Induzione di una lieve ipertermia mirata in modelli di tumore murino attraverso la conversione fototermica della luce nel vicino infrarosso mediante nanobarre d'oro intratumorali

La terapia ipertermica mirata è una modalità emergente nel trattamento del cancro progettata per aumentare selettivamente le temperature tumorali riducendo al minimo i danni ai tessuti sani circostanti. Questo metodo descrive un modo altamente efficiente, a bassa intensità di risorse e riproducibile per indurre l'ipertermia mediata da nanobarre d'oro nei tumori solidi. L'impiego dell'iniezione intratumorale diretta di nanobarre d'oro seguita dall'esposizione alla luce del vicino infrarosso consente un riscaldamento preciso, controllato e altamente localizzato dei tumori.

Il successo di questo protocollo dipende dall'efficiente attivazione dei tessuti profondi delle nanobarre d'oro utilizzando la lunghezza d'onda appropriata della luce nel vicino infrarosso, nonché dall'accurato monitoraggio in tempo reale della temperatura interna del tumore durante tutta la procedura. Inizia le misurazioni quotidiane del tumore a partire dal settimo giorno, dopo l'iniezione di cellule tumorali o ogni volta che i tumori diventano palpabili. Prima di iniziare la procedura, misurare la larghezza, la lunghezza e l'altezza del tumore per calcolare il volume totale del tumore.

Cercare di eseguire la procedura una volta che i tumori hanno raggiunto un volume approssimativo di 50 millimetri cubi. Per il nostro modello, questo volume tumorale è stato raggiunto tra il giorno 10 e il giorno 12 dopo l'iniezione di cellule tumorali. In una cappa di sicurezza biologica sterile, utilizzare una siringa da un mil con un ago calibro 31 per prelevare il volume appropriato di nanobarre d'oro in base a ciascun volume tumorale.

Prima dell'iniezione di nanobarre d'oro, anestetizzare il topo utilizzando un cono nasale che eroga il 2% di isoflurano a una velocità di flusso di 0,8 litri al minuto. Applicare lubrificante per gli occhi su entrambi gli occhi per prevenire la secchezza e ridurre al minimo eventuali danni al laser. Se necessario, radere il pelo in eccesso attorno al tumore per garantire l'esposizione della superficie della pelle e utilizzare l'etanolo per disinfettare la superficie del tumore, rimuovendo il pelo o i detriti.

Prima dell'esposizione al laser, iniettare nanobarre d'oro per via intratumorale a una concentrazione di un microgrammo per millimetro cubo di volume tumorale. Se necessario, suddividere l'iniezione tra due siti intratumorali per garantire un'efficiente distribuzione delle nanobarre d'oro all'interno del tumore. Assicurarsi di rimuovere le nanobacchette dorate in eccesso sulla superficie della pelle dopo l'iniezione.

Per i topi del gruppo di controllo, somministrare un'iniezione intratumorale di PBS sterile del volume equivalente utilizzato per i gruppi di trattamento con nanorod d'oro. Pulire la sonda di temperatura intratumorale con etanolo prima dell'inserimento. Inserire delicatamente la sonda di temperatura al centro della massa tumorale.

Applicare uno strato uniforme di gel di aloe vera di circa cinque millimetri di spessore sulla superficie del tumore per prevenire l'ulcerazione della pelle e ridurre al minimo il rischio di lesioni termiche durante il trattamento. Regola il laser in modo che si allinei direttamente sopra il centro del tumore. Utilizzare la tabella di ricerca dell'irraggiamento per determinare la migliore altezza del laser in base al diametro del raggio laser richiesto per coprire l'area della superficie del tumore.

Accendere il laser e la sorgente di raffreddamento termoelettrica. Quindi collegare il sistema laser alla fonte di alimentazione. Accendere la fonte di raffreddamento termoelettrica.

La luce LED blu si accenderà e dopo 30 secondi la temperatura si stabilizzerà a 25 gradi Celsius. In base alla tabella di ricerca dell'irraggiamento, regolare l'uscita della corrente laser per ottenere un obiettivo di irradianza di circa un watt per centimetro quadrato. Nel nostro esperimento, un'altezza del laser di 1,5 centimetri, un diametro del raggio di 1,3 centimetri e una corrente laser di 1800 milliampere hanno portato a un valore di irradianza di 0,82 watt per centimetro quadrato, che è stato ottimizzato per il nostro modello di tumore.

Da questo punto in poi, assicurarsi che tutte le persone nella sala operatoria laser indossino occhiali di sicurezza laser certificati per la lunghezza d'onda della luce utilizzata. Installare una termocamera adiacente alla piattaforma laser diretta verso il mouse per monitorare la temperatura della superficie della pelle durante la procedura laser. Iniziate la registrazione sul software di registrazione dati termoaccoppiato e assicuratevi che il grafico interno della temperatura del tumore rispetto al tempo venga visualizzato in tempo reale.

Ruotare la chiave di sicurezza laser per abilitare l'uscita della sorgente. Iniziare la somministrazione del laser premendo verso il basso il pedale All'avvio del laser, la temperatura interna del tumore inizierà ad aumentare, impiegando da circa 15 secondi a due minuti per entrare nell'intervallo ipertermico target da 42 a 48 gradi. Se la temperatura interna del tumore si avvicina a 48 gradi, togli il piede dal pedale, lasciando che la temperatura scenda di nuovo.

Questo calo della temperatura dovrebbe diventare visibile in tempo reale sul grafico di visualizzazione della temperatura rispetto al tempo. Una volta che la temperatura interna del tumore è scesa a circa 43 gradi, riattivare la somministrazione del laser utilizzando il pedale. La temperatura dovrebbe ricominciare a salire senza scendere al di fuori dell'intervallo ipertermico.

Continuare l'operazione con il ciclo di spegnimento del laser per assicurarsi che il tumore rimanga nel raggio ipertermico. Il grafico di visualizzazione della temperatura rispetto al tempo dovrebbe iniziare a riflettere questo modello di ciclo di spegnimento del laser. Durante il mantenimento dell'ipertermia tumorale, monitorare continuamente la temperatura superficiale della pelle per assicurarsi che rimanga al di sotto dei 50 gradi Celsius.

Dopo cinque minuti di mantenimento dell'ipertermia, rilasciare il pedale per interrompere la somministrazione del laser e consentire alla temperatura interna del tumore di scendere a circa 37 gradi Celsius. Una volta che il tumore è tornato a una temperatura normale, rimuovere la sonda di monitoraggio della temperatura e rimuovere l'eccesso di gel di aloe vera sulla superficie del tumore. Rimuovere il mouse dall'anestetico del cono del naso e monitorare l'eccitazione dell'animale prima di tornare nella gabbia Per il recupero dopo la procedura, posizionare la gabbia parzialmente su un termoforo come mostrato qui.

Assicurati che i topi siano tornati al comportamento normale prima di riportarli nella loro struttura abitativa. Questa tabella fornisce i valori di irraggiamento in watt per centimetro quadrato per diverse impostazioni di uscita della corrente laser in milliampere e distanze di lavoro in centimetri. Questa tabella viene utilizzata per determinare l'altezza del laser appropriata in base al diametro del raggio richiesto per coprire la superficie tumorale e per ottenere un'irradianza target di circa un watt per centimetro quadrato.

I valori evidenziati in verde in questa tabella indicano livelli di irraggiamento ottimali vicini a un watt per centimetro quadrato. Questa figura mostra i profili rappresentativi della temperatura interna del tumore nel tempo in millisecondi registrati dalla sonda interna della temperatura del tumore durante l'esposizione del tumore alla luce del vicino infrarosso. La Figura A mostra il modello di ciclo del laser on off in un topo iniettato con nanorod d'oro necessario per mantenere la temperatura interna del tumore nell'intervallo ipertermico.

Evidenzia l'importanza di un attento monitoraggio della temperatura interna del tumore e dei cicli di somministrazione del laser per mantenere la gamma ipertermica durante tutta la procedura. La Figura B mostra la differenza media nella temperatura interna del tumore tra l'oro nanarod iniettato e i topi di controllo, o PBS iniettati, durante i cinque minuti di esposizione alla luce del vicino infrarosso. Senza l'iniezione di nanobarre d'oro, i tumori esposti alla luce del vicino infrarosso non si riscalderanno in un lieve intervallo ipertermico.

I tumori iniettati con PBS si stabilizzano intorno ai 39-40 gradi Celsius in contrasto con i tumori iniettati con nanobarre d'oro che raggiungono temperature ipertermiche da 42 a 48 gradi. La nostra terapia ipertermica mirata mediata da nanobarre d'oro induce una riduzione del volume tumorale in più modelli di cancro speculari entro 48-72 ore dal trattamento. La Figura A mostra le misurazioni del volume del tumore in 4T1, un modello di cancro al seno dopo una terapia ipertermica mirata mediata da nanobarre d'oro.

La figura B mostra B16 F10, un modello di melanoma, e la figura C mostra CT26, un modello di cancro del colon-retto. Una riduzione o un rallentamento della crescita del volume del tumore entro 48-72 ore dal trattamento è indicativa di un risultato positivo. Quando si esegue questo protocollo, il monitoraggio accurato in tempo reale della temperatura interna del tumore è fondamentale per garantire il raggiungimento di un intervallo ipertermico lieve e che il trattamento venga erogato in modo coerente.

Dopo questa procedura, è necessario eseguire misurazioni giornaliere del volume del tumore per registrare le variazioni del volume del tumore. La regressione del tumore entro due o tre giorni è un indicatore positivo del successo del trattamento.