41 precedentemente descritto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68637/68637fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Tavolino a 3 assi</td><td>ThorLabs</td><td>MAX316</td><td>Interrotto.</td></tr><tr><td>Piatto di imaging con fondo in vetro da 35 mm</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-14-C</td><td>Vetro di copertura #0 non rivestito.</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>21063029</td><td>Glucosio alto, HEPES, senza rosso fenolo.</td></tr><tr><td>Integratori di terreno di crescita delle cellule endoteliali</td><td>PromoCell</td><td>C-39210</td><td>Omettere il siero fetale di vitello.</td></tr><tr><td>Laser a femtosecondi FemtoTrain</td><td>Spettri-Fisica</td><td>1040-5</td><td>Potenza media: >5,0 W, Energia dell'impulso: >500 nJ, Lunghezza d'onda: 1040 nm &plusmn; 8 nm, frequenza di ripetizione: 10 MHz, larghezza dell'impulso (FWHM): < 220 ss.</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Citiva</td><td>SH30071.03</td><td>HyClone caratterizzato.</td></tr><tr><td>Stripper per fibre</td><td>ThorLabs</td><td>T10S13</td><td></td></tr><tr><td>Flavina adenina dinucleotide sale disodico idrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6625</td><td></td></tr><tr><td>Specchi galvanometrici</td><td>Tecnologia Cambridge</td><td>6215H</td><td>Interrotto.</td></tr><tr><td>Postazione di lavoro per la lavorazione del vetro</td><td>Vytran</td><td>GPX3800</td><td></td></tr><tr><td>ImmagineJ</td><td>Laboratorio Eliceiri presso l'Università del Wisconsin Madison</td><td>Versione 2.16.0</td><td>Distribuzione FIJI.</td></tr><tr><td>Carta velina Kimwipe</td><td>Kimberly-Clark Professionista</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutammina</td><td>Citiva</td><td>SH30034.01</td><td></td></tr><tr><td>Tavolino per microscopio</td><td>Strumentazione Scientifica Applicata</td><td>FTP-2050</td><td></td></tr><tr><td>Controllore di tavolino per microscopio</td><td>Strumentazione Scientifica Applicata</td><td>MS-2000-500-UDSW</td><td></td></tr><tr><td>Autocorrelatore per microscopia</td><td>Angewandte Physik und Elektronik GmbH</td><td>Carpe</td><td></td></tr><tr><td>Obiettivo</td><td>Olimpo</td><td>XLPLN25XWMP2</td><td>Immersione in acqua, ingrandimento 25X, 1,05 NA.</td></tr><tr><td>Misuratore di potenza ottica</td><td>Newport</td><td>919P-003-10</td><td>600 - 1700 nm.</td></tr><tr><td>Analizzatore di spettro ottico</td><td>ThorLabs</td><td>OSA202C</td><td></td></tr><tr><td>Fibra di cristallo fotonico</td><td>Fotonica NKT</td><td>LMA-PM-15 NKT</td><td>Ampia area modale, mantenimento della polarizzazione. Diametro del nucleo: 15 &micro;m.</td></tr><tr><td>Mannaia di precisione per fibre ottiche</td><td>Fujikura</td><td>CT-101</td><td></td></tr><tr><td>Modellatore di impulsi</td><td>Soluzioni Biofotoniche Inc.</td><td>FemtoJock-D</td><td>Interrotto.</td></tr><tr><td>&beta;-nicotinamide adenina dinucleotide, sale disodico ridotto idrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10128023001</td><td></td></tr></tbody></table>

microscopia multiarmonica simultanea ad autofluorescenza senza marcatura

Simultaneous Label-Free Autofluorescence Multi-Harmonic Microscopy

Il complesso approccio multicanale e multimodale del microscopio SLAM (Figura 1) può rendere difficile per i nuovi utenti risolvere i problemi e comprendere i risultati. Innanzitutto, un PCF ben tagliato presenta una faccia pulita (Figura 2C) con una superficie piana perpendicolare alla lunghezza del PCF (Figura 2A). Una faccia di fendente angolata e scheggiata (Figura 2B) e la presenza di graffi (<stro...

Microscopia multiarmonica simultanea ad autofluorescenza senza marcatura

Nonlinear optical microscopy images biological samples by detecting signals from the nonlinear interaction of ultrashort laser pulses with endogenous ...

simultaneous-label-free-autofluorescence-multi-harmonic-microscopy

Research

Ricerca

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingegneria

Dimostriamo l'uso della microscopia di localizzazione per fotoattivazione a fluorescenza (FPALM) per visualizzare simultaneamente più tipi di molecole marcate in fluorescenza all'interno delle cellule. Le tecniche descritte producono la localizzazione di migliaia o centinaia di migliaia di singole proteine marcate con fluorescenza, con una precisione di decine di nanometri all'interno di singole cellule.

Imaging multicolore simultaneo di strutture biologiche con microscopia di localizzazione con fotoattivazione a fluorescenza

Vi presentiamo un alto contenuto strumento open source di analisi (HCA) che utilizza l'imaging di fluorescenza vita automatizzato (FLIM) per saggiare le interazioni delle proteine ​​che utilizzano Förster trasferimento di energia di risonanza (FRET) letture basate. L'acquisizione dei dati per questo strumento openFLIM-HCA è controllato da un software scritto in μManager e l'analisi dei dati viene effettuata in FLIMfit.

Open Source alto contenuto di analisi Utilizzando Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Qui, presentiamo un protocollo per la localizzazione di multi-colore delle proteine di membrana singola in organelli delle cellule vive. Per allegare fluorofori, proteine self-etichettatura sono usate. Proteine, trova in scomparti di diverse membrane dell'organello stesso, possono essere localizzati con una precisione di ~ 18 nm.

Microscopia di multi-colore localizzazione delle proteine di membrana singola in organelli delle cellule di mammiferi dal vivo

Qui vi presentiamo una guida pratica di costruzione di un sistema di microscopia integrato, che si fonde imaging epi-fluorescente convenzionale, singola molecola basata sul rilevamento di Super-risoluzione imaging e rilevamento di singola molecola multi-colore, tra cui trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza di singola molecola di imaging, in un set-up in modo efficiente.

Lo svolgimento di diverse modalità di Imaging con un microscopio a fluorescenza

Bassa intensità ha pulsato ultrasuono stimolazione (LIPUS) è una modalità per stimolazione meccanica non invasiva delle cellule endogene o ingegnerizzate con elevata risoluzione spaziale e temporale. Questo articolo viene descritto come implementare LIPUS ad un microscopio a epifluorescenza e come ridurre al minimo disadattamento di impedenza acustica lungo il percorso di ultrasuono per evitare indesiderati artefatti meccanici.

Multiplexing focalizzato ad ultrasuoni stimolazione con microscopia di fluorescenza

L'imaging spettrale è diventata una soluzione affidabile per l'identificazione e la separazione di più segnali di fluorescenza in un singolo campione e può facilmente distinguere i segnali di interesse dallo sfondo o dall'autofluorescenza. L'imaging iperspettrale a scansione dell'eccitazione migliora questa tecnica diminuendo il tempo necessario di acquisizione dell'immagine aumentando contemporaneamente il rapporto segnale-rumore.

Microscopia di imaging iperspettrale di eccitazione-scanning per discriminare in modo efficiente i segnali di fluorescenza

Questo protocollo descrive l'imaging a fluorescenza e l'analisi dei coenzimi metabolici endogeni, della nicotinamide adenina ridotta (fosfato), del dinucleotide (NAD(P)H) e dell'adenina dinucleotide della flavina ossidata (FAD). L'imaging a autofluorescenza di NAD(P)H e FAD fornisce un metodo non distruttivo privo di etichette per valutare il metabolismo cellulare.

Imaging ad autofluorescenza per valutare il metabolismo cellulare

Qui, descriviamo diversi metodi di formazione di sferoidi multicellulari per eseguire la microscopia multiparametrica su cellule vive di follow-up. Utilizzando la microscopia a fluorescenza (FLIM), l'autofluorescenza cellulare, i coloranti di colorazione e le nanoparticelle, viene dimostrato l'approccio per l'analisi del metabolismo cellulare, dell'ipossia e della morte cellulare nel cancro tridimensionale (3D) vivo e negli sferoidi derivati da cellule staminali.

Produzione e microscopia multiparametrica per imaging a fluorescenza su cellule vive (FLIM) di sferoidi multicellulari

Spettroscopia Raman è una tecnica adatta per il non-contatto, label-free analisi di cellule viventi, dell'ingegneria tissutale costrutti e tessuti nativi. Fonte specifici per le impronte digitali spettrali possono essere generati ed analizzati utilizzando l'analisi multivariata.

Senza contatto, Label-free monitoraggio delle cellule e matrice extracellulare mediante Spettroscopia Raman

Tecniche biosensore ottico in grado di rilevare variazioni nella massa in prossimità della membrana plasmatica in cellule viventi e consentono di seguire le risposte cellulari in entrambe singole cellule e popolazioni di cellule. Questo protocollo descrive rilevamento della modulazione dei canali del potassio da G recettori accoppiati alle proteine ​​in cellule intatte utilizzando questo approccio.

L&#39;uso di biosensori ottici privi di etichetta per rilevare modulazione dei canali del potassio da G-recettori accoppiati a proteine

Scopri la microscopia SLAM per l'imaging multimodale senza marcatori in campioni biologici. Questa tecnica avanzata cattura quattro contrasti complementari simultanei per studiare il microambiente tessutale con precisione spaziale e temporale.

Microscopia multiarmonica simultanea ad autofluorescenza senza marcatura

Esplora altri video